專利名稱：人源抗狂犬病毒中和抗體Fab及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于免疫學或分子生物學技術領域，涉及利用基因重組技術，對人源抗狂 犬病毒scFv抗體進行改造，得到一種抗狂犬病毒的中和抗體Fab分子，用于狂犬病的診斷 和治療。
背景技術：
抗體的研究最早是在血清學和氨基酸水平上開展的，異源性鼠抗體在人體內誘生 免疫應答，產生抗小鼠抗體；人單克隆雜交瘤制備困難，生產量少，穩(wěn)定性差；獲得特異性 類別抗體比較困難。隨著分子生物學技術的發(fā)展，對抗體基因的研究和DNA分子重組技術 的應用，使得抗體的研究從細胞水平進入到分子水平，通過基因改造獲得特異性抗體成為 可能。 當前，治療性抗體藥物研發(fā)已成為生物技術藥物領域的熱點，抗體藥物小型化和 高效化也是時下的研究重點?？贵wFab片段由重鏈Fd段和完整的輕鏈組成，是完整抗體分 子的三分之一，屬于小分子抗體，具有穿透力強，半衰期短，較scFv更加穩(wěn)定的優(yōu)勢，尤其 適用于人體疾病的診療。 狂犬病治療是一個世界性的醫(yī)學難題，人類一旦發(fā)病，死亡率幾乎是100%。中和 抗體因其能夠與血液中的狂犬病毒相結合，阻止病毒感染神經細胞，協(xié)助清除病毒顆粒，從 而抑制狂犬病毒在組織中的擴散。狂犬病毒糖蛋白(G蛋白)是誘導產生抗病毒免疫保護 的一種主要抗原，同時也是誘導產生病毒中和抗體并與之反應的唯一抗原。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明通過噬菌體抗體展示技術篩選出一株高親和力的針對G蛋白 的人源抗狂犬病毒抗體scFv，運用基因重組技術，將scFv的重鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)同人 IgGl的CH1， C A進行重組，擴增Fab片段。構建人源Fab抗體片段的原核表達質粒并進行 可溶性表達，建立了表達蛋白的純化方法，獲得了高純度的具有中和活性的可溶性蛋白，在 狂犬病的診療藥物中具有潛在的應用前景。 技術方案一種人源抗狂犬病毒中和抗體Fab，所述抗體的VH鏈的互補決定區(qū)CDR 具有以下的CDR氨基酸序列SEQ ID NO. 1所示的CDR1 ;SEQ ID NO. 2所示的CDR2 ;SEQ ID NO. 3所示的CDR3 ;并且所述抗體的、鏈的互補決定區(qū)CDR具有以下的CDR氨基酸序列 SEQ ID NO. 5所示的CDR5 ;SEQ ID NO. 6所示的CDR6 ;SEQ ID NO. 7所示的CDR7。所述抗 體的VH鏈具有如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列，、鏈具有如SEQ ID NO. 8所示的氨基酸 序列。 一種人源抗狂犬病毒中和抗體Fab，所述抗體Fd鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所 示，抗體L鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示。 一種DNA分子，編碼人源抗狂犬病毒中 和抗體Fab氨基酸序列。 一種DNA分子，如SEQ ID NO. 11所示編碼人源抗狂犬病毒中和抗 體Fab Fd鏈的氨基酸序列氨基酸序列，如SEQ ID NO. 12所示編碼人源抗狂犬病毒中和抗 體Fab L鏈的氨基酸序列氨基酸序列。 一種藥物組合物，含有上述任一條所述的單克隆抗
3體和藥學上可接受的載體。 有益效果本發(fā)明是利用基因重組技術對一株人源的抗狂犬病毒抗體ScFv進行 改造，即將scFv的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)分別和人Ig&抗體的CHI和片段重組，再 通過重疊延伸PCR擴增到一個全長為1. 6kb左右的抗狂犬病毒Fab抗體片段的核苷酸片段 Fab抗體片段的核苷酸片段和原核表達質粒pComb3XSS分別用Sf il限制性內切酶酶切后進 行連接，構建嵌合Fab片段的原核表達載體，轉入大腸桿菌T0P10F'后誘導表達Fab抗體片 段，其中Fd段分子量約為34KD，嵌合L鏈分子量約為26KD，兩者通過鏈間二硫鍵連接組成 人源抗狂犬病毒抗體Fab分子。該蛋白在用于狂犬病診療藥物中具有潛在的應用前景。


圖1 :人源抗狂犬病單克隆抗體VH， 、， Fd， L鏈和Fab基因的PCR擴增產物電泳； 1 :DNA Marker (TaKaRa， DL2000) 2-6 :依次為VH， VL， Fd， L鏈和Fab基因的PCR擴增產物
圖2 :以pComb3X A為模板擴增的人IgGl的輕鏈恒定區(qū)及重鏈恒定區(qū)1片段電泳 結果;1 :DNA Marker (TaKaRa， DL2000) 2 :人C入的PCR擴增產物3 :人IgGl的CHI的PCR擴 增產物 圖3 :以純化的Fab為抗原，標記HRP的羊抗人Fab抗體的WB結果；1 :純化的Fab 片段2 :Protein Marker (fermatas， #0441) 圖4 :Fab純化蛋白SDS-PAGE電泳結果；1 :純化的Fab片段2 : ProteinMarker(fermatas， #0671) 圖5 :以狂犬病毒CTN為抗原，抗狂犬病毒抗體Fab分子為一抗的ELISA結果圖； 1-7 :倍比稀釋Fab (0. 2 g) 5 X至320 X ， 8 :陽性參照9 :陰性參照圖6 :以狂犬病毒CTN為 抗原，抗狂犬病毒抗體Fab分子為一抗的WB結果；1 :60KD大小處為狂犬病毒糖蛋白，26KD 大小處為狂犬病毒基質蛋白。2 :Protein Marker
圖7 :質譜圖?？袢《净|蛋白；
圖8 :狂犬病毒糖蛋白；
圖9 :質粒pComb3X A圖譜；
圖10 :質粒pComb3XSS圖譜。
具體實施例方式
實施例中如無特別說明，各物質濃度均為質量比濃度， 實施例1. l)Fab基因的擴增 噬菌體抗體展示技術進行抗體庫的篩選過程如下 (1)用滅活的狂犬病毒CTN(武漢生物制劑研究所饋贈)為抗原(5 g/mL)包被6
孔板，包被液為PBS (pH7. 4) ， fC包板過夜。 (2) PBS洗滌6孔板3次，每次5min。 (3)在6孔板中加滿2% BSA， 37"封閉2h。 (4)去除封閉液，加入擴增的噬菌體抗體，37t:孵育2h。 (5)去除未結合的噬菌體抗體，PBST緩沖液洗滌6孔板10次(第一輪洗滌10次，
4以后每輪洗滌20次)。 (6) lmg/mL胰蛋白酶500 yl加入6孔板，37"孵育30min，反復吹打，洗脫特異性 結合的噬菌體抗體。 (7) 500 ii 1洗脫液感染3. 5mL對數(shù)生長期E. coli TG1， 37。C水浴30min。
(8)滴定洗脫噬菌體的數(shù)量 a.取上一步菌液40 iU加入360 iU 2 X TY培養(yǎng)基，充分混勻。
b.取a液4 iil加入396 ill 2 X TY培養(yǎng)基，充分混勻。
c.取b液4 ill加入396 ill 2 X TY培養(yǎng)基，充分混勻。
d.取c液4 ill加入396 ill 2 X TY培養(yǎng)基，充分混勻。 e.將b、 c、 d液各取100 ii 1鋪于TYE培養(yǎng)板上(含終濃度100 ii g/mL Amp) ， 37°C 培養(yǎng)過夜。 (9)將過夜培養(yǎng)的菌液以lOOOOg離心5min，去上清，沉淀用lmL 2XTY培養(yǎng)基重 懸，混勻后鋪于TYE培養(yǎng)板上，37。C培養(yǎng)過夜。 (10)次日，TYE培養(yǎng)板上加入2mL 2XTY培養(yǎng)基(含終濃度15wt^甘油)，用玻璃 推子輕刮下所有菌落，混勻。 (11)取50 iil菌液加入50mL 2XTY培養(yǎng)基(含終濃度100 y g/mL Amp+lwt^葡 萄糖)，250rpm， 37"振搖培養(yǎng)至0D6。。 約為0. 4。其余菌液加入終濃度15%甘油，-7(TC保存。 (12)從50mL 2XTY培養(yǎng)基中取10mL，加入5X 1(Tpfu輔助噬菌體KM13， 37。C水 浴30min。 (13)3300g離心30min，去上清，沉淀用50mL 2XTY培養(yǎng)基(含終濃度100 y g/ mLAmp+50 ii g/mL Kana+O. 1%葡萄糖)重懸，250rpm， 30。C振搖培養(yǎng)過夜。
(14)3300g離心15min，收集上清約40mL，加入10mL PEG/Nacl溶液，混勻后置于冰 上lh。 (15) 3300g離心30min，沉淀用2mL PBS重懸，充分混勻。 (16) 10800g離心10min，取上清約2mL。參照方法2 (7)，滴定加入噬菌體的數(shù)量， lmL上清用于下一輪篩選，剩余約lmL上清置于fC保存。 (17)重復以上篩選步驟，共進行五輪"吸附_洗脫_擴增"富集篩選并經ELISA鑒 定。 篩選獲得的scFv的DNA序列如下
①VH的核苷酸序列為 GAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGA TCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCGATTAATCGTT CAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC CGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAAAGACGCGGCGTTTTGACTA CTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC VH對應的氨基酸序列為
ELLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSINRSGD ITTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKKTRRFDYWGQG TLVTVSS 下劃線部分為三個CDR區(qū)。 ②、的核苷酸序列為 CTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGA GGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCT GCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
、對應的氨基酸序列為
GNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGDYTPGVVFGGGTKLTVL
下劃線部分為三個CDR區(qū) 以scFv基因為模板，用一組擴增人源抗體的上游引物和下游引物擴增Fab的重 鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因。VH的上游引物是VHF :5'-GCT GCC CAA CCAGCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG_3，，下游引物為VHR :5，-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGTTCC_3'。在V/的5'端引入了和人IgGl的C A下游引物互補 的21個堿基序列即斜體部分序列，VHR的5'端引入了和人IgGl的CHI上游引物互補的 21個堿基序列，即斜體部分，以利于抗狂犬病毒抗體的VH與人IgGl的CHI片段的重疊PCR 擴增。VL的上游引物為VLF :5'-GGG CCC AGG CGG CCC AGT CTGCCC TGA CTC AGC CTC GCT CAG TGT CCG GG_3，，下游引物為VLR :5，-CGAGGG GGC AGC CTT GGG CTG ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC TCCGCC GAA AAC CAC-3'，在VJ7的5'端引入了 Sfil的酶切識別位點即 下劃線部分序列，、R的5'端引入了與人的C A上游引物5'端互補的21個堿基即斜體部 分序列，以、與人IgGl的C A片段的重疊PCR擴增擴增條件為94t:變性30s — 6(TC退火 30s — 72t:延伸60s，共循環(huán)25次。PCR產物經瓊脂糖電泳鑒定后，過DNA純化柱純化(圖 1)。 (1)人IgGl抗體的CHI和C A段的擴增 以質粒pComb3X入(由scripps institute饋貝曾，圖9)為 模板，分別擴增人IgGl抗體的和CHI核苷酸片段；CA段的上 游弓l 物為C入F:5 ' _CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC_3 '， 下游弓| 物 為C入R:5 ' -GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3 ' ;CH1的上游引物為CH1F : 5' -GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3'，下游引物為CH1R :AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'。擴 增條件均為95°C 4分鐘；94。C 30秒，60。C 30秒，72。C 60秒，25個循環(huán)；72。C延伸10分鐘， 瓊脂糖凝膠電泳，分別擴增出約350bp的條帶(見圖2)，膠回收純化擴增條帶，溶于去離子 水內，-2(TC凍存?zhèn)溆茫?
(2)L鏈、Fd段基因片段的擴增
以擴增的人源抗狂犬病毒抗體的、及人IgGl抗體的C A的PCR擴增產物為模板， 用上游引物LF : 5 ' -GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTGATGACACAGTC-3 '和下游引物LR : 5' -GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC-3 '進行重疊延伸PCR擴增L鏈，擴增條件為95°C ， 4分鐘； 94°C， 15秒、56t:， 15秒、72t:，2分鐘，15個循環(huán)；72。C，延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳，擴 增出約750bp的條帶(見圖1)，膠回收擴增條帶，溶于去離子水內，-2(TC凍存?zhèn)溆谩?
以擴增的人源抗狂犬病毒抗體的Vh及人IgGl抗體的CH1的PCR擴增產物為模板， 用上游引物FdF : 5' -GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCTCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3'和下游弓|物 FdR :5' -AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'進行重疊延伸PCR擴增Fd片段，擴增條件為95°C ， 4分鐘；94°C ， 15秒、56t: ， 15秒、72。C ， 30秒，15個循環(huán)；72°C ，延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電 泳，擴增出約750bp的條帶(見圖1)，膠回收擴增條帶，溶于去離子水內，-2(TC凍存?zhèn)溆谩?
(3)Fab基因片段的擴增 以擴增獲得的Fd段和L鏈核苷酸序列的膠回收純化產物為模板，用上游引 物FabF :5 ' -GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTGATGACACAGTC-3 ' 和下游弓|物FabR : 5' -AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3 '進行重疊延伸PCR擴增，擴增時，先不加引物，94°C 4分 鐘；94°C 50秒、56t: 50秒、72。C 3分鐘，6個循環(huán)；而后加入FabF、FabR引物后94°C 50秒、 56°C 50秒、72t: 2分鐘，20個循環(huán)；72。C延伸10分鐘，瓊脂糖凝膠電泳擴增出約1. 6kb的 條帶(見圖1)，膠回收純化擴增條帶，溶于去離子水內，-2(TC凍存?zhèn)溆谩?
3) Fab原核表達載體的構建和鑒定 提取質粒pComb3XSS(由scri卯s institute饋贈，圖10)，質粒及Fab片段的PCR 膠回收產物用Sfil限制性內切酶在5(TC酶切12-16h，電泳后膠回收酶切的質粒大片段，溶 于去離子水中。取pComb3XSS、Fab擴增產物的酶切產物按1 :4摩爾比混勻，在同一離心管 內用T4連接酶16。C連接12-16h。 將連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌T0P10F'，涂布含氨芐青霉素(100 y g/mL) LB平 板，置37t: 12-16h。次日隨機挑取轉化菌及空質粒轉化對照菌，37t:搖菌3.5小時后，分 別用Fab的特異引物對對菌液進行PCR擴增鑒定，含有插入Fab片段質粒的菌株擴增出一 條約1. 6kb左右的條帶。菌液PCR驗證擴增出大小正確條帶的菌液送生物公司進行測序， DNA序列分析證實在重組質粒中含有構建的嵌合Fab片段，序列正確，其中橫線部分為前導 序列pelB，方框內TAA為L鏈翻譯終止密碼子(1615bp)
CGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTC .ItaaI1 TTCTAGATAATTAATTAGGAG
CCTCCTCCTCAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG 將含有正確重組質粒的菌液按1 : 100轉入2mL LB溶液中，氨芐青霉素工作濃度 為100 ii g/mL， 37。C搖菌過夜；過夜的細菌lOOOOg離心15分鐘，棄去上清液，而后用2mL SB 重懸，將重懸后的菌液按1 : 100轉入2mLLB中(氨芐青霉素終濃度為100 y g/mL) ， 37。C培 養(yǎng)0D600 = 1. O左右，加入異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為lmmol/L， 25。C振 蕩培養(yǎng)20h。離心收集菌體，分別處理培養(yǎng)上清、菌體超聲上清及超聲沉淀，進行SDS-PAGE 及western-blot檢測，結果Fab片段在菌體超聲上清及超聲沉淀中均有表達，其中可溶性 蛋白存在于菌體超聲上清中，F(xiàn)d段分子量約為34KD， L段分子量約為26KD。
4)表達蛋白的純化 細菌大量誘導表達后菌液lOOOOg離心15分鐘，棄培養(yǎng)上清，沉淀中加入原菌液 1/10體積的20mM磷酸鹽平衡緩沖液(含0. 5M/L NaCl， 10mM咪唑)，將細菌重懸；而后對 菌液進行超聲，超5秒，停5秒，共超40分鐘，而后4°C 12000rpm離心30分鐘，棄沉淀，超 聲上清用0. 22 m濾膜過濾，然后用lmLHistr即HP柱子進行純化。先用用5倍柱體積 的水以lmL/min的速度洗柱子，而后用至少10倍柱體積的平衡緩沖液平衡柱子，然后以 lmL/min的速度上樣；用平衡緩沖液平衡鎳柱至基線，分別用5倍柱體積的含50mM、100mM、 200mM、 300mM、 400mM、 500mM咪唑的緩沖液洗柱子，并收集相應濃度咪唑的洗脫液，進行 12% SDS-PAGE電泳及Western blot，觀察蛋白純化情況(見圖3，4)。結果含lOOmM咪唑 的洗脫液中見純化的Fab蛋白，用10KD的millpore超濾柱子進行除鹽濃縮，PBS洗3次。
實施例2Fab抗體片段的活性鑒定
I酶聯(lián)免疫法 用包被液(0. 1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)稀釋狂犬病毒CTN(武漢生物制劑研究 所饋贈)至2ii g/mL包被ELISA 96孔板，每孔加入50 yl， 4 °C過夜；PBST(PBS含0. 5 % Tween20) 5% BSA洗滌緩沖液封閉，37。C孵育2h ;PBST洗滌5次后，每個孔中加入50 抗狂犬病毒Fab分子(200 g/mL起始濃度，7個濃度梯度稀釋)4"C過夜；以1 : 2000稀釋的 羊抗人Fab 二抗50iil/孔加入到孔內，37t:孵育30分鐘；過氧化物酶底物顯色液50 yl/ 孑L室溫下15分鐘后用2M硫酸中止反應，上機檢測比色采用雙波長450nm/630nm。結果如 圖5示，F(xiàn)ab抗體片段能與狂犬病毒CTN起抗原抗體反應。
II免疫印跡法 取20iU狂犬病毒CTN進行SDS page,并電轉到硝酸纖維膜上，用5wt%的脫脂奶
粉封4t:閉過夜，純化的Fab 1 : 100稀釋作為一抗室溫至于脫色搖床上2h，1 : 2000稀釋
的HRP標記的羊抗人IgGFab作為二抗，室溫至于脫色搖床上2h。 DAB顯色?？梢娪袃蓷l清
晰的條帶大小分別為24KD，60KD左右(圖6) 。 MS質譜指紋分析結果顯示(圖7 8) :24KD
大小處對應的為狂犬病毒屬基質蛋白，60KD大小處對應的是狂犬病毒屬糖蛋白。 以上結果顯示制備的人源抗狂犬病毒抗體Fab能夠特異地與狂犬病毒結合，并具
有較高的中和活性。 本發(fā)明與以往技術相比有以下優(yōu)點 (1)全人源抗體克服了鼠源抗體的HAMA反應和過敏反應。 (2)小分子抗體Fab較scFv具有更長的半衰期，穩(wěn)定性更強。 (3)原核表達載體易于構建，可大量表達，生產快速且便于純化。 (4)具有中和活性的Fab，能夠進一步改造為全分子IgG，可用于人類狂犬病的臨
床治療的研究。
實施例3: 狂犬病熒光抗體病毒中和試驗(FAVN) Fab按31，32，33， 312進行稀釋；加入100TCID5。的CVS-11在37。C濕化培養(yǎng)箱 (5% C02)感作60min ;然后加入BHK-21細胞，培養(yǎng)48h ;丙酮固定細胞后，加熒光標記抗狂 犬病毒抗體染色，熒光顯微鏡下讀取結果。以100TCID5。CVS-11的復制完全被抑制(即沒有 一個熒光細胞)作為最終抑制效價判定結果，以0. 5IU/mL作為狂犬病最低保護單位，制備 的Fab中和效價約為10. 26IU/mL，顯示中和抗體陽性。
序列表 〈110〉中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所 〈120〉人源抗狂犬病毒中和抗體Fab及其制備方法和應用 〈130〉 〈141>2009-10-09 〈160>12 〈170>PatentIn version 3.3 〈210>1 〈211>8 〈212>PRT 〈213>人工序列 〈400〉 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
〈210>20138]〈211>8
0139]〈212>PRT
0140]〈213〉人工序列
0141]〈400>2
0142]lie Asn Arg Ser Gly Asp lie
0143]〈210>3
0144]〈211>9
0145]〈212>PRT
0146]〈213〉人工序列
0147]〈400>3
0148]Ala Lys Lys Thr Arg Arg Phe
0149]〈210>4
0150]〈211>114
0151]〈212>PRT
0152]〈213〉人工序列
0153]〈400>4
0154]Glu Leu Leu Glu Ser Gly Gly
0155]Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
0156]Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro
0157]lie Asn Arg Ser Gly Asp lie
0158]Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp
0159]Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
0160]Lys Thr Arg Arg Phe Asp Tyr
0161]Ser Ser
0162]〈210>5
0163]〈211>9
0164]〈212>PRT
0165]〈213〉人工序列
0166]〈400>5
0167]Ser Ser Asp lie Gly Gly Tyr
0168]〈210>6
0169]〈211>3
0170]〈212>PRT
0171]〈213〉人工序列
0172]〈400>6
0173]Asp Ala Thr
0174]〈210>7
0175]〈211>12
0176]〈212>PRT
Thr
Asp Tyr
GlyLeuValGinProGlyGlySerLeu
GlyPheThrPheSerSerTyrAlaMet
GlyLysGlyLeuGluTrpValSerSer
ThrThrTyrAlaAspSerValLysGly
AsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGin
AspThrAlaValTyrTyrCysAlaLys
TrpGlyGinGlyThrLeuValThrVal
Asn Phe0177]〈213〉人工序列0178]〈400>7
0179]Cys Ser Tyr Ala Gly Asp Tyr0180]〈210>8
0181]〈211>112
0182]〈212>PRT
0183]〈213〉人工序列0184]〈400>8
0185]GluSerAlaLeu Thr Gin Pro
0186]SerValThrlie Ser Cys Thr
0187]AsnPheValSer Trp Tyr Gin
0188]MetlieTyrAsp Ala Thr Lys
0189]SerGlySerLys Ser Gly Asn
0190]GinAlaGluAsp Glu Ala Asp
0191]TyrThrProGly Val Val Phe
0192]〈210>9
0193]〈211>226
0194]〈212>PRT
0195]〈213〉人工序列0196]〈400>9
0197]GluLeuLeuGlu Ser Gly Gly
0198]ArgLeuSerCys Ala Ala Ser
0199]SerTrpValArg Gin Ala Pro
0200]lieAsnArgSer Gly Asp lie
0201]ArgPheThrlie Ser Arg Asp
0202]MetAsnSerLeu Arg Ala Glu
0203]LysThrArgArg Phe Asp Tyr
0204]SerSerAlaSer Thr Lys Gly
0205]SerLysSerThr Ser Gly Gly
0206]AspTyrPhePro Glu Pro Val
0207]ThrSerGlyVal His Thr Phe
0208]TyrSerLeuSer Ser Val Val
0209]GinThrTyrlie Cys Asn Val
0210]AspLysLysVal Glu Pro Lys
0211]GlyGin
0212]〈210>10
0213]〈211>218
0214]〈212>PRT
0215]〈213〉人工序列ThrProGlyValVal
ArgSerValSerGlySerProGlyGin
GlyThrSerSerAsplieGlyGlyTyr
GinHisProGlyLysAlaProLysLeu
ArgProSerGlyValProAspArgPhe
ThrAlaSerLeuThrlieSerGlyLeu
TyrTyrCysCysSerTyrAlaGlyAsp
GlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeu
GlyLeuValGinProGlyGlySerLeu
GlyPheThrPheSerSerTyrAlaMet
GlyLysGlyLeuGluTrpValSerSer
ThrThrTyrAlaAspSerValLysGly
AsnSerLysAsnThrLeuTyrLeuGin
AspThrAlaValTyrTyrCysAlaLys
TrpGlyGinGlyThrLeuValThrVal
ProSerValPheProLeuAlaProSer
ThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys
ThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeu
ProAlaValLeuGinSerSerGlyLeu
ThrValProSerSerSerLeuGlyThr
AsnHisLysProSerAsnThrLysVal
SerCysAspLysThrSerGlyGinAla
11
〈400>10GluSerAlaLeuThrGinProArgSerValSerGlySerProGlyGinSerValThrlieSerCysThrGlyThrSerSerAsplieGlyGlyTyrAsnPheValSerTrpTyrGinGinHisProGlyLysAlaProLysLeuMetlieTyrAspAlaThrLysArgProSerGlyValProAspArgPheSerGlySerLysSerGlyAsnThrAlaSerLeuThrlieSerGlyLeuGinAlaGluAspGluAlaAspTyrTyrCysCysSerTyrAlaGlyAspTyrThrProGlyValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGlyGinProLysAlaAlaProSerValThrLeuPheProProSerSerGluGluLeuGinAlaAsnLysAlaThrLeuValCysLeulieSerAspPheTyrProGlyAlaValThrValAlaTrpLysAlaAspGlySerProValLysAlaGlyValGluThrThrThrProSerLysGinSerAsnAsnLysTyrAlaAlaSerSerTyrLeuSerLeuThrProGluGinTrpLysSerHisArgSerTyrSerCysGinValThrHisGluGlySerThrValGluLysThrValAlaProThrGluCysSer 〈210>11 〈211>678 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 11 1 GAGCTGTTGG 61 GCAGCCTCTG 121 AAGGGGCTGG 181 TCCGTGAAGG 241 ATGAACAGCC 301 TTTGACTACT 361 TCGGTCTTCC 421 TGCCTGGTTA 481 ACCAGCGGCG 541 AGCGTGGTGA 601 CACAAGCCCA 661 AGTGGCCAGG 〈210>12 〈211>654 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈400>12 1 GAGTCTGCCC 61 TCCTGCACTG
AGTCTGGGGG GATTCACCTT AGTGGGTCTC GCAGGTTCAC TGAGAGCCGA GGGGCCAGGG CCCTGGCACC AGGACTACTT TGCACACCTT CCGTGCCCTC GCAACACCAA CCGGCCAG
AGGCTTGGTA TAGCAGCTAT ATCGATTAAT CATCTCCAGA GGACACGGCC AACCCTGGTC CTCCTCCAAG CCCCGAACCG CCCGGCTGTC CAGCAGCTTG GGTGGACAAG
CAGCCTGGGG GCCATGAGCT CGTTCTGGTG GACAATTCCA GTATATTACT ACCGTCTCGA AGCACCTCTG GTGACGGTGT CTACAGTCCT GGCACCCAGA AAAGTTGAGC
GGTCCCTGAG GGGTCCGCCA ATATTACAAC AGAACACGCT GTGCGAAAAA GCGCCTCCAC GGGGCACAGC CGTGGAACTC CAGGACTCTA CCTACATCTG CCAAATCTTG
ACTCTCCTGT GGCTCCAGGG GTACGCAGAC GTATCTGCAA GACGCGGCGT CAAGGGCCCA GGCCCTGGGC AGGCGCCCTG CTCCCTCAGC CAACGTGAAT TGACAAAACT
TGACTCAGCC GAACCAGCAG
TCGCTCAGTG TGATATTGGT
TCCGGGTCTC GGTTATAACT
CTGGACAGTC AGTCACCATC TTGTCTCCTG GTACCAACAA
121CACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGCCACTAAGCGGCCCTCAGGGGTC181CCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTC241CAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCTGCTCATATGCAGGCGACTACACCCCGGGC301GTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCG361GTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGT421CTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATGGCAGCCCC481GTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCC541AGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAG601GTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
權利要求
一種人源抗狂犬病毒中和抗體Fab，其特征在于，所述抗體的VH鏈的互補決定區(qū)CDR具有以下的CDR氨基酸序列SEQ IDNO.1所示的CDR1；SEQ ID NO.2所示的CDR2；SEQ ID NO.3所示的CDR3；并且所述抗體的VL鏈的互補決定區(qū)CDR具有以下的CDR氨基酸序列SEQ ID NO.5所示的CDR5；SEQ ID NO.6所示的CDR6；SEQ ID NO.7所示的CDR7。
2. 根據(jù)權利要求l所述的人源抗狂犬病毒中和抗體Fab，其特征在于，所述抗體的VH鏈 具有如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列，、鏈具有如SEQID NO. 8所示的氨基酸序列。
3. —種人源抗狂犬病毒中和抗體Fab，其特征在于，所述抗體Fd鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示，抗體L鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
4. 一種DNA分子，其特征在于，編碼權利要求1所述人源抗狂犬病毒中和抗體Fab氨基 酸序列。
5. —種DNA分子，其特征在于，編碼權利要求2所述人源抗狂犬病毒中和抗體Fab氨基 酸序列。
6. —種DNA分子，其特征在于，如SEQ ID NO. 11所示編碼權利要求3所述人源抗狂犬 病毒中和抗體Fab Fd鏈的氨基酸序列氨基酸序列，如SEQID NO. 12所示編碼權利要求3所 述人源抗狂犬病毒中和抗體Fab L鏈的氨基酸序列氨基酸序列。
7. —種藥物組合物，其特征在于含有上述權利要求任一條所述的單克隆抗體和藥學上 可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明通過噬菌體抗體展示技術篩選出一株高親和力的針對G蛋白的人源抗狂犬病毒抗體scFv，運用基因重組技術，將scFv的重鏈可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)同人IgG1的CH1，Cλ進行重組，擴增Fab片段。構建人源Fab抗體片段的原核表達質粒并進行可溶性表達，建立了表達蛋白的純化方法，獲得了高純度的具有中和活性的可溶性蛋白，在狂犬病的診療藥物中具有潛在的應用前景。
文檔編號C12N15/13GK101696242SQ200910180629
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月26日 優(yōu)先權日2009年10月26日
發(fā)明者朱進, 李琛 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學研究所;