一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的elisa試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及動(dòng)物疫病診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體的講是一種用于檢測(cè)羊的偽狂犬病毒抗體ELISA試劑盒，本發(fā)明提供的ELISA試劑盒包括包被板、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、樣品稀釋液、酶標(biāo)結(jié)合物、20×濃縮洗滌液、底物液、終止液、封口膠、自封袋、使用說(shuō)明書(shū)，所述的試劑盒能快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)羊體內(nèi)的PRV抗體水平，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外該領(lǐng)域的空白。所述的試劑盒用以代替病毒中和試驗(yàn)等傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，用以實(shí)現(xiàn)敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的高通量大規(guī)模的羊體內(nèi)PRV抗體的檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物疫病診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種檢測(cè)羊的偽狂犬病毒抗體的間接ELISA試劑盒，以此對(duì)羊群的偽狂犬病毒抗體水平及疫病分布與流行情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

【背景技術(shù)】
[0002]偽狂犬病，亦稱(chēng)奧耶茲基氏病，簡(jiǎn)稱(chēng)PRV，是由皰疹病毒科的甲型皰疹病毒引起的。該病毒可感染人類(lèi)和無(wú)尾猿以外的所有哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其它器官，如呼吸道。該病可危害各階段的羊群，死亡率高達(dá)100%，臨床上以發(fā)熱、奇癢以及腦脊髓炎癥狀為特征。該病在世界范圍內(nèi)發(fā)生且廣泛流行，近年來(lái)隨著我國(guó)肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和羊頻繁流動(dòng)，本病給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]gD是PRV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，它不僅誘導(dǎo)體液免疫，而且誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，同時(shí)是病毒粒子表面的病毒感染細(xì)胞的主要分子，在病毒吸附和侵入宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為病毒復(fù)制的必需基因，是一種重要的中和抗原，也是保護(hù)性抗體的主要目標(biāo)，能誘導(dǎo)較好的保護(hù)反應(yīng)，抵抗PRV強(qiáng)毒株攻擊，因此gD被作為PRV特異性抗原研究的首選蛋白。
[0004]目前，一般采用病毒中和試驗(yàn)、乳膠凝集或ELISA方法檢測(cè)偽狂犬病毒的抗體。國(guó)內(nèi)外已有許多商品化的檢測(cè)試劑盒可供使用，但檢測(cè)對(duì)象多針對(duì)最為普遍和易感的豬。本發(fā)明應(yīng)用涉及針對(duì)羊建立的偽狂犬病毒抗體的ELISA檢測(cè)試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決問(wèn)題是建立一種檢測(cè)羊PRV抗體的ELISA試劑盒，用以代替病毒中和試驗(yàn)等傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，用以實(shí)現(xiàn)敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的高通量大規(guī)模的羊體內(nèi)PRV抗體水平的監(jiān)測(cè)。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，包括以下組分:包被板、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、酶標(biāo)結(jié)合物、樣品稀釋液、20 X濃縮洗滌液、底物液、終止液、封口膠。
[0007]上述酶標(biāo)結(jié)合物是由酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋2000倍的HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG (購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)每一試劑盒裝有I瓶體積為20ml的酶標(biāo)結(jié)合物，4°C保存；。
[0008]上述酶標(biāo)抗體稀釋液為NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.Iffi2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，甘油 20ml,小牛血清 200ml, Casein 5g,鹿糖 2g, Triton X-100 10ml,硫柳萊 0.lg,加純水定容至1L。
[0009]上述樣品稀釋液包括NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H20 2.9g，KH2P04 0.2g，吐溫-20 5ml，甘油10ml，小牛血清100ml，硫柳汞0.lg，加純水定容至1L。
[0010]上述包被板由偽狂犬病毒的重組gD蛋白作為包被抗原，并由封閉液封閉，所述封閉液為 NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPCM.12H20 2.9g,KH2P04 0.2g，小牛血清 100ml，蔗糖 50g,明膠lg，Casein 2.5g,硫柳萊0.lg,加純水定容至1L。
[0011]上述陰性對(duì)照:以樣品稀釋液將不含PRV抗體的陰性羊血清做40倍稀釋?zhuān)恳辉噭┖醒b有I只體積為Irnl的陰性對(duì)照，4°C保存；
上述陽(yáng)性對(duì)照:以樣品稀釋液將含PRV抗體的陽(yáng)性羊血清做100倍稀釋?zhuān)恳辉噭┖醒b有I只體積為Iml的陽(yáng)性對(duì)照，4°C保存。
[0012]上述重組gD蛋白的表達(dá)和純化包括如下步驟:
1)根據(jù)GenBank公布的登錄號(hào)為AY196984的PRVFa株的gD基因序列，設(shè)計(jì)引物序列如下:
Pl:5’ -GGGGAATTCTACCCGTACAC-3’
P2:5， -GGGCTCGAGCCTCAGGCGGA-3，
2)通過(guò)PCR擴(kuò)增PRVFa株gD基因，與pMD18_T克隆載體連接；
3)雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-gD，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET-32a-gD；
4)重組質(zhì)粒PET-32a-gD轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)，然后純化設(shè)備，親和柱進(jìn)行親和純化。
[0013]上述20 X 濃縮洗滌液為 NaCl 80g, KCl 2g，Na2HPO4.12H20 29g，KH2PO4 2g，吐溫-20 5ml，加純水定容至500ml。
[0014]上述終止液為IM H2SO4,4°C保存，所述底物液為可溶型單組分TMB底物液。
[0015]上述試劑盒還包括自封袋和使用說(shuō)明書(shū)。
[0016]上述一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒的使用方法，其特征在于，主要使用方法如下:
(1)在Al和A2孔中分別加入100μ I陰性對(duì)照；在A3和Α4孔中分別加入100 μ I陽(yáng)性對(duì)照；
(2)取100μ I經(jīng)1:40稀釋好的待檢樣品液加入相應(yīng)孔中，并做好記錄；37 °C孵育
Ih ；
(3)將各孔的液體棄入廢液桶，每孔加250μ I的洗滌液進(jìn)行洗板，重復(fù)5次，每次30s ；
(4)每孔加100μ I酶標(biāo)結(jié)合物；37 °C孵育Ih ；
(5)重復(fù)步驟(3)；
(6)每孔加100μ I底物液;
(7)37°C避光顯色孵育1min ；
(8)每孔加100μ I的終止液；立刻于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，即0D450nm
值；
(9)臨界值(C.0.)的計(jì)算；正常情況下，陽(yáng)性對(duì)照孔0D450值彡0.4 ;陰性對(duì)照孔0D450值< 0.2 ;臨界值=0.17+陰性對(duì)照孔均值；陰性對(duì)照孔0D450值大于0.2時(shí)應(yīng)舍棄，如所有陰性對(duì)照孔0D450值都大于0.2時(shí)須重復(fù)實(shí)驗(yàn)；陰性對(duì)照孔低于0.05時(shí)以0.05計(jì)算；
(10)結(jié)果判定；檢測(cè)樣品0D450值>臨界值，判定該檢測(cè)樣品為陽(yáng)性；檢測(cè)樣品0D450值< 臨界值，判定該檢測(cè)樣品為陰性。
[0017]封口膠:購(gòu)自商品化的精制不干膠紙，用以在試驗(yàn)中蓋住反應(yīng)的微孔板；
本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明中所述的包被抗原為基因工程方法表達(dá)的重組gD蛋白，
具有很強(qiáng)的特異性、敏感性，能真實(shí)準(zhǔn)確地反應(yīng)羊群中PRV的抗體水平。
[0018]本發(fā)明中所述的封閉液(NaCl8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H20 2.9g, KH2PO40.2g,小牛血清 10ml,鹿糖 50g,明膠 lg, Casein 2.5g,硫柳萊 0.lg,加純水至1L)，試驗(yàn)顯示PRV陰性對(duì)照及陰性血清OD值顯著降低，消除樣品中非特異性IgG結(jié)合微孔板底的干擾，較好的起到了封閉微孔板底空白位點(diǎn)的作用，4°C放置6個(gè)月穩(wěn)定不沉底不變質(zhì)。
[0019]本發(fā)明中所述的樣品稀釋液與PBS的比較試驗(yàn)顯示PRV陰性對(duì)照及陰性血清OD值顯著降低，與口蹄疫、布病、羊痘等的交叉反應(yīng)明顯減弱，較好的起到減少非特異性結(jié)合、消除假陽(yáng)性的作用，穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示4°C放置6個(gè)月穩(wěn)定不沉底不變質(zhì)；用樣品稀釋液稀釋成工作濃度的陽(yáng)性對(duì)照，加速破壞性試驗(yàn)顯示37°C烤9d OD值降低30%以?xún)?nèi)。
[0020]本發(fā)明中所用的酶標(biāo)抗體稀釋液(NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HP04.12H20 2.9g，KH2P04 0.2g，甘油 20ml，小牛血清 200ml，Casein 5g，蔗糖 2g，Triton X-10010ml，硫柳汞0.lg，加純水至1L)，用該稀釋液稀釋成工作濃度的酶標(biāo)結(jié)合物，穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示4°C放置6個(gè)月穩(wěn)定不沉底不變質(zhì)，加速破壞性試驗(yàn)顯示37°C烤9d靈敏度降低25%以?xún)?nèi)。
[0021 ] 綜上所述:本發(fā)明所述試劑盒專(zhuān)用于檢測(cè)羊體內(nèi)的PRV抗體水平，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外該領(lǐng)域的空白，而且本發(fā)明用以代替病毒中和試驗(yàn)等傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，從而實(shí)現(xiàn)敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的高通量大規(guī)模的羊體內(nèi)PRV抗體的檢測(cè)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為gD基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道I為DL15000 marker,泳道2、3為gD基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道4為DL2000 marker ；
圖2為重組質(zhì)粒pMD18-T-gD PCR及雙酶切酶切鑒定結(jié)果，泳道I為pMD18_T-gD PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道2為DL2000 marker,泳道3為pMD18_T_gD雙酶切結(jié)果，泳道4為DL15000marker ；
圖3為重組質(zhì)粒PET-32a-gD酶切鑒定結(jié)果，泳道I為DL15000 marker,泳道2為PET-32a-gD雙酶切結(jié)果，泳道3為PET_32a_gD單酶切結(jié)果，泳道4為DL2000 marker。

【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1:重組gD蛋白的表達(dá)及純化
1)引物設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)GenBank公布的登錄號(hào)為AY196984的PRV Fa株的gD基因序列，利用01igo6.0和Primer軟件設(shè)計(jì)一對(duì)gD基因的引物，分別引入EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段1059bp，引物序列如下:
Pl:5，-GGGGAATTCTACCCGTACAC-3，
P2:5， -GGGCTCGAGCCTCAGGCGGA-3，
2)PRV基因組DNA的提取
取PRV Fa株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)病毒液200μ 1，使用小量病毒DNA/RNA提取試劑盒(購(gòu)自美國(guó)AXYGEN公司)提取病毒DNA。
[0024]3 ) PCR擴(kuò)增PRV gD基因與克隆
以提取的PRV Fa株DNA為模板，加入設(shè)計(jì)的特異引物PCR擴(kuò)增gD目的基因；PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5 min,95°C I min,61°C I min,72°C 1.5 min，共進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10 min，4°C終止反應(yīng)。取PCR產(chǎn)物0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(見(jiàn)圖1 )，用PCR產(chǎn)物快速膠回收試劑盒回收純化。PCR純化產(chǎn)物與pMD18-T載體16°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5a )感受態(tài)細(xì)胞，雙酶切鑒定為陽(yáng)性重組質(zhì)粒PMD18-T_gD (見(jiàn)圖2)。
[0025]4) gD表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
取重組質(zhì)粒pMD18-T-gD EcoR I /Xho I雙酶切，回收目的片段，插入表達(dá)載體PET-32a中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5a )感受態(tài)細(xì)胞，雙酶切鑒定為陽(yáng)性重組質(zhì)粒PET_32a_gD。(見(jiàn)圖3)
5)重組gD蛋白的表達(dá)與分析
取重組質(zhì)粒PET-32a-gD轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑單菌落接種于含K+的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)6h。I %接種于含K+的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600?0.6，加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0禮。301:震蕩培養(yǎng)6h，離心收集菌體超聲破碎，10000 r/min離心lOmin，分別收集上清及沉淀，SDS-PAGE分析gD蛋白以包涵體形式表達(dá)。
[0026]6 )重組gD蛋白的純化
將包涵體形式的重組gD蛋白以0.22 μ m濾膜過(guò)濾，選用AKTA purifier 100(購(gòu)自美國(guó)通用電氣醫(yī)療集團(tuán))純化設(shè)備，親和柱HisTrap HP (購(gòu)自美國(guó)通用電氣醫(yī)療集團(tuán))進(jìn)行親和純化，SDS-PAGE分析蛋白純度，純化后gD蛋白透析復(fù)性_20°C貯存?zhèn)溆谩?br> [0027]實(shí)施例2:抗原包被板的制備
(I)包被緩沖液稀釋的gD負(fù)載于微孔板上
具體的，所述的包被方法包括0.05M pH 9.6碳酸緩沖液做包被液，向微孔板的每孔加入含gD的包被液0.lml，4°C過(guò)夜包被16h。
[0028](2)洗板
將各孔的液體棄入廢液桶，每孔加250 μ I的洗滌液(試劑盒內(nèi)20 X濃縮洗滌液需用蒸餾水或去離子水稀釋后方可使用。如有結(jié)晶，需先溶解后，方可進(jìn)行稀釋)進(jìn)行洗板，重復(fù)2次，每次30s ;最后拍干微孔板。
[0029](3)封閉
向微孔板的每孔加入0.13ml封閉液,室溫放置2.5h,把孔內(nèi)封閉液甩掉,最后拍干微孔板。
[0030](4)干燥
具體的，將微孔板放入恒溫恒濕箱，37°C放置40min。
[0031](5)包裝
具體的，將微孔板放入鋁箔袋，加防潮劑，真空包裝機(jī)封口 4°C保存。
[0032]實(shí)施例3:陽(yáng)性血清和陰性血清的制備 I)陽(yáng)性血清制備
挑選體格健壯體重在15?20kg的山羊，頸部皮下注射偽狂犬病滅活疫苗5.0mL(購(gòu)自山東綠都生物科技有限公司)，一免后28d進(jìn)行第二次免疫，劑量同前；二免后14d，在無(wú)菌情況下進(jìn)行采血分離血清，血清中和試驗(yàn)(參考OIE陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè))測(cè)定其中和抗體；如中和抗體效價(jià)> 1:128，則在無(wú)菌情況下進(jìn)行大量采血并制備血清，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0033]2)陰性血清制備
挑選未接種過(guò)疫苗且未感染偽狂犬的體格健壯體重在15?20kg的山羊，在無(wú)菌情況下進(jìn)行采血分離血清，血清中和試驗(yàn)(參考OIE陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè))測(cè)定其中和抗體；如中和抗體效價(jià)< 1:4，則在無(wú)菌情況下進(jìn)行大量采血并制備血清，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0034]實(shí)施例4:試劑盒使用方法示例
①在Al和A2孔中分別加入100μ I陰性對(duì)照；在A3和Α4孔中分別加入100 μ I陽(yáng)性對(duì)照；
②取100μ I經(jīng)1:40稀釋好的待檢樣品液加入相應(yīng)孔中，并做好記錄；37°C孵育Ih ；
③將各孔的液體棄入廢液桶，每孔加250μ I的洗滌液(試劑盒內(nèi)20X濃縮洗滌液需用蒸餾水或去離子水稀釋后方可使用。如有結(jié)晶，需先溶解后，方可進(jìn)行稀釋)進(jìn)行洗板，重復(fù)5次,每次30s ；
④每孔加100μ I酶標(biāo)結(jié)合物；37°c孵育Ih ；
⑤重復(fù)步驟③；
⑥每孔加100μ I底物液；
⑦37°C孵育1min(避光顯色)；
⑧每孔加100μ I的終止液；立刻于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，即0D450nm值。
[0035]⑨臨界值(C.0.)的計(jì)算；正常情況下，陽(yáng)性對(duì)照孔0D450值彡0.4 ;陰性對(duì)照孔0D450值< 0.2 ;臨界值=0.17+陰性對(duì)照孔均值；陰性對(duì)照孔0D450值大于0.2時(shí)應(yīng)舍棄，如所有陰性對(duì)照孔0D450值都大于0.2時(shí)須重復(fù)實(shí)驗(yàn)；陰性對(duì)照孔低于0.05時(shí)以0.05計(jì)笪
ο
[0036]⑩結(jié)果判定；檢測(cè)樣品0D450值 > 臨界值，判定該檢測(cè)樣品為陽(yáng)性；檢測(cè)樣品0D450值 < 臨界值，判定該檢測(cè)樣品為陰性。
[0037]實(shí)施例5:敏感性實(shí)驗(yàn)
具體的，參照實(shí)施例4的試劑盒使用方法，所述的試劑盒檢測(cè)PRV陽(yáng)性羊血清，當(dāng)血清稀釋至6400倍時(shí)，檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性；而血清中和試驗(yàn)檢測(cè)其最大稀釋度為256。
[0038]實(shí)施例6:特異性實(shí)驗(yàn)
具體的，參照實(shí)施例4的試劑盒使用方法，檢測(cè)PRV陰性羊血清(血清中和試驗(yàn)檢測(cè)陰性)30份，所述的羊偽狂犬病毒抗體間接ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明所述的ELISA試劑盒具有好的特異性。

表PRV_性龜禳原始盤(pán)裾
PR期性血渭_I
Tl；: I0.09S O 166 O !Se O Γ5 Ο-Π O -0~ O 1?9 I O TS
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[0039]注:本次試驗(yàn)的陰性對(duì)照平均值為0.066，臨界值為0.233。
[0040]實(shí)施例7:重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
具體的，參照實(shí)施例4的試劑盒使用方法，所述的試劑盒檢測(cè)6份PRV抗體水平不同的臨床羊血清，每份血清平行做5個(gè)重復(fù)，得出批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)為4.89%，小于5%(見(jiàn)表2);選擇5個(gè)不同批次的所述試劑盒分別檢測(cè)6份臨床羊血清，數(shù)據(jù)顯示批間重復(fù)性

【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括以下組分:包被板、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、酶標(biāo)結(jié)合物、樣品稀釋液、20X濃縮洗滌液、底物液、終止液、封口膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)結(jié)合物是由酶標(biāo)抗體稀釋液稀釋2000倍的HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)抗體稀釋液為 NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.Iffi2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，甘油 20ml，小牛血清200ml,Casein 5g,鹿糖2g, Triton X-100 10ml,硫柳萊0.lg,加純水定容至1L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液包括 NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.Iffi2O 2.9g，KH2P04 0.2g，吐溫-20 5ml，甘油10ml,小牛血清100ml,硫柳萊0.lg,加純水定容至1L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述包被板由偽狂犬病毒的重組gD蛋白作為包被抗原，并由封閉液封閉，所述封閉液為NaCl8g，KCl 0.2g，Na2HP04.12H20 2.9g，KH2P04 0.2g，小牛血清 100ml，蔗糖 50g，明膠 lg,Casein 2.5g,硫柳萊0.lg,加純水定容至1L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述重組gD蛋白的表達(dá)和純化包括如下步驟: 1)根據(jù)GenBank公布的登錄號(hào)為AY196984的PRVFa株的gD基因序列，設(shè)計(jì)引物序列如下:
Pl:5，-GGGGAATTCTACCCGTACAC-3，
P2:5， -GGGCTCGAGCCTCAGGCGGA-3， 2)通過(guò)PCR擴(kuò)增PRVFa株gD基因，與pMD18_T克隆載體連接； 3)雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-gD，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET-32a-gD； 4)重組質(zhì)粒PET-32a-gD轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)，然后純化設(shè)備，親和柱進(jìn)行親和純化。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述 20 X 濃縮洗滌液為 NaCl 80g, KCl 2g，Na2HPO4.12H20 29g，KH2PO4 2g，吐溫-20 5ml，加純水定容至500ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述終止液為IM H2SO4，所述底物液為可溶型單組分TMB底物液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括自封袋和使用說(shuō)明書(shū)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)羊偽狂犬病毒抗體的ELISA試劑盒的使用方法，其特征在于，主要使用方法如下: (1)在Al和A2孔中分別加入100μ I陰性對(duì)照；在A3和Α4孔中分別加入100 μ I陽(yáng)性對(duì)照； (2)取100μ I經(jīng)1:40稀釋好的待檢樣品液加入相應(yīng)孔中，并做好記錄；37 °C孵育Ih ； (3)將各孔的液體棄入廢液桶，每孔加250μ I的洗滌液進(jìn)行洗板，重復(fù)5次，每次30s ； (4)每孔加100μ I酶標(biāo)結(jié)合物；37 °C孵育Ih ； (5)重復(fù)步驟(3)； (6)每孔加100μ I底物液; (7)37°C避光顯色孵育1min ； (8)每孔加100μ I的終止液；立刻于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，即0D450nm值； (9)臨界值(C.0.)的計(jì)算；正常情況下，陽(yáng)性對(duì)照孔0D450值彡0.4 ;陰性對(duì)照孔0D450值< 0.2 ;臨界值=0.17+陰性對(duì)照孔均值；陰性對(duì)照孔0D450值大于0.2時(shí)應(yīng)舍棄，如所有陰性對(duì)照孔0D450值都大于0.2時(shí)須重復(fù)實(shí)驗(yàn)；陰性對(duì)照孔低于0.05時(shí)以0.05計(jì)算； (10)結(jié)果判定；檢測(cè)樣品0D450值>臨界值，判定該檢測(cè)樣品為陽(yáng)性；檢測(cè)樣品0D450值< 臨界值，判定該檢測(cè)樣品為陰性。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK104181297SQ201410421835
【公開(kāi)日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】王金良, 沈志強(qiáng), 董艷凱, 董炳梅, 陳金龍, 魏鳳 申請(qǐng)人:山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院