一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標檢測試紙條，其包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述金標墊上噴射有金標CSFV反應原性多肽、金標PRRSV反應原性多肽、金標豬PRV反應原性多肽；所述硝酸纖維素膜上設有三條檢測線和一條質(zhì)控線，所述三條檢測線上分別固定有CSFV反應原性多肽、PRRSV反應原性多肽、PRV反應原性多肽，所述質(zhì)檢線上固定有CSFV抗體、PRRSV抗體和PRV抗體。本發(fā)明的試紙條具有多聯(lián)、特異、敏感，使用簡便、快速等優(yōu)點，可為我國生豬養(yǎng)殖基層提供高效、實用的抗體檢測技術(shù)與產(chǎn)品，為生豬疫病的防疫監(jiān)督提供有效的技術(shù)支撐。
【專利說明】一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標檢測試紙條
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測【技術(shù)領域】，具體涉及一種利用多肽抗原制備的豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標檢測試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病有豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟和偽狂犬病、口蹄疫和圓環(huán)等，其中藍耳病危害最為嚴重。美國、歐洲養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達國家普遍采用疫病凈化戰(zhàn)略，針對一些重要疫病如豬口蹄疫、豬瘟、偽狂犬等已停止使用疫苗，嚴格檢疫、監(jiān)測和凈化的措施予以防控。我國因為現(xiàn)有基礎條件和疫病形勢的原因，目前尚不能完全照搬國外疫病凈化的策略，疫苗免疫與疫病監(jiān)控依然是我國生豬疫病防控最為有效的措施之一。
[0003]由于國內(nèi)疫苗種類繁多，質(zhì)量參差不齊，免疫流程與技術(shù)人員操作各不相同，因此，疫苗免疫后抗體效價與免疫效果的監(jiān)測就顯得極為重要，各類抗體水平的監(jiān)測急需免疫檢測技術(shù)與產(chǎn)品的支持。我國目前常用的免疫學檢測方法有ELISA技術(shù)與乳膠凝集技術(shù)，然而ELISA技術(shù)需耗時2-3個小時，對操作人員有較高的技術(shù)要求，不太適應我國基層推廣。乳膠凝集則敏感性較低。免疫膠體金層析技術(shù)因兼有ELISA與乳膠凝集技術(shù)的優(yōu)點，既比ELISA快速(僅需5-10分鐘)，又比乳膠凝集敏感(接近ELISA，可達ng/mL水平)，成為國內(nèi)外動物疫病及抗體水平監(jiān)測技術(shù)研究的熱點之一。
[0004]豬瘟，是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種急性、熱性和高度接觸的病毒性傳染病，該病以流行廣、發(fā)病率和死亡率高為特征,給養(yǎng)豬業(yè)帶來慘重損失。該病被國際動物法規(guī)列入A類16種傳染病之一，被我國動物衛(wèi)生法規(guī)列為一類傳染病。
[0005]豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種繁殖障礙與呼吸系統(tǒng)傳染病。豬是此病的唯一天然宿主。該病以接觸性、高度傳染性、高發(fā)病率，慢性和高死亡率為特征。病豬生長十分緩慢，甚至停滯生長，嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟效益，因此對該病及時做出診斷有利于降低經(jīng)濟損失。
[0006]偽狂犬病是由偽狂犬病毒(PRV)引起的多種家畜、野生動物的一種以發(fā)熱、腦脊髓炎為主的急性傳染病。豬是本病的主要宿主和帶毒者。通常引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、死胎和弱仔；初生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，感染率和病死率可達100%。偽狂犬病(PR) —旦傳入豬群，將導致巨大的經(jīng)濟損失，且很難根除。
[0007]目前，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)在上述幾種病的診斷中已得到普遍應用，ELISA雖然靈敏度比較高，甚至可以區(qū)分野毒感染和疫苗免疫接種產(chǎn)生的抗體，但操作需要專門的技術(shù)人員和分析儀器，不適合基層的使用，因此，適用于現(xiàn)場使用的快速診斷與檢測試劑如膠體金試紙條、核酸分子檢測技術(shù)如實時熒光定量PCR技術(shù)，以及對一些多病原檢測的試劑如核酸檢測生物芯片等的研制與開發(fā)也很受關注。膠體金試紙卡應用簡單、快速、直觀，不需要配備專門的儀器以及技術(shù)人員，適于基本養(yǎng)殖場的檢測需求，節(jié)省人力、物力成本。而目前豬病抗體的檢測模式多是養(yǎng)殖場采集血清樣本然后送到專門的檢測單位通過ELISA方法進行檢測，從樣本送檢到報告結(jié)果一般需要3-4天有時甚至更多的時間，不利于降低檢測成本及提高檢測速度。
[0008]就膠體金試紙條研發(fā)方面而言，目前文獻報道的多是針對病原檢測的單聯(lián)、多聯(lián)試紙卡以及各豬病抗體檢測的單聯(lián)試紙卡，尚無同時檢測CSFV、PRRSV, PRV三種疾病抗體的膠體金檢測試紙卡，且已有的檢測用金標抗原多是利用表達蛋白或是全病毒抗原，利用多肽作為金標抗原的也尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標檢測試紙條。
[0010]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標檢測試紙條，包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述金標墊上噴射有金標豬瘟病毒反應原性多肽、金標豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、金標豬偽狂犬病毒反應原性多肽；所述硝酸纖維素膜上設有三條檢測線和一條質(zhì)控線，所述三條檢測線上分別固定有豬瘟病毒反應原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、豬偽狂犬病毒反應原性多肽，所述質(zhì)檢線上固定有豬瘟病毒抗體、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體和豬偽狂犬病毒抗體。
[0011]作為優(yōu)選的，所述豬瘟病毒反應原性多肽選自以下任一條:
【權(quán)利要求】
1.一種豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、偽狂犬病毒抗體的三聯(lián)金標檢測試紙條，包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，其特征在于:所述金標墊上噴射有金標豬瘟病毒反應原性多肽、金標豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、金標豬偽狂犬病毒反應原性多肽；所述硝酸纖維素膜上設有三條檢測線和一條質(zhì)控線，所述三條檢測線上分別固定有豬瘟病毒反應原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、豬偽狂犬病毒反應原性多肽，所述質(zhì)檢線上固定有豬瘟病毒抗體、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體和豬偽狂犬病毒抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試紙條，其特征在于，所述豬瘟病毒反應原性多肽選自以下任一條:
SEQ ID N0.1:c-HKVRNEVMVHWFDDE ；
SEQ ID N0.2:GLSTAENALLVALFGYV ；
SEQ ID N0.3:CTAVSPTTLRTE ；
SEQ ID N0.4:KYNTTLLNGSA-c。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試紙條，其特征在于，所述豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽選自以下任一條:
SEQ ID N0.5:c-GFMVPPGLSSEGHLT ；
SEQ ID N0.6:KTKSVKSLPGNKPVP-c。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試紙條，其特征在于，所述豬偽狂犬病毒反應原性多肽選自以下任一條:
SEQ ID N0.7:VALALLLLALAAA ；
SEQ ID N0.8 =YYKNVIVTTYffSGSTYA ；
SEQ ID N0.9:LAIGLLYLAGLYAAFLAYR ；
SEQ ID N0.10:LLAALLAALYARTTL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4任一項所述的檢測試紙條，其特征線在于，金標墊上噴涂的金標豬瘟病毒反應原性多肽、金標豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、金標豬偽狂犬病毒反應原性多肽分別為豬瘟病毒反應原性多肽-生物素-鏈霉親和素-膠體金顆粒復合物、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽-生物素-鏈霉親和素-膠體金顆粒復合物、偽狂犬病毒反應原性多肽-生物素-鏈霉親和素-膠體金顆粒復合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~4任一項所述的檢測試紙條，其特征在于，硝酸纖維素膜檢測線上固定的豬瘟病毒反應原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、豬偽狂犬病毒反應原性多肽先與非蛋白多聚體偶聯(lián)，得到多聚體偶聯(lián)反應原性多肽，再進一步將多聚體偶聯(lián)反應原性多肽固定到檢測線上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測試紙條，其特征在于，所述多聚體偶聯(lián)反應原性多肽的制備方法如下: 1)選取反應原性多肽溶解，得到反應原性多肽溶液； 2)取非蛋白多聚體溶解，得到非蛋白多聚體溶液； 3)在反應原性多肽溶液或非蛋白多聚體溶液中加入偶聯(lián)劑，混合均勻； 4)將反應原性多肽溶液與非蛋白多聚體溶液混合均勻，攪拌反應，使反應原性多肽偶聯(lián)到非蛋白多聚體上；5)用透析袋去除未參與結(jié)合的偶聯(lián)劑及游離多肽，純化，凍干，得到多聚體偶聯(lián)反應原性多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測試紙條，其特征在于，所述非蛋白多聚體為聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚苯乙烯磺酸鈉、殼聚糖、葡聚糖硫酸鈉、海藻糖中的任一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測試紙條，其特征在于，所述偶聯(lián)劑為EDC1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、乙烯基三乙氧基硅烷、I，5-戊二醛中的任一種。
10.一種豬瘟、豬藍耳、偽狂犬病毒抗體三聯(lián)金標檢測試紙條的制備方法，包括以下步 驟: 1)合成豬瘟病毒反應原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、豬偽狂犬病毒反應原性多肽； 2)包被膜制備:將硝酸纖維素膜粘到PVC板上，用劃膜噴金機將CSFV、PRRSV、PRV抗體的混合溶液噴涂到硝酸纖維素膜上，形成質(zhì)檢線；將與非蛋白多聚體偶聯(lián)的豬瘟病毒反應原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、豬偽狂犬病毒反應原性多肽分別噴涂到硝酸纖維素膜上，形成三條檢測線，干燥后保存?zhèn)溆茫? 3)金標墊制備:用膠體金顆粒標記鏈霉親和素，然后與生物素化的豬瘟病毒反應原性多肽、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒反應原性多肽、豬偽狂犬病毒反應原性多肽結(jié)合形成金標結(jié)合物，用金子稀釋液稀釋濃縮的金標結(jié)合物到10%~20%，再用劃膜噴金機定量噴涂到玻璃纖維膜上，干燥保存?zhèn)溆茫? 4)樣品墊制備:用樣品處理液均勻處理玻璃纖維膜，干燥保存?zhèn)溆茫? 5)組裝:金標墊與吸水紙分別緊密連接于硝酸纖維素膜的兩端，然后將樣品墊緊密連接于金標結(jié)合墊上組裝成大板，再進一步切割成試紙條。
【文檔編號】G01N33/558GK103954772SQ201410182377
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】林禮錕, 李其昌, 陳善真, 王志花, 劉博奇, 陳克宏, 王貴平 申請人:廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司