專利名稱：：借助熒光測(cè)定核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于測(cè)定存在于樣品中的核酸的量的熒光測(cè)定法，涉及適合于實(shí)施所述方法的熒光測(cè)定計(jì)，并且涉及用于化合物的熒光測(cè)定法的托盤。
背景技術(shù)：
：在血液循環(huán)中存在有游離核酸是數(shù)年前就已知的[Mandel和Metais，1947;Tan等人，1966]。從這時(shí)開始，已經(jīng)使用例如RIA(放射性免疫測(cè)定法)的方法發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于患有良性腫瘤的患者或相對(duì)于健康受試者，癌癥患者具有高水平的循環(huán)DM[Leon等人，1W7;Shapiro等人，1983]。然而，近些年來，隨著高效的分子生物學(xué)方法例如實(shí)時(shí)PCR的開發(fā)，考慮將循環(huán)的DNA片斷用作臨床生物標(biāo)志物的興趣得到迅速發(fā)展。從癌癥患者的血漿中提取的DNA通常具有腫瘤DNA特征[AnkerP.等人，1999]例如鏈不穩(wěn)定性、存在有特定的致癌基因、腫瘤抑制基因和小隨體改變。這個(gè)來源于肺瘤細(xì)胞的循環(huán)DNA的想法是由Kok等人設(shè)想的[DeKok等人，1997]，其報(bào)道了特征在于特定改變的從腫瘤衍生的DNA可以在患有結(jié)腸直腸腫瘤的患者的血清中。因此，這些作者檢測(cè)了以前已經(jīng)在原發(fā)腫瘤中鑒定的血清的DNA中的某些K-ras點(diǎn)突變。這就是循環(huán)DNA的大多數(shù)研究集中在從各類癌癥患者的腫瘤(組織)或血清提取的DM的突變的檢測(cè)、雜合性的喪失、小隨體突變和甲基化作用的原因。在血清的游離基因組DNA中檢測(cè)到的小隨體突變和不穩(wěn)定性提示，其可能是新的潛在標(biāo)記物，對(duì)于監(jiān)控腫瘤具有重要的特異性。最近，許多研究試圖使用基因組DNA、非基因組DM、循環(huán)DNA濃度的僅有的增加作為診斷標(biāo)記物或乳腺癌和肺癌的早期形成的標(biāo)記物，以及用于監(jiān)控和檢查已經(jīng)接收化學(xué)療法治療的患者[Sozzi等人，2001]。這種測(cè)量會(huì)消除或至少減少對(duì)更侵入性操作例如活體檢查的需要。它還可以用于篩選特定的早期癌癥，例如肺癌[Sozzi等人，2003]、乳腺癌[Gal等人，2004]或前列腺癌[Boddy等人，2005;Jung等人，2004]。最后，它還可以用于補(bǔ)充通常用于監(jiān)控患有癌癥或經(jīng)歷化學(xué)療法的患者或經(jīng)歷外科手術(shù)、創(chuàng)傷[Lam等人，2003]或心肌梗塞[Chang等人，2003]的患者的標(biāo)記物的分析。在血液中主要循環(huán)兩種DNA:-與循環(huán)的有核細(xì)胞有關(guān)的DNA;和-在血漿中游離循環(huán)的DNA。在患有癌癥或患有心肌梗塞的患者中，血清中的基因組DNA是片斷的，在惡性腫瘤的情況中有大約lOO個(gè)堿基對(duì)[Wu等人，200"的片段，而在心肌梗塞的情況中有大約200個(gè)堿基對(duì)[Chang等人，2003]的片段。這些片斷在沒有病變的對(duì)照者的血液中沒有發(fā)現(xiàn)，在所述對(duì)照者中，發(fā)現(xiàn)循環(huán)的DNA為極低的濃度。即使現(xiàn)在，關(guān)于DNA被釋放到血流中的機(jī)理仍知之甚少。Jahr等人[Jahr等人，2001]提出了凋亡和壞死的細(xì)胞是這種DNA的主要來源的假設(shè)。目前沒有參考文獻(xiàn)限定在健康受試者中的這種循環(huán)的DNA濃度的限值。許多研究試圖估計(jì)這個(gè)閾值，但是作為方法對(duì)它們進(jìn)行比較是十分困難的，并且得到的結(jié)果有不同程度的差異。此外，在不同研究之間所用的單位有所不同ng/ml、拷貝數(shù)/ml、基因組當(dāng)量/ml(以6.6皮克/ml估計(jì)的二倍體細(xì)胞中所含DNA的量)、等等。許多研究組通過探索在預(yù)后中的應(yīng)用前景、特別是試圖確定與常規(guī)診斷標(biāo)記物的相關(guān)性而測(cè)量了循環(huán)DNA的水平。到目前為止，所有的研究在以下方面是一致的，即癌癥患者中的DNA平均水平比健康對(duì)照中顯著更高，而與使用血清或是血漿無關(guān)。然而，測(cè)量的絕對(duì)數(shù)量在不同研究之間有所不同。這種差異可能是與所分析的癌癥類型和所用的不同方法有關(guān)。如公布的大量數(shù)據(jù)所證實(shí)的，在血漿中測(cè)量的DNA水平低于血清中測(cè)量的水平[Thijssen等人，2002]。對(duì)于臨床重要性，至少兩個(gè)報(bào)告描述了DM水平和已知的預(yù)后因素之間的相關(guān)性。在(小細(xì)胞或非小細(xì)胞)肺癌中，在血漿DNA和血清的LDH活性和神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)之間具有緊密的相關(guān)性，在每種標(biāo)記物和患者存活之間具有相似的關(guān)系[Fournie等人，1995]。類似地，DNA水平已經(jīng)與在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性病灶的情況中的臨床階段以及乳腺癌患者的腫瘤大小相關(guān)[Shao等人，2001]。最后，重要的是要記住，由于腫瘤的原因，循環(huán)DM的百分率在不同患者之間顯著不同[Jahr等人，2001]?，F(xiàn)在有許多用于測(cè)量溶液中核酸的方法，并且取決于方法允許根據(jù)臨床醫(yī)師和研究人員的不同需要進(jìn)行改進(jìn)。這些方法主要包括分光光度測(cè)定法[Greenstock等人，1975]—是在所有研究實(shí)驗(yàn)室中非常常用的方法，優(yōu)點(diǎn)在于廉價(jià)，但是在臨床實(shí)踐中的主要缺點(diǎn)是極其不靈敏其不能測(cè)量患者中的循環(huán)DNA的量。有其它更靈敏的方法，但是它們都具有使得它們或多或少難以常規(guī)使用的特征，部分是因?yàn)樗鼈兙哂性跍y(cè)量之前從生物環(huán)境提取DNA的共同的步驟放射免疫測(cè)定方法[Leon等人，1975]花費(fèi)相對(duì)長(zhǎng)的時(shí)間(每個(gè)分析系列要幾個(gè)小時(shí))，必需以一系列測(cè)量來進(jìn)行而不能分散地進(jìn)行，尤其是，需要被批準(zhǔn)處理放射性元素的專門建筑物和工作人員。.竟?fàn)幮訮CR[Siebert等人，1992;Yap等人，1992]基于相對(duì)于已知標(biāo)準(zhǔn)樣品的相對(duì)顯示，是提供檢測(cè)靈敏度和特異性的多種系列方法的補(bǔ)充。這些方法是使用不便的并且相對(duì)機(jī)密的；其在醫(yī)用分析實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)使用在將來是不可想象的。.實(shí)時(shí)的定量PCR[Mulder等人，1994]是涉及測(cè)量循環(huán)DNA這個(gè)問題的各種出版物中的優(yōu)選方法。其優(yōu)點(diǎn)是雙重的其對(duì)于要顯示的目標(biāo)DNA(在這種情況中為人DNA)是特異性的，并且其現(xiàn)在不再是研究實(shí)驗(yàn)室的禁區(qū)，可以在許多醫(yī)院找到設(shè)備。然而，它也不是沒有缺點(diǎn)必需進(jìn)行提取、相對(duì)高的操作成本、特定的設(shè)備不能用于大規(guī)模常規(guī)分析、以及靈敏性不足?！龆康臒晒鉁y(cè)定法[Greenstock等人，1975]。盡管這種方法沒有免除提取步驟，但是其允許更快速地和直接地測(cè)量存在于溶液中的游離DNA。然而，使用所述方法所需的技術(shù)條件(微量培養(yǎng)板、大量的試劑、測(cè)量熒光)使其難以達(dá)到期望的靈敏度極限并且不允許識(shí)別所檢測(cè)的DNA的來源(人或非人來源)。因此，本發(fā)明設(shè)法提供沒有現(xiàn)有技術(shù)方法的缺點(diǎn)的用于測(cè)定在樣品中存在的核酸的量的方法。因此，本發(fā)明的出發(fā)點(diǎn)在于本發(fā)明人證明了有可能通過向樣品加入熒光團(tuán)和通過在同步分析中、或在響應(yīng)于至少兩個(gè)、特別是至少三個(gè)相應(yīng)波長(zhǎng)的激發(fā)而產(chǎn)生的至少兩個(gè)、特別是至少三個(gè)不同的發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定發(fā)射的焚光強(qiáng)度來測(cè)定在樣品中存在的核酸的量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及在至少兩個(gè)、優(yōu)選至少三個(gè)波長(zhǎng)測(cè)定在樣品中存在的核酸的量的方法，其中-向樣品添加熒光團(tuán)，-分別測(cè)量響應(yīng)于至少兩個(gè)、優(yōu)選三個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)的光刺激而由至少兩個(gè)、優(yōu)選至少三個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射的熒光強(qiáng)度，和從至少兩個(gè)、優(yōu)選至少三個(gè)測(cè)量的熒光強(qiáng)度推導(dǎo)存在于樣品中的核酸的量。在前述方法的特定實(shí)施方案中，分別測(cè)量響應(yīng)于三個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)入VA，2和A，3的光刺激而由熒光團(tuán)在三個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)、、入2和入3發(fā)射的熒光強(qiáng)度I"12和13，其中入！〈入2〈入3和M，入2和入3是預(yù)先確定的。在前述方法的另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，從以下F值推導(dǎo)核酸的y3-；i義，一義，在前述方法的另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，熒光團(tuán)是Picogreer^，波長(zhǎng)如下入，,=472±10(優(yōu)選±5)nm入，=502±10(優(yōu)選±5)nm入，2=496±10(優(yōu)選±5)nm入2=526±10(優(yōu)選±5)nm入，3-538±10(優(yōu)選±5)nm入3=568士10(優(yōu)選±5)nm此外，在前述方法的另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，分別測(cè)量響應(yīng)于兩個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)入，i和A，2的光刺激而由熒光團(tuán)在兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)、和入2發(fā)射的熒光強(qiáng)度L和12，、和入2是預(yù)先確定的。在這里，優(yōu)選從I!和12之差的絕對(duì)值推導(dǎo)核酸的量，即，從以下的F值仍在這種情況中，如果熒光團(tuán)是Picogreei^,則波長(zhǎng)如下入，嚴(yán)472土10nm入嚴(yán)502土10nm,和更具體地說，使用校準(zhǔn)曲線從F值推導(dǎo)樣品中的核酸的量。本發(fā)明還涉及適合于實(shí)現(xiàn)上述定義的方法的焚光測(cè)定計(jì)，特征在于，其包括-一個(gè)或多個(gè)用于在兩個(gè)和/或三個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)入、入，2和任選的入，3進(jìn)行光激發(fā)的設(shè)備；-一個(gè)或多個(gè)用于測(cè)量在三個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)入^入2和任選的入3發(fā)射的熒光強(qiáng)度L、12和任選的13的設(shè)備；-允許計(jì)算以下F值的計(jì)算裝置入，2=496土10nm入，產(chǎn)496土10nm入2=526±10nm,或入嚴(yán)526±10nm,和538±10nm入2=568±10nm/1,/3-v義i—義？說明書第6/32頁(yè)在前述熒光測(cè)定計(jì)的特定實(shí)施方案中，對(duì)于三個(gè)波長(zhǎng)，所述激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)如下入，產(chǎn)472±10(優(yōu)選±5)nm入！=502士10(優(yōu)選±5)nm入，2=496±10(優(yōu)選±5)nm入2-526±10(優(yōu)選±5)nm入，3=538±10(優(yōu)選±5)nm入3-568±10(優(yōu)選±5)nm在前述熒光測(cè)定計(jì)的另一個(gè)特定實(shí)施方案中，對(duì)于二個(gè)波長(zhǎng)，所述激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)如下入，產(chǎn)472+10nm入產(chǎn)502土10rnn，和入，2=496+10mn入2=526±10mn，或入，產(chǎn)496士10nm入嚴(yán)526土10nm，和入，2-538±10nm入2=568±10nm本發(fā)明還涉及設(shè)計(jì)用于化合物的焚光測(cè)定的托盤，其包括混合和測(cè)量器皿，所述混合和測(cè)量器皿至少對(duì)于用于熒光分析的波長(zhǎng)的光是透明的，所述器皿連接于包含熒光團(tuán)的儲(chǔ)庫(kù)，所述熒光團(tuán)儲(chǔ)庫(kù)本身連接于包含稀釋溶液的儲(chǔ)庫(kù)；并且連接于-用于使包含待分析化合物的樣品體積標(biāo)準(zhǔn)化的儲(chǔ)庫(kù)，所述標(biāo)準(zhǔn)化儲(chǔ)庫(kù)本身連接于用于收集包含待分析化合物的樣品的孔。在上述定義的托盤的特定實(shí)施方案中，存在有單向閥，所述單向閥的位置為-在收集孔和標(biāo)準(zhǔn)化儲(chǔ)庫(kù)之間，使得收集的溶液只能夠沿標(biāo)準(zhǔn)化儲(chǔ)庫(kù)的方向通過；-在標(biāo)準(zhǔn)化儲(chǔ)庫(kù)和混合和測(cè)量器皿之間，使得收集的溶液只能夠朝向器皿的方向通過；-在包含稀釋溶液的儲(chǔ)庫(kù)和熒光團(tuán)儲(chǔ)庫(kù)之間，使得稀釋溶液只能夠朝向熒光團(tuán)儲(chǔ)庫(kù)的方向通過；-在熒光團(tuán)儲(chǔ)庫(kù)和混合和測(cè)量器皿之間，使得稀釋的溶液只能夠朝向器jni的方向通過.在上述定義的托盤的另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，由標(biāo)準(zhǔn)化儲(chǔ)庫(kù)、混合物和測(cè)量器皿、熒光團(tuán)儲(chǔ)庫(kù)和稀釋溶液儲(chǔ)庫(kù)組成各個(gè)隔室是由充分撓性的材料制成的，以便允許通過對(duì)容器施加壓力而使器亞中包含的液體移動(dòng)。在上述定義的托盤的另一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述該熒光團(tuán)為Picogreen,而稀釋溶液是Tris-Botrate-EDTA(TBE)緩沖液。在上述定義的托盤的另一個(gè)特定實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)化儲(chǔ)庫(kù)與用于選擇收集溶液所含的、長(zhǎng)度小于1，000個(gè)核苷酸的核酸分子的設(shè)備耦聯(lián)。發(fā)明詳述核酸核酸可以是天然或合成來源的，并且其結(jié)合的核苷酸，特別是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸，可以是天然的或經(jīng)過修飾的。優(yōu)選地，核酸是DNA或RNA,更優(yōu)選為DNA。另外優(yōu)選地，核酸鏈的大小為大于五個(gè)堿基。有利地，樣品中具有低分子量鏈(例如，長(zhǎng)度小于1，000個(gè)堿基)的核酸的特異性量化(任選地在使用適合的方法選擇這些核酸之后)允許量化例如得到所述樣品的生物或培養(yǎng)物中由于細(xì)胞的凋亡所引起的死亡；可以將如此測(cè)量的值與任選地在不使用用于選擇小于l，OOO個(gè)堿基對(duì)大小的鏈的任何方法的情況下測(cè)量的DNA總量的值相關(guān)，以便提供凋亡引起的細(xì)胞死亡的百分比。還可以通過測(cè)量總的核酸和通過在使用適合的方法除去低分子量核酸之后測(cè)量高分子量的核酸來量化凋亡。然后可以通過減去高分子量核酸得到低分子量核酸的量。任選地，可以通過低分子量核酸的特異性選擇來直接進(jìn)行量化。然后也可以特異性地測(cè)量剩余的高分子量核酸。因此，通過將二者的量相加得到總的核酸。為了量化凋亡，可以在DNA與熒光團(tuán)的相互作用之后通過熒光進(jìn)行低分子量核酸或高分子量核酸以及總的核酸的特異性量化。所述核酸可以預(yù)先使用任何適合的方法進(jìn)行捕獲和/或濃集。本發(fā)明框架內(nèi)的凋亡量化可以隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行而在動(dòng)態(tài)條件下進(jìn)行。實(shí)際上，不需要例如停止細(xì)胞培養(yǎng)來進(jìn)行測(cè)量，因?yàn)闇y(cè)量的是在外部介質(zhì)(即，培養(yǎng)基)中除去的核酸片斷。其余的活細(xì)胞允許繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因此，有可能根據(jù)需要在短時(shí)間之后、或者在其后的任何時(shí)候進(jìn)行重復(fù)測(cè)量。同樣地，有可能測(cè)量在人或動(dòng)物中發(fā)生的凋亡，測(cè)量介質(zhì)是本文中的任何類型的生物樣品。因此，有可能想到許多的應(yīng)用領(lǐng)域例如醫(yī)療領(lǐng)域、對(duì)動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)規(guī)程等等?？梢栽谌魏晤愋偷囊后w中測(cè)量核酸片斷，無論是天然的或非天然的。一個(gè)領(lǐng)域特別地涉及對(duì)動(dòng)物或?qū)?xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行的藥理學(xué)研究。特別是包括-試驗(yàn)藥物的致死率；-確定細(xì)胞死亡誘導(dǎo)模式，例如壞死或凋亡；確定在所用的實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)生第一個(gè)細(xì)胞死亡而其它細(xì)胞保持生存的時(shí)間，允許實(shí)驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行。另一個(gè)領(lǐng)域涉及對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行的科學(xué)研究。實(shí)際上，有可能研究以下情況對(duì)細(xì)胞死亡的影響代謝途徑的刺激或鈍化，或所用的實(shí)驗(yàn)條件。然而，另一個(gè)領(lǐng)域涉及對(duì)動(dòng)物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)規(guī)程，用于試驗(yàn)以下情況的影響-藥物對(duì)隨才幾細(xì)胞死亡的影響-誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，或-實(shí)驗(yàn)條件。除了上述那些之外，感興趣的是在對(duì)患有誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的病理學(xué)的患者進(jìn)行的監(jiān)控或跟蹤中量化凋亡，用以診斷它們的病理學(xué)或跟蹤它們的治療效果。一般地說，應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)槠渲行枰酪韵聝?nèi)容的情況細(xì)胞死亡是否發(fā)生、死亡誘導(dǎo)模式、發(fā)生之前的延遲、以及所研究的作用的持續(xù)時(shí)間。因此，優(yōu)選將已經(jīng)通過上述定義的方法測(cè)定的核酸的量用于細(xì)胞死亡表征的情況中。樣品樣品可以是天然的或合成的來源，為無機(jī)的或有機(jī)的。優(yōu)選地，樣品是生物樣品或生物樣品衍生物。更優(yōu)選地，樣品來自于生物樣品的稀釋。生物樣品可以來自動(dòng)物(特別是人)或來自植物。還優(yōu)選地，生物樣品選自以下的組細(xì)胞培養(yǎng)物、全血、血清、血漿、血液的有形成分、紅細(xì)胞、尿、糞便、腦脊液、精液、穿刺液、痰液(expectora)、唾液、支氣管和肺泡液體、膿、生殖道分泌物、羊水、胃液、膽汁、胰液、組織活體檢查、毛發(fā)、皮膚和牙齒、以及淋巴液。還優(yōu)選地，樣品來源于經(jīng)歷過其中已經(jīng)發(fā)生細(xì)胞破裂的生理病理學(xué)情況的患者。特別地，樣品來源于以下患者患有或者被懷疑患有癌癥的患者、正在經(jīng)歷化療的患者、經(jīng)歷過外科手術(shù)的患者、創(chuàng)傷患者和經(jīng)歷過心肌梗塞的患者。優(yōu)選地，包含在生物樣品中的核酸來源于生理學(xué)或病理學(xué)來源的細(xì)胞胞溶作用，特別地，核酸來源于凋亡的細(xì)胞。樣品特別優(yōu)選是稀釋20到400倍的血漿。有利地，本發(fā)明的方法允許量化任何期望樣品內(nèi)的核酸，無需事先進(jìn)行核酸的純化。熒光團(tuán)術(shù)語"熒光團(tuán)"是指容易響應(yīng)于光激發(fā)而發(fā)光的化合物。在本發(fā)明中，優(yōu)選熒光團(tuán)易于通過與核酸建立弱或強(qiáng)的相互作用或化學(xué)鍵而與其發(fā)生相互作用。通常，可以將與核酸相互作用的熒光團(tuán)與如下物質(zhì)相區(qū)別嵌入試劑，例如溴化乙錠、多輿化丙咬或Picogreen;.結(jié)合于雙鏈DNA的小溝的試劑，例如DAPI和Hoechst試劑(例如Hoechst33258、Hoechst34580);與核酸相互作用的各種試劑，例如吖咬橙、7-AAD、LDS751和羥基脒(hydroxystilbanidine)。其它實(shí)例包括選自以下組的焚光團(tuán)SYBR(化學(xué)反應(yīng)性的)、T0T0(花青二聚體)、TO-PR0(花青單體)、SYTO(滲透細(xì)胞)和SYT0X(不滲透細(xì)胞)家族。優(yōu)選地，所述熒光團(tuán)是核酸嵌入試劑。術(shù)語"核酸嵌入試劑"是指容易被插入到形成核酸鏈的堿基之間的熒光團(tuán)。嵌入試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。因此，發(fā)明人特別地表明，Picogreen、溴化乙錠、試劑Hoechst33258、吖啶橙、P0P0、T0T(f和SYBI^允許使用本發(fā)明的方法進(jìn)行核酸的量化。優(yōu)選地，熒光團(tuán)因此選自Picogreen、溴化乙錠、試劑Hoechst33258、吖咬橙、P0P0、T0T0頃和SYBF^。更優(yōu)選地，所述熒光團(tuán)是Picogreer^或2-[N-雙(3-二曱基氨基丙基)-氨基]-4-[2，3-二氫-3-曱基-(苯并-l，3-噻唑-2-基)-亞曱基]-1-苯基-喹啉鎮(zhèn)]+)。Picogreei^特別是由MolecularProbes出售的。特別地，其在美國(guó)專利No.5863753中有所表征。在前述方法中，優(yōu)選將PicogreendsDNA定量試劑盒(MolecularProbes)的Picogreei^以約1/5，000到約1/80，000的稀釋度、特別是約1/20，000的稀釋度使用。在使用溴化乙錠時(shí)，可以在上述定義的方法和熒光測(cè)定計(jì)中使用以下的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)于三個(gè)波長(zhǎng)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>入，2-520士10nm入，尸560±lOnm入2=595±10nm入3=635土10nm對(duì)于兩個(gè)波長(zhǎng)入，^475±10nm入，2=520士10nm入,產(chǎn)520土lOnm入，2=560±10nm入t-550土IO諸入2=595±10線或入嚴(yán)595±10nm入2=635±lOnm在使用Hoechst33258時(shí)，可以在上述定義的方法和焚光測(cè)定計(jì)中使用以下的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)于三個(gè)波長(zhǎng)入，產(chǎn)315±10nm入，2=350±10nm入，3=395±10nm對(duì)于兩個(gè)波長(zhǎng)入，產(chǎn)315±10nm入，產(chǎn)350土10認(rèn)入，f350土10nm入，2=395±10nmX,=435±10nm入2=470±10nm入3=515士lOnm入一35±IO該入2=470±10nm,或入產(chǎn)470土10nm入產(chǎn)515士10認(rèn)在使用SyBrgreenII時(shí)，可以在上述定義的方法和熒光測(cè)定計(jì)中使用以下的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)于三個(gè)波長(zhǎng)入，產(chǎn)450士10認(rèn)入，2-485±10nm入，3=525±10nm入嚴(yán)475±10nm入2-510士10nm入3=550土10nni對(duì)于兩個(gè)波長(zhǎng)入，產(chǎn)450土10認(rèn)入，2=485±10nm入，,=485±IO認(rèn)入、=525±10nm在使用Popo1時(shí)，下的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)于三個(gè)波長(zhǎng)入，產(chǎn)415±10nm入，2=435±10nm入，3=475±10nm對(duì)于兩個(gè)波長(zhǎng)入，產(chǎn)415±lOmn入，2=435±10nm入，產(chǎn)435±lOmn入，2=475±lOrnn入一75土10nm入，產(chǎn)510土10認(rèn)，或入產(chǎn)510土10nm入2=550±10賤入產(chǎn)437土10nm入2=457±10nm入產(chǎn)497±lOntn入產(chǎn)437±lOrnn入2=457±10認(rèn)，或入產(chǎn)457±IO認(rèn)入2=497±IO認(rèn)說明書第12/32頁(yè)可以在上述定義的方法和熒光測(cè)定計(jì)中使用以同步熒光術(shù)語"同步熒光"是指本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的熒光測(cè)定方法，其中用于接收發(fā)射光和激發(fā)光的兩個(gè)單色器同時(shí)移動(dòng)，以便測(cè)量對(duì)應(yīng)于激發(fā)光和發(fā)射光的一組信號(hào)，其中激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)彼此分開恒定的間隔，例如30nm。同步熒光特別是由Lloyd(1971)"Synchronisedexcitationoffluorescenceemissionspectra"NaturephysicalScience231:64-5和由Ficheux等人(1991)"Laspectrofluorescencesynchrone:theorieetapplications"Toxicorama3:1:8-13定義。在上述定義的方法中，可以通過同步熒光測(cè)量所述兩個(gè)或三個(gè)焚光強(qiáng)度，或者，一旦已經(jīng)測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，通過測(cè)量響應(yīng)于給定激發(fā)波長(zhǎng)決定的在發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射的光的兩個(gè)或三個(gè)強(qiáng)度來簡(jiǎn)單地測(cè)量所迷兩個(gè)或三個(gè)熒光強(qiáng)度。因此，可以通過同步熒光測(cè)定l、入2和任選的X3作為標(biāo)記同步光i普斜率變化的點(diǎn)，特別是同步光鐠斜率的拐點(diǎn)或斷點(diǎn)。應(yīng)該理解，斜率斷點(diǎn)標(biāo)記新的斜率與峰前各點(diǎn)的平均斜率值之間的界限，所述新的斜率在統(tǒng)計(jì)上不同于先前值限定的背景的值；還必須允許這個(gè)平均值周圍各點(diǎn)的變化性。更具體地說，如果將三個(gè)波長(zhǎng)作為基礎(chǔ)，l表示觀察到熒光發(fā)射強(qiáng)度峰的發(fā)射波長(zhǎng)，這個(gè)峰是由對(duì)應(yīng)于入和人3的兩個(gè)拐點(diǎn)或斜率斷點(diǎn)所圍繞的。其中從同步熒光光譜測(cè)定人i，入2,人3，入、入，2和入'3的方法在以下實(shí)施例中對(duì)于Picogreei^的具體情況進(jìn)行闡述。簡(jiǎn)而言之，入i、入2和入3可以更具體地分別對(duì)應(yīng)于-在使用SHIMADZURF535型熒光測(cè)定計(jì)讀取讀數(shù)時(shí)，則對(duì)應(yīng)于代表核酸和熒光團(tuán)的溶液的同步熒光光鐠的單個(gè)曲線的斜率的拐點(diǎn)；-在使用SAFASXenius型熒光測(cè)定計(jì)讀取讀數(shù)時(shí)，則對(duì)應(yīng)于代表核酸和焚光團(tuán)的溶液的同步熒光光鐠的單個(gè)曲線的斜率的斷點(diǎn)；有利地，本發(fā)明的方法允許限制或者防止瑞利干涉現(xiàn)象。或者，如果使用兩個(gè)波長(zhǎng)作為基礎(chǔ)，則M或入2表示觀察到熒光發(fā)射強(qiáng)度峰的發(fā)射波,，而另一個(gè)表示觀察到剛好在所述發(fā)射強(qiáng)度峰之前或之后的斜率的拐點(diǎn)或斷點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)。圖15和16舉例說明l和入2的選擇。優(yōu)選地，Ai和X2之一表示觀察到熒光發(fā)射強(qiáng)度峰的發(fā)射波長(zhǎng)，而另一個(gè)表示觀察到剛好在所述發(fā)射強(qiáng)度峰之前的斜率的拐點(diǎn)或斷點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)。盡管僅使用兩個(gè)波長(zhǎng)不如使用三個(gè)波長(zhǎng)那樣精確，但是它也允許限制和防止瑞利干涉現(xiàn)象，同時(shí)容易實(shí)施。熒光測(cè)定計(jì)對(duì)于本發(fā)明的熒光測(cè)定計(jì)，激發(fā)燈泡的功率優(yōu)選為使得允許在激發(fā)波長(zhǎng)以小于10%的精度讀取約2.5ng/ml的低濃度DNA。優(yōu)選地，所用的單色器的帶寬不超過+/-511111。發(fā)射光，特別是相對(duì)于發(fā)射光的方向?yàn)?0°發(fā)射的光，優(yōu)選通過適合的系統(tǒng)捕獲并且引導(dǎo)到發(fā)射單色器，以便選擇對(duì)于該測(cè)量為特異性的波長(zhǎng)。優(yōu)選F值由計(jì)算機(jī)使用其內(nèi)存中所儲(chǔ)存的算法來計(jì)算。此外，優(yōu)選本發(fā)明的熒光測(cè)定計(jì)裝備有允許儲(chǔ)存數(shù)據(jù)(例如每個(gè)測(cè)量組的標(biāo)定曲線)的系統(tǒng)。還優(yōu)選地，本發(fā)明的焚光測(cè)定計(jì)在經(jīng)過計(jì)算和使用儲(chǔ)存的標(biāo)定曲線之后提供在樣品中包含的核酸的量。此外，優(yōu)選本發(fā)明的熒光測(cè)定計(jì)裝備有用于顯示結(jié)果的系統(tǒng)以及用于生成和輸出數(shù)據(jù)的系統(tǒng)例如打印機(jī)(或用于連接打印機(jī)的設(shè)備)。此外，還優(yōu)選地，所述熒光測(cè)定計(jì)能夠?qū)悠泛腿魏卧噭┗旌?，并且能夠?qū)⑺鼈兂蚱渲羞M(jìn)行測(cè)量的讀取器皿輸送。本發(fā)明的熒光測(cè)定計(jì)優(yōu)選具有數(shù)字或字母數(shù)字的小鍵盤，以便允許輸入例如得到要計(jì)算其中包含的核酸的量的一個(gè)或多個(gè)樣品的患者的識(shí)別符；在分析結(jié)束時(shí)，這個(gè)識(shí)別符可以呈現(xiàn)在使用打印機(jī)打印的^t艮告中。此外，也可能為熒光測(cè)定計(jì)裝備允許讀取包含待分析樣品的容器所帶的條形碼的系統(tǒng)。如果樣品包含在允許使用熒光測(cè)定計(jì)進(jìn)行測(cè)量的容器中，例如本發(fā)明的托盤，則所述條形碼可以包括該容器的至少一個(gè)生產(chǎn)批次編號(hào)。這個(gè)數(shù)字也可以在分析結(jié)束時(shí)呈現(xiàn)在使用打印機(jī)印刷的報(bào)告上。本發(fā)明的熒光測(cè)定計(jì)優(yōu)選裝備有至少一個(gè)用于通過電源或電池(用于移動(dòng)應(yīng)用)提供電力的設(shè)備，以及至少一個(gè)用于連接于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的設(shè)備。如果熒光測(cè)定計(jì)裝備有多個(gè)連接設(shè)備，則這些連接設(shè)備優(yōu)選具有幾種不同的標(biāo)準(zhǔn)。在移動(dòng)應(yīng)用時(shí)，優(yōu)選熒光測(cè)定計(jì)盡可能結(jié)構(gòu)緊湊，例如具有以下尺寸H<15cm;L<25cm;W<20cm,并且盡可能輕，以便在不使用戶不便的情況下能夠安裝在例如實(shí)驗(yàn)室操作臺(tái)上，并且能夠容易地移動(dòng)。最后，優(yōu)選熒光測(cè)定計(jì)裝備有允許轉(zhuǎn)移和混合試劑的系統(tǒng)，特別是在將所述系統(tǒng)與本發(fā)明的托盤一起使用的情況下。托盤本發(fā)明的托盤包括本發(fā)明的方法所需的所有設(shè)備和試劑，即，熒光團(tuán)、任選的稀釋劑、測(cè)量器皿、用于收集樣品的系統(tǒng)和用于有效實(shí)施該方法所必不可少的任何東西。對(duì)于本發(fā)明的托盤，有利地使用撓性材料，以便允許將包含在托盤中的各種試劑(樣品、緩沖液、熒光團(tuán))的混合物混合，例如通過壓力-真空或機(jī)械壓力來混合。優(yōu)選托盤的各種隔室(孔、儲(chǔ)庫(kù)、器皿)通過毛細(xì)管連接，并且從一個(gè)隔室到另一個(gè)隔室的流通優(yōu)選通過擠壓例如緩沖液儲(chǔ)庫(kù)、熒光團(tuán)儲(chǔ)庫(kù)和/或標(biāo)準(zhǔn)化儲(chǔ)庫(kù)來實(shí)現(xiàn)。緩沖液通過熒光團(tuán)儲(chǔ)庫(kù)的流通允許熒光團(tuán)被稀釋，并且混合物整體地被朝向器皿推動(dòng)?？梢栽趯⑼斜P被放置在熒光測(cè)定計(jì)中之前或之后將可以事先稀釋或未事先稀釋的樣品放置在托盤的孔中。優(yōu)選地，將精確的樣品體積放置在孔中，然后將最佳確定的量的樣品經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)化儲(chǔ)庫(kù)引導(dǎo)向器皿，以便在其中與熒光團(tuán)混合。然后可以通過例如使器皿經(jīng)過壓力-真空或機(jī)械壓力而進(jìn)行在器皿中的混合。本發(fā)明的托盤是有利的，因?yàn)槠湓试S進(jìn)行熒光團(tuán)濃溶液和緩沖液的即時(shí)混合，以便達(dá)到對(duì)于熒光來說最佳的最終稀釋；它還允許熒光團(tuán)和樣品的勻化，以及在適當(dāng)?shù)那闆r中允許適當(dāng)稀釋樣品和測(cè)量發(fā)射的熒光。附圖簡(jiǎn)述圖1:稀釋到1/100的血漿中所含DM的同步熒光光譜。Y軸表示熒光強(qiáng)度(UF),X軸表示發(fā)射波長(zhǎng)(nm)。圖2:具有1/4，000稀釋的Picogreen⑧、TBE1X緩沖液(pH8.4)健康患者血漿中的DNA的熒光強(qiáng)度，AX=50nm。血漿稀釋到1/100。Y軸表示熒光強(qiáng)度(UF)，X軸表示發(fā)射波長(zhǎng)(nm)。圖3:具有1/4，000稀釋的Picogreen、TBEIX緩沖液(pH8.4)患病患者血漿中的DNA的熒光強(qiáng)度，A入-50nm。血漿稀釋到1/100。Y軸表示熒光強(qiáng)度(UF)，X軸表示發(fā)射波長(zhǎng)(nm)。圖4:具有1/20，000稀釋的Picogreen、TBE1X緩沖液(pH8.4)健康患者血漿中的DNA的熒光強(qiáng)度，A入-50nm。血漿稀釋到1/100。Y軸表示熒光強(qiáng)度(UF)，X軸表示發(fā)射波長(zhǎng)(nm)。圖5:具有1/20，000稀釋的Picogreen、TBEIX緩沖液(pH8.4)患病患者血漿中的DNA的熒光強(qiáng)度，A入-50nm。血漿稀釋到1/100。Y軸表示熒光強(qiáng)度(UF),X軸表示發(fā)射波長(zhǎng)(nm)。圖6:在三個(gè)不同△入(50nm、35nm和30nm)時(shí)血漿DNA的熒光強(qiáng)度，TBElX緩沖液(pH8.4)。Y軸表示熒光強(qiáng)度(UF),X軸表示發(fā)射波長(zhǎng)(nm)。圖7:熒光強(qiáng)度(Y軸，任何期望的單位)作為DNA濃度(X軸，ng/ml)的函數(shù)的線性。圖8:使用同步熒光測(cè)定法測(cè)量的DNA濃度(Y軸，拷貝數(shù)/ml)與使用試劑盒從前列腺癌患者提取的DNA(TBE1X緩沖液(pH8.4)、稀釋到1/20，000的Picogreer^)的實(shí)時(shí)PCR測(cè)量的DNA濃度(X軸，拷貝數(shù)/ml)之間的相關(guān)性。圖9:通過實(shí)時(shí)PCR測(cè)量的拷貝數(shù)和作為圖8所示結(jié)果的通過實(shí)時(shí)PCR得到的拷貝數(shù)的函數(shù)的通過同步熒光測(cè)定法測(cè)量的拷貝數(shù)之間的相互關(guān)系。圖10:使用同步熒光測(cè)定法測(cè)量的DM濃度(Y軸，拷貝數(shù)/ml)和使用試劑盒對(duì)從前列腺癌患者提取的DNA(TBE1X緩沖液(pH8.4)、稀釋到1/20，000的Picogreer^)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR測(cè)量的DNA濃度(X軸，拷貝數(shù)/ffll)之間的相關(guān)性；相對(duì)于圖8中的結(jié)果只保留了從基因組拷貝數(shù)/ml大于IOO的患者提取的DNA濃度。圖11:使用實(shí)時(shí)PCR測(cè)量的DNA濃度(Y軸，拷貝數(shù)/ml)與對(duì)從前列腺癌和結(jié)腸癌患者純化的DNA(TBEIX緩沖液(pH11.4)稀釋到1/20,000的Picogreei^)進(jìn)行同步熒光測(cè)定法測(cè)量的DNA濃度(X軸，拷貝數(shù)/ml)之間的相關(guān)性。圖12:使用實(shí)時(shí)PCR測(cè)量的DNA濃度(Y軸，拷貝數(shù)/ml)與對(duì)從基因組拷貝數(shù)/ml大于100的前列腺癌患者得到的不經(jīng)制備樣品的血漿DNA進(jìn)行同步熒光測(cè)定法測(cè)量的DM濃度(X軸，拷貝數(shù)/ml)之間的相關(guān)性。TBElX緩沖液(pH8.4)，Picogreen逸稀釋到1/20，000。圖13:使用同步焚光測(cè)定法測(cè)量的DNA濃度(Y軸，拷貝數(shù)/ml)與對(duì)從前列腺癌患者得到的不經(jīng)制備樣品的血漿DNA進(jìn)行三波長(zhǎng)或差示熒光測(cè)定法測(cè)量的DNA濃度(X軸，ng/ml)之間的相關(guān)性，TBEIX緩沖液(pH8.4)，Picogreei^稀釋到1/20，000。圖14:<吏用ShimadzuRF535光譜熒光計(jì)(上面的曲線)和SafasXenius光譜熒光計(jì)(下面的曲線)測(cè)量的血漿中DNA的同步光譜，血漿中，Picogreen⑧稀釋到1/20，000，TBEIX緩沖液(pH8,4)。血漿稀釋到1/100。Y軸表示熒光強(qiáng)度(UF),X軸表示發(fā)射波長(zhǎng)(nm)。提供了用于確定l、入2和人3的繪圖方法。圖15和16表示根據(jù)本發(fā)明的方法使用兩個(gè)波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度a、12)進(jìn)行熒光(F)測(cè)定的實(shí)例。參考以下實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明，所述實(shí)施例只用于說明而不產(chǎn)生任何限制。具體實(shí)施例方式實(shí)施例設(shè)備從離心的全血將血漿或血清收集在肝素化的EDTA管中，然后傾析；TBE1X緩沖液(pH8.5)(Tris90mM、硼酸90nM、EDTA2mM);聚乙烯溶血管，丙烯酸器皿；同步熒光測(cè)定計(jì)(ShimadzuRF535讀取器，DR-3數(shù)據(jù)分析器)；Picogreen(dsDNA定量試劑盒，MolecularProbes);標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)DNA。方法A-同步熒光測(cè)定法的原理a)與常規(guī)熒光測(cè)定法有關(guān)的難點(diǎn)通常與常規(guī)的熒光測(cè)定檢測(cè)有關(guān)的主要難點(diǎn)涉及由激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)鄰近引起的瑞利散射。這種影響在分析復(fù)雜的和含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基例如血清的情況中特別嚴(yán)重。在測(cè)定常規(guī)的焚光光鐠時(shí)，一個(gè)單色器進(jìn)行掃描光鐠，而第二個(gè)單色器保持固定。為了產(chǎn)生發(fā)射光i普，選擇激發(fā)波長(zhǎng)(對(duì)于Picogreen為480nm),而選擇再發(fā)射光的單色器會(huì)掃描超過這個(gè)界限，例如480到620nm。在測(cè)量開始時(shí)，如果兩個(gè)單色器設(shè)置為相同的波長(zhǎng)，則發(fā)射單色器接受來自包含樣品的器皿的非常強(qiáng)大的光信號(hào)，所述光信號(hào)與由溶液中化合物分子散射的光相對(duì)應(yīng)。在散射過程中，略多色的光具有至少與激發(fā)光相同的波長(zhǎng)，并且由此妨礙發(fā)射光強(qiáng)度的測(cè)量。實(shí)際上，在熒光現(xiàn)象中，激發(fā)光不是單色的，而是對(duì)應(yīng)于由激發(fā)光單色器選擇的一組波長(zhǎng)單色光照射讀取器皿。然后溶液中樣品發(fā)射的熒光是多色的并且對(duì)應(yīng)于一組波長(zhǎng)。然后通過發(fā)射單色器選擇這種散射光并且進(jìn)行測(cè)量。在兩個(gè)單色器的情況中，激發(fā)光單色器和發(fā)射光單色器設(shè)置為相同的波長(zhǎng)，要測(cè)量?jī)深惞猓⑸涔夂桶l(fā)射光。測(cè)量發(fā)射光的強(qiáng)度是不可能的。這是瑞利干涉。這個(gè)散射光具有比熒光發(fā)射的光大得多的強(qiáng)度，因此能夠?qū)⑵溲谏w，由此使得任何測(cè)定都是隨機(jī)的甚至是不可能進(jìn)行。需要在充分遠(yuǎn)離激發(fā)波長(zhǎng)的波長(zhǎng)測(cè)量發(fā)射的光的強(qiáng)度，以便不受這種干涉的干擾。因此，在這些情況下不可能精確地測(cè)量由非常接近的波長(zhǎng)所衍生的信號(hào)。為了消除常規(guī)熒光中的這種寄生現(xiàn)象，需要-減小光狹縫的寬度，以便減少其覆蓋范圍(盡管這樣會(huì)降低光束的強(qiáng)度并且由此必然地降低分析的靈敏度)；-或者移動(dòng)激發(fā)波長(zhǎng)(盡管這樣降低受激分子的發(fā)熒光率，并且由此同樣地降低分析的靈敏度)。b)同步熒光測(cè)定法的貢獻(xiàn)方法的原理在產(chǎn)生同步光鐠期間，分光熒光計(jì)同時(shí)移動(dòng)兩個(gè)單色器。在這種情況中，產(chǎn)生激發(fā)光鐠或發(fā)射光語不再是問題，而測(cè)量與激發(fā)光和發(fā)射光相對(duì)應(yīng)的一組信號(hào)是問題，激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)彼此相隔恒定的間隔(稱為A入；在目前的情況中為30nm)。優(yōu)點(diǎn)1)消除了由瑞利散射引起的干涉兩個(gè)單色器掃描光傳，同時(shí)以相同的速度相差恒定的間隔移動(dòng)。在這種情況中，不再可能受到瑞利散射的干擾，因?yàn)閮蓚€(gè)單色器永不處于相同的波長(zhǎng)。激發(fā)和發(fā)射光學(xué)系統(tǒng)中狹縫的部分覆蓋可以引起殘余的干涉。然而，這種干涉的強(qiáng)度在分析過程中幾乎是恒定的并且作為光鐠上的線狀背景出現(xiàn)。在測(cè)量特定信號(hào)的高度時(shí)，其通過切線的方法容易地除去。2)減小譜帶寬度如果測(cè)量過程中所用的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)是允許熒光最大收率的波長(zhǎng)，則再發(fā)射的強(qiáng)度處于峰的位置。另一方面，在遠(yuǎn)離這些波長(zhǎng)移動(dòng)時(shí)，再發(fā)射光的強(qiáng)度變?nèi)?，因?yàn)樵诩ぐl(fā)期間吸收的光的強(qiáng)度減小并且在發(fā)射過程中熒光的收率減小。在同步熒光過程中，將兩種現(xiàn)象匯總，使得再發(fā)射光的變化更大。這引起相對(duì)于在常規(guī)光譜中得到的那些，在光譜上的發(fā)射頻帶寬度有所減小。B-在三個(gè)波長(zhǎng)測(cè)量特定的熒光前述論點(diǎn)使得從同步熒光技術(shù)衍生的技術(shù)能夠外推。本發(fā)明人根據(jù)對(duì)許多不同疾病患者得到的數(shù)百份DNA測(cè)量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同步光譜中觀察到的波谷總是存在的，并且特別地，總是在相同波長(zhǎng)具有最小值。因此，在圖1中所示的同步光語上可以看到三個(gè)主要的點(diǎn)兩個(gè)拐點(diǎn)在504nm的和在570nm的"I3"。通過將兩個(gè)點(diǎn)L和13連接來計(jì)算熒光強(qiáng)度"F"(任意單位)，然后通過測(cè)量峰直到直線I！13的交點(diǎn)的高度來測(cè)定在526nm發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度。直線L13下的信號(hào)高度對(duì)應(yīng)于由瑞利散射引起的干擾信號(hào)，其不用測(cè)量。稱為切線技術(shù)的這種技術(shù)使得能夠消除由瑞利散射引起的背景噪聲，并且給出熒光信號(hào)的非常好的近似值。因此，本發(fā)明人由此推斷，有可能開發(fā)僅利用這三個(gè)熒光發(fā)射波長(zhǎng)的新技術(shù)。因此，進(jìn)行以下測(cè)量發(fā)射L:入，產(chǎn)472nm入產(chǎn)502認(rèn)發(fā)射12:入，2=496nm入2=526nm發(fā)射13:入，3=538nm入3=568nm然后，由于主要讀數(shù)波長(zhǎng)U2=526nm)的瑞利效應(yīng)，需要外推熒光值。基于測(cè)量結(jié)果L和13計(jì)算這個(gè)熒光。因?yàn)闊晒夥宀皇峭昝赖貙?duì)稱的，根據(jù)下式計(jì)算熒光IR:(0.6xU+(0.4xI3)=IR然后按照以下方式基于主要波長(zhǎng)的測(cè)量結(jié)果L計(jì)算對(duì)于DM"F"為特異性的熒光F=I2-IR圖14表明，確定熒光的這種方法可以與所用的熒光分光計(jì)無關(guān)而通用。C-操作模式Picogreen⑧的制備將在ethynol/TBE的50%混合物(v/v)中稀釋50倍的Picogreen的儲(chǔ)備溶液在Eppendorf⑧管中等分(120u1)，然后在避光的情況下儲(chǔ)存在-20'C的冷卻器中。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將儲(chǔ)存在冷卻器(-20。C)中的等分樣品的血漿解凍，并且使其回溫到實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境溫度(15-25。C)，然后在TBEiX緩沖液中稀釋(10-300倍)，最終體積-450ja1)。在分析之前將這些稀釋物儲(chǔ)存在冰中。用滴管吸取40ml的TBE1X緩沖液，然后向其中加入即時(shí)解凍的100ju1Picogreen(產(chǎn)生20，000的最終稀釋系數(shù))，將混合物在避光的情況下儲(chǔ)存在水中。在開始測(cè)量之前使焚光分光計(jì)啟動(dòng)至少20到30分鐘，并且如下編程-在激發(fā)過程中，單色器從400掃描到600nm;-在發(fā)射過程中，單色器從430掃描到630nm。為了進(jìn)行測(cè)量，采用以下操作-量取1.9ml稀釋到1/20,000的Picogreen逸，并且轉(zhuǎn)移到工作臺(tái)上的避光的溶血管中；-然后加入100ju1的血漿/血清稀釋物(最終容積=2ml)，將混合物渦旋8-12秒，并且置于工作臺(tái)上2-3分鐘，之后將混合物快速泵入到丙烯酸小池中，以便開始記錄光譜?？偸歉鶕?jù)含有Picogreer^的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)DNA獲得標(biāo)準(zhǔn)范圍，選擇的范圍點(diǎn)是2.5ng;25ng和50ng/ml。N.B.應(yīng)該在測(cè)量之前至少24小時(shí)制備TBE1X緩沖液，并且應(yīng)該保持在工作臺(tái)上，這樣顯著地減少瑞利散射現(xiàn)象。D-結(jié)果A-實(shí)驗(yàn)條件的完善1-緩沖液的選擇由于Picogreer^在DM的雙螺旋結(jié)構(gòu)中配合在堿基之間，該緩沖液的這種性質(zhì)會(huì)影響熒光信號(hào)。因此試驗(yàn)了在實(shí)驗(yàn)室中通常能夠找到的各種類型的緩沖液。-TBEIX緩沖液(三(羥基甲基胺)氨基甲烷1M，EDTA0.1raM，pH=7.5):使用Picogreen⑧的常規(guī)緩沖液-10mM磷酸二氫鉀緩沖液，pH=7.8:磷酸鹽緩沖液具有顯著的熒光，使其不可能以充分的精度測(cè)量存在于標(biāo)準(zhǔn)樣品或血漿中的DNA的濃度。-TBE1X緩沖液(90mM三(羥基甲基胺)氨基甲烷，90mM硼酸，2mMEDTA，pH=8.5);緩沖液TBEIX具有輕微殘留的熒光，但是特別的是，它在試驗(yàn)波長(zhǎng)沒有熒光峰。因此，將其用在本發(fā)明的分析中是有利的。2-pH的選擇在不同pH對(duì)前述三種緩沖液進(jìn)行試驗(yàn)5、5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5。這些區(qū)域中pH的改變不改變焚光光譜。3-試劑稀釋度的選擇Picogreen在極其稀釋的介質(zhì)中進(jìn)行所述熒光測(cè)定技術(shù)，以便限制常規(guī)的干涉現(xiàn)象自動(dòng)抑制作用、猝滅、衰減和竟?fàn)?，還包含瑞利散射。本發(fā)明人測(cè)定了給出最強(qiáng)烈信號(hào)的試劑的最低濃度。試驗(yàn)了Picogreer^的以下濃度:1/100、1/250、1/500、1/1，000、1/2,000、1/4,000、1/8,000、1/12,000、1/20,000。更弱的稀釋度產(chǎn)生強(qiáng)度更低的信號(hào)。過于強(qiáng)的稀釋度給出的信號(hào)可重復(fù)性差得多并且在試驗(yàn)的DNA濃度具有不成比例的生長(zhǎng)。從1/4，000的稀釋度開始信號(hào)變得可以檢測(cè)到，但是該技術(shù)缺乏靈敏度。在這個(gè)稀釋度，不可能將對(duì)照血漿(圖2)和患病患者的血漿(圖3)區(qū)別開來。發(fā)現(xiàn)1/20,000的Picogreei^稀釋度得到最佳的結(jié)果。在這個(gè)試劑稀釋度，該技術(shù)表現(xiàn)為靈敏的和線性的，并且也可能在對(duì)照血漿(圖4)和患病患者的血漿(圖5)之間進(jìn)行區(qū)分。4-血漿稀釋度的選擇為了避免與生物學(xué)基質(zhì)有關(guān)的干擾，重要的是使用盡可能強(qiáng)烈稀釋的樣品來進(jìn)行試驗(yàn)。使用了稀釋到1/20、1/50/1/100、1/150、1/200、1/300、1/400的血漿。使用稀釋到1/100的血漿得到最佳結(jié)果。即使在乳白色的或者混濁的血漿的情況中仍沒有觀察到與血漿的濁度有關(guān)，或者與溶血、黃疸或高蛋白血有關(guān)的混濁(haze)。這個(gè)稀釋度允許以充分的精度測(cè)量對(duì)照血漿。5-激發(fā)光和發(fā)射光之間的波長(zhǎng)差的選擇Picogreer^的生產(chǎn)商建議的峰激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別是485和530nm。這些波長(zhǎng)以及它們的45nm的差的選擇可能是由于分子的性質(zhì)，但是也可能是由于與讀取器皿中光的散射有關(guān)的材料應(yīng)力。45nm差的選擇可能是來自于與大多數(shù)熒光測(cè)定計(jì)有關(guān)的技術(shù)應(yīng)力，所述大多數(shù)熒光測(cè)定計(jì)只能在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)相差40nm時(shí)限制瑞利干涉。如果情況是這樣，則它們不會(huì)是最大熒光波長(zhǎng)而是最佳靈敏度和最小干涉之間的折中波長(zhǎng)。使用同步熒光，在顯著地限制瑞利干涉的同時(shí)，還允許使用最大熒光波長(zhǎng)相差小于10nm的分子。因此，試驗(yàn)了20、25、30、35、40、45、50和55nm的差。在激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)之間的差為30nm時(shí)得到最佳的靈敏度(圖6)。6-Picogreer^隨時(shí)間的穩(wěn)定性測(cè)量的可重復(fù)性如下<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>該技術(shù)的精確度適用于臨床生物學(xué)。b-同步熒光技術(shù)的性質(zhì)1-精確度精度包括可重復(fù)性和可再現(xiàn)性試驗(yàn)?？芍貜?fù)性通過在同一天使用相同的試劑制備物對(duì)各種類型的樣品測(cè)量10次進(jìn)行試驗(yàn)。本發(fā)明人使用不同濃度的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品以及兩個(gè)患者血漿樣品第一個(gè)是冷凍一周的，第二個(gè)是新鮮的血漿。表示為CV%(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均數(shù))*100)的結(jié)果匯集在下表中<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>可再現(xiàn)性通過使用每天重構(gòu)的試劑在20個(gè)不同的日期分析20次進(jìn)行該試驗(yàn)。本發(fā)明人使用不同濃度的三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品以及以等分樣品冷凍的血漿樣品。結(jié)果匯集在以下表中<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>2-準(zhǔn)確性根據(jù)以下方法進(jìn)行試驗(yàn)。通過光度計(jì)技術(shù)(260nm)分析兩個(gè)純化的DNA樣品(通過RM或蛋白質(zhì)的存在來校正)。這些測(cè)定值用作分析的參照。然后通過同步熒光測(cè)定法的方法分析這些純化的DNA樣品。下表表示方法的精確度，表示為相對(duì)于光度測(cè)量法測(cè)定的DNA的百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>3-檢測(cè)閾值根據(jù)以下方法計(jì)算檢測(cè)閾值。測(cè)量只含TBE1X緩沖液的20個(gè)實(shí)例。然后計(jì)算這十次測(cè)定的平均值，并為這個(gè)平均值加上得到的測(cè)量值的三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。這樣測(cè)量的閾值是3.5ng/ml。4-靈敏度閾值可以以20。/。的充分精度檢測(cè)到的第一個(gè)DNA濃度是4ng/ml。發(fā)現(xiàn)它是相對(duì)令人滿意的。健康受試者的血漿濃度是大約2到6ng/ml的循環(huán)DNA。在醫(yī)院中，病理學(xué)數(shù)值比這些正常值高得多。5-線性試驗(yàn)從4ng/ml直到至少5，000ng/ml的DNA，該技術(shù)都是線性的(圖7)。c-涉及測(cè)量三個(gè)焚光點(diǎn)的技術(shù)的性質(zhì)通過這種方法得到的結(jié)果在所有的點(diǎn)都與同步熒光技術(shù)的結(jié)果相同(圖13)。結(jié)論這些第一試驗(yàn)表明，同步熒光測(cè)定方法或涉及測(cè)量三個(gè)熒光點(diǎn)的方法是可用于臨床生物學(xué)的可靠的技術(shù)。以下將這些結(jié)果與定量PCR的結(jié)果進(jìn)行比較。d-在各種癌癥(前列腺癌、結(jié)腸癌)中通過同步熒光測(cè)定方法測(cè)定循環(huán)的DNA在第一階段，對(duì)相同的DM提取物進(jìn)行試驗(yàn)，以便關(guān)于純化的提取物驗(yàn)證該方法，并且檢驗(yàn)其相對(duì)于參考分析(定量PCR)的相關(guān)性。然后，在第二階段，直接對(duì)于患者的血漿驗(yàn)證這個(gè)方法，總是通過與參照技術(shù)進(jìn)行對(duì)比來驗(yàn)證。l-在各種癌癥中使用試劑盒對(duì)于提取的DNA進(jìn)行PCR對(duì)熒光測(cè)定法的相關(guān)性的檢驗(yàn)前列腺癌相關(guān)性是優(yōu)異的，但是在低DNA濃度觀察到點(diǎn)群的變形(圖8)。通過圖9中的結(jié)果之間的比率圖對(duì)這個(gè)變形進(jìn)行分析。觀察到點(diǎn)群的明顯變形。在基因組的100拷貝/ml的數(shù)值以下，PCR技術(shù)似乎是缺乏靈敏度，而同步熒光測(cè)定法則與之相反。在基因組的100拷貝/ml的閾值以上，相關(guān)性保持為優(yōu)異的(圖10)。處于不同階段的前列腺癌和結(jié)腸癌對(duì)得自前列腺癌或結(jié)腸癌的患病患者的樣品進(jìn)行第二系列的測(cè)量。與前述系列中一樣，在定量PCR技術(shù)中發(fā)現(xiàn)基因組的100拷貝/ml的閾值(圖11)。2-關(guān)于血漿DNA的PCR與熒光測(cè)定法的相關(guān)性該研究還在沒有經(jīng)過預(yù)加工的生物樣品上進(jìn)行驗(yàn)證。本發(fā)明人使用得自前列腺癌或結(jié)腸癌的患者的冷凍血漿。更特別地使用了基因組的拷貝數(shù)>100拷貝數(shù)/ml的樣品(n=32)并且直接在血漿中量化隠(圖12)。觀察到相關(guān)性是優(yōu)異的，并且與使用提取的DNA得到的相關(guān)性處于相同的水平。e-在各種癌癥(前列腺癌、結(jié)腸癌)中通過涉及三個(gè)熒光點(diǎn)的方法測(cè)定循環(huán)的DNA同時(shí)使用同步熒光測(cè)定法進(jìn)行測(cè)量，本發(fā)明人通過涉及三個(gè)熒光點(diǎn)的方法分析每個(gè)血漿中的循環(huán)DNA濃度，而沒有事先對(duì)DNA進(jìn)行預(yù)加工(圖13)。發(fā)現(xiàn)相關(guān)性是優(yōu)異的并且與同步熒光所得到的完全相同。因此，用于測(cè)定循環(huán)DNA的兩種新技術(shù)是完全等價(jià)的并且與參照技術(shù)(定量PCR)完美地相關(guān)。討論定量PCR目前是用于測(cè)量循環(huán)DNA的量的最廣泛使用的方法。然而，這種方法相對(duì)昂貴，專業(yè)化并且不適合在醫(yī)療急癥中心使用。由于其特別的原理，PCR非常顯著地?cái)U(kuò)增存在于樣品中的所有DNA。在將得自DNA濃度呈現(xiàn)輕微改變的患者的樣品之間進(jìn)行區(qū)分是極其困難的，因?yàn)樗鼈円詭缀跸嗤谋壤龜U(kuò)增。然而，在這種情況中，PCR技術(shù)缺乏靈敏度。需要患者呈現(xiàn)DNA濃度的明顯增加，以便將其與對(duì)照進(jìn)行區(qū)分，或者將其二者彼此區(qū)分。此外，在定量PCR中，在富含酶和大分子(引物、純化的DNA片斷、熒光團(tuán)等)的復(fù)雜的反應(yīng)介質(zhì)中測(cè)量焚光，有在分析中誘導(dǎo)顯著干擾的危險(xiǎn)。眾所周知，介質(zhì)濃度越大，則熒光讀數(shù)的能力越小。在這種情況中，可能的主要的干擾類型如下-自動(dòng)抑制作用。在高濃度時(shí)可能有熒光的自動(dòng)抑制作用，是由于分子之間的碰撞次數(shù)增加(所述碰撞消耗接收的能量)，或者是由于形成了不產(chǎn)生熒光的聚合物。-熒光或猝滅的抑制。在高度濃縮或非均質(zhì)的復(fù)雜介質(zhì)中，有熒光或猝滅阻抑現(xiàn)象的危險(xiǎn)，這是由于發(fā)熒光的分子與溶劑或另一種溶質(zhì)之間的相互作用引起的。熒光的收率和/或熒光的持續(xù)時(shí)間減小。從使用的觀點(diǎn)，這意味著在存在抑制性物質(zhì)時(shí)化合物的熒光性較小。這在分析沒有預(yù)先純化的生物培養(yǎng)基中進(jìn)行分析的過程中是一個(gè)缺點(diǎn)。另外，消光并不總是均勻的。-衰減(光致漂白)。這是熒光染料的熒光的損失，所述損失是由于導(dǎo)致分子被破壞的光的過度激發(fā)引起的，或者是由于通過其反應(yīng)性形式與另一個(gè)分子偶聯(lián)引起反應(yīng)的缺乏而引起的。-竟?fàn)?。這是由于特異性物質(zhì)或玻璃器皿的污染物的自動(dòng)熒光引起的。在定量PCR中，如果在與同步熒光技術(shù)大約相同的濃度分析DNA，則其中熒光團(tuán)要濃度更大l，OOO倍。另外，引物的分子和聚合酶的分子具有充分的濃度來使它們干涉發(fā)射的光。介質(zhì)中分子的這種高濃度還促進(jìn)與溶液中分子散射入射光有關(guān)的瑞利效應(yīng)。激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的相差越小(只間隔45nm)，則靈敏度越高，在選擇燈的強(qiáng)度和選擇讀取狹縫方面導(dǎo)致顯著的技術(shù)限制。所有這些因素使得本發(fā)明人尋找基于在稀釋得多的介質(zhì)中進(jìn)行分析的新技術(shù)。常規(guī)的熒光技術(shù)的選擇顯著地提高分析的靈敏度并且避免了提取和擴(kuò)增的階段，所述提取和擴(kuò)增必然伴隨干涉、技術(shù)可變性和處理誤差的最大危險(xiǎn)。選擇同步熒光測(cè)定法確保了分析的優(yōu)異的特異性，并且通過允許使用最大激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)允許進(jìn)一步提高分析靈敏度。實(shí)施這一方法顯示，在同步光鐠中存在三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。對(duì)所有這些數(shù)據(jù)的分析還向本發(fā)明人保證了這些點(diǎn)的穩(wěn)定性。它們總是存在的并且總是處于相同的波長(zhǎng)。因此，通過只測(cè)量三個(gè)熒光強(qiáng)度并且開發(fā)用于精確測(cè)量度與DNA為特異性的熒光的計(jì)算式來開發(fā)新的測(cè)量策略。這種新的技術(shù)具有與同步熒光測(cè)定法中實(shí)現(xiàn)的同樣優(yōu)異的分析性質(zhì)，特別是在其靈敏度方面。更好的DM分析靈敏度允許在患者的隨訪中更早的發(fā)現(xiàn)率升高。在較年長(zhǎng)的受試者(〉65歲)的情況中尤其是這樣，其中(數(shù)據(jù)未表示)似乎是正常值隨年齡遞增。這可能會(huì)允許這種分析的應(yīng)用范圍得以擴(kuò)展。開發(fā)的這種技術(shù)是非常令人滿意的。它們是非常精確的并且分析范圍非常符合臨床要求。另外，它們與最通常使用的技術(shù)(實(shí)時(shí)定量PCR)有非常好的相關(guān)性。實(shí)現(xiàn)的各種相關(guān)性證明了我們的結(jié)果具有優(yōu)異的臨床關(guān)聯(lián)性?；蚪M的100拷貝數(shù)/ml的閾值接近于目前是定量PCR中病理學(xué)測(cè)定閾值的基因組的150拷貝數(shù)/ml的閾值。這近似地對(duì)應(yīng)于我們的技術(shù)的基因組的15,000拷貝數(shù)/ml，這是在文獻(xiàn)中也發(fā)現(xiàn)的數(shù)值。因此，本發(fā)明人能夠確定兩種用于省略DNA提取和擴(kuò)增階段的新技術(shù)，并且這允許顯著地縮短分析時(shí)間到幾分鐘。參考文獻(xiàn)AnkerP.等人，DetectionofCirculatingTumourDNAintheblood(plasma/serum)ofCancerPatients.CancerMetastasisRev1999，18:65-73.BoddyJ丄等人，ProspectiveStudyofQuantitationofplasmaDNALevelsinDiagnosisofMalignantversusBenignProstateDisease.ClinicalCancerRes2005，111394-1399.ChangCP.Elevatedcell—freeserumDNAdetectedinpatientswithmyocardialinfarction.ClinChimActa2003，327:95-101.DeKokJB等人，DetectionofTumourDNAinSerumofColorectalCancerPatients.ScandJLabClinInvest1997，57:601-4.FournieG.J\等人,PlasmaDNAasaMarkerofCancerousCellDeath:InvestigationinPatientsSufferingfromLungCancerinNudeMiceBeamingHumanTumours.CancerLetters1995,91:221-227.GalS.等人，QuantitationofCirculatingDNAinSerumofBreastCancerPatientsbyRealTimePCR.BritishJournalofCancer2004，90:1211-1215.GreenstockC.L.等人，Inter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(zhǎng)度小于l,OOO個(gè)核苷酸的核酸分子的設(shè)備全文摘要本發(fā)明涉及用于測(cè)定存在于樣品中的核酸的量的方法，其中-向樣品中加入熒光團(tuán)，-測(cè)量分別響應(yīng)于至少兩個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)的光刺激由熒光團(tuán)在至少兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射的熒光強(qiáng)度，和-從測(cè)量的熒光強(qiáng)度推導(dǎo)存在于樣品中的核酸的量。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101522917SQ200780036971公開日2009年9月2日申請(qǐng)日期2007年8月10日優(yōu)先權(quán)日2006年8月11日發(fā)明者M(jìn)·孔蒂,M·薩科,Ms·巴赫,N·德拉科特申請(qǐng)人:生物量子公司;生物量子公司;公共救濟(jì)事業(yè)局-巴黎醫(yī)院