專利名稱：分析物和核酸的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了檢測樣品中的至少一種分析物和至少一種核酸的方 法。本發(fā)明還提供了用于實施所述方法的試劑。
背景技術(shù)：
包括Western印記、ELISA等各種檢測細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)的方 法是本領(lǐng)域中已知的。包括RT-PCR等各種檢測細(xì)胞裂解物中的核酸的方 法也是本領(lǐng)域中已知的。然而，樣品中所檢測的蛋白質(zhì)和所檢測的核酸 的相對量難于比較，這是因為這些樣品通常是分別地、以不同方法制備 的。另外，用于蛋白質(zhì)和核酸的不同檢測方法也會給關(guān)聯(lián)它們的相對量 帶來困難。發(fā)明內(nèi)容在各種實施方式中，提供了檢測細(xì)胞中的至少一種目標(biāo)分析物和至 少一種目標(biāo)核酸的方法。在各種實施方式中，提供了以下的方法，所述 方法包括在多功能性裂解緩沖液中裂解細(xì)胞從而產(chǎn)生細(xì)胞裂解物、利 用近感檢測測定法(proximity detection assay)檢測所述細(xì)胞裂解物中的至少一種目標(biāo)分析物、和利用核酸定量撿測測定法檢測所述細(xì)胞裂解物中 的至少一種目標(biāo)核酸。在各種實施方式中，檢測至少一種目標(biāo)分析物和 檢測至少一種目標(biāo)核酸是在同一容器中進(jìn)行的。在各種實施方式中，提供了以下的方法，所述方法包括在多功能6性裂解緩沖液中裂解細(xì)胞從而產(chǎn)生細(xì)胞裂解物，將所述細(xì)胞裂解物與以
下物質(zhì)(i)、 (ii)和(iii)溫育(i)至少一個近感檢測探針組，其中每個近感檢 測探針組包括至少兩種近感檢測探針，并且其中每種近感檢測探針包含 至少一種分析物結(jié)合部分和至少一種寡核苷酸部分；(ii)至少一種夾板寡
核苷酸(splint oligonucleotide);和(iii)至少一種連接酶，由此形成至少一個 經(jīng)連接的近感檢測探針組；將所述細(xì)胞裂解物與至少一種蛋白酶溫育； 檢測所述至少一個經(jīng)連接的近感檢測探針組；和檢測至少一種目標(biāo)核酸。
在各種實施方式中，提供了以下的方法，所述方法包括在多功能 性裂解緩沖液中裂解細(xì)胞從而產(chǎn)生細(xì)胞裂解物，將所述細(xì)胞裂解物與至 少一個近感檢測探針組溫育，其中每個近感檢測探針組包括至少兩種近 感檢測探針，并且其中每種近感檢測探針包含至少一種分析物結(jié)合部分 和至少一種寡核苷酸部分，由此形成至少一個經(jīng)雜交的近感檢測探針組； 將所述細(xì)胞裂解物與至少一種蛋白酶溫育；檢測所述至少一個經(jīng)雜交的 近感檢測探針組；和檢測至少一種目標(biāo)核酸。
在各種實施方式中，提供了多功能性裂解緩沖液。在各種實施方式 中，多功能性裂解緩沖液包含選自NDSB-201、LDAO、CHAPS、DEDTAB、 Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一種化學(xué)品。
在各種實施方式中，提供了用于檢測至少一種目標(biāo)分析物和至少一 種目標(biāo)核酸的試劑盒。在各種實施方式中，試劑盒包含含有至少一種化 學(xué)品的至少一種多功能性裂解緩沖液，所述至少一種化學(xué)品選自 NDSB-201、 LDAO、 CHAPS、 DEDTAB、 Zwittergent 3-10和CAPSO。
在各種實施方式中，提供了包含裂解液的組合物，其中所述裂解液 包含多功能性裂解緩沖液和至少一個近感檢測探針組，所述多功能性裂 解緩沖液含有選自NDSB-201 、LDAO、CHAPS、DEDTAB、Zwittergent 3-10
和CAPSO中的至少一種化學(xué)品。


圖1顯示了實施例1中所述的近感連接測定法的結(jié)果。其中給出了 每種反應(yīng)的循環(huán)閾值數(shù)("平均CT")。圖2顯示了對于實施例1所述的TaqMan —步qRT-PCR反應(yīng)的熒光 的相對增力n(ARn)對循環(huán)數(shù)的圖。圖2中只顯示了FAM層。
圖3顯示了對于實施例1所述的實驗的循環(huán)閾值數(shù)對平板定位(即 TaqMan—步qRT-PCR反應(yīng))的圖。圖3中只顯示了FAM層。
圖4顯示了對于實施例1所述的TaqMan —步qRT-PCR反應(yīng)的熒光 相對增加(ARn)對循環(huán)數(shù)的圖。圖4中只顯示了 VIC層。
圖5顯示了對于實施例1所述的實驗的循環(huán)閾值數(shù)對平板定位(即 TaqMan —步qRT-PCR反應(yīng))的圖。圖5中只顯示了 VIC層。
圖6顯示了如實施例2所述，在含有蛋白酶或不含有蛋白酶的緩沖 液Na、緩沖液Nb和緩沖液Nc中制備的裂解物的瓊脂糖凝膠電泳。
圖7顯示了對于實施例2所述的實驗的循環(huán)閾值數(shù)對平板定位(即 TaqMan —步qRT-PCR反應(yīng))的圖。
圖8顯示了如實施例3所述，使用各種化學(xué)品所制備的裂解物的瓊 脂糖凝膠電泳。泳道1 8分別是NMP、Mackernium、Empigen、NDSB-201 、 Zwittergent 3-10、 Zwittergent 3-14、 TMACL禾B DDMAB。泳道9 16分 別是CAPSO、 CHAPS、 LDAO、 Sarkosyl、 CTAB、 DEDTAB、 DLS和 DTAB。
圖9顯示了如實施例3所述，使用2% NDSB-201或5 mM CAPSO
所制備的裂解物的各種稀釋液的瓊脂糖凝膠電泳。
圖10顯示了如實施例4所述，利用了緩沖液N裂解物的各種稀釋液 的平均循環(huán)闞值數(shù)("平均CT")對近感連接測定的圖。
圖11顯示了如實施例4所述，在存在或不存在核糖核酸酶抑制劑的 情況下在37。C溫育了不同時間的細(xì)胞裂解物的瓊脂糖凝膠電泳。
圖12顯示了如實施例4所述，在含有Tween和不含有Tween的緩 沖液Na、緩沖液Nb和緩沖液Nc中的細(xì)胞裂解物的瓊脂糖凝膠電泳。
圖13顯示了如實施例4所述，在緩沖液N中與各種濃度的核糖核酸 酶A溫育的細(xì)胞裂解物的瓊脂糖凝膠電泳。
圖14顯示了如實施例4所述，在各種處理條件下、緩沖液N中的細(xì) 胞裂解物的SDS-丙烯酰胺凝膠電泳。
8圖15顯示了如實施例5所述，在緩沖液Na中與各種蛋白酶溫育的 細(xì)胞裂解物的瓊脂糖凝膠電泳。
圖16顯示了如實施例5所述，在含0.2%LDAO的緩沖液Na中與各 種蛋白酶溫育的細(xì)胞裂解物的瓊脂糖凝膠電泳。
圖17顯示了如實施例5所述，在緩沖液Nc中與各種蛋白酶溫育的 細(xì)胞裂解物的瓊脂糖凝膠電泳。
圖18顯示了用于本文所述的某些近感檢測測定法/目標(biāo)核酸檢測測 定法的非限制性的示例性作業(yè)流程圖。在該作業(yè)流程設(shè)計中，在多重擴(kuò) 增反應(yīng)中同時檢測PDA產(chǎn)物和mRNA。
圖19顯示了用于本文所述的某些近感檢測測定法/目標(biāo)核酸檢測測 定法的非限制性的示例性作業(yè)流程圖。在該作業(yè)流程設(shè)計中，在蛋白酶 處理前取出部分樣品以用于檢測PDA產(chǎn)物，而剩余樣品采用蛋白酶處理 并用于mRNA的檢測。
圖20顯示了獲得自為檢測在含有0.1。/。魚源明膠(fish gdatin)或 1%BSA的緩沖液中的各種濃度的VEGF而進(jìn)行的近感連接測定法(PLA) 的示例性數(shù)據(jù)。以平均循環(huán)閾值(平均CT)對pM VEGF的形式對示例性 數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。
圖21顯示了獲得自為檢測在含有0.1%魚源明膠和各種核酸封閉劑 的緩沖液中的各種濃度的VEGF而進(jìn)行的近感連接測定(PLA)的示例性 數(shù)據(jù)。A圖顯示了獲得自包含多聚A、多聚dC、多聚dC+多聚dG、和 在4。C儲存至少2周的多聚A(對照)的近感連接測定法的示例性數(shù)據(jù)。B 圖顯示了獲得自包含多聚A、多聚dC和經(jīng)剪切的小牛胸腺DNA(CFD)、 和在4'C儲存至少2周的多聚A(對照)的近感連接測定的示例性數(shù)據(jù)。以 平均循環(huán)閾值(平均CT)對pM VEGF的形式對示例性數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。
圖22顯示了獲得自為利用含有脫氧尿嘧啶(dU)的夾板寡核苷酸來檢 測各種濃度的MCP-1而進(jìn)行的近感連接測定法的示例性數(shù)據(jù)。所述測定 法以下述方式進(jìn)行在檢測連接產(chǎn)物之前，采用或不采用尿嘧啶-DNA糖 基化酶處理，以及經(jīng)過(虛線)或不經(jīng)過(實線)凍融循環(huán)。以平均循環(huán)閾值 (平均CT)對pMMCP-l的形式對示例性數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。
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具體實施例方式
本文所用的各部分標(biāo)題只是出于組織的目的，而不應(yīng)被理解為是對 所述主題的限制。將本文所引用的包括(但不限于)專利、專利申請、文章、 書籍和論文在內(nèi)的所有文獻(xiàn)或文獻(xiàn)的一部分的全部內(nèi)容都由此特地以參 考方式引入本文以用于任何目的。在一個或多個所引入的文獻(xiàn)或文獻(xiàn)的 一部分所定義的術(shù)語與該術(shù)語在本申請中的定義相抵觸時，以本申請為 準(zhǔn)。
除非特別聲明，否則單數(shù)的使用包括了復(fù)數(shù)的情況。除非特別聲明， 否則詞語"一個"或"一種"是指"至少一個或至少一種"。除非特別聲 明，否則"或"的使用是指"和/或"。多項從屬權(quán)利要求的情況中所使用 的"或"只表示擇一選擇。短語"至少一個或至少一種"的含義等同于 短語"一個或多于一個"或"一種或多于一種"的含義。此外，術(shù)語"包 括"的使用與如"包括有"和"包括了"等其它形式，不具有限制性。 另外，除非特別聲明，否則如"元件"或"成分"等術(shù)語既可以包括含
有一個單元的元件或成分，也可以包括含有多于一個的單元的元件或成 分。
在本說明書中，除非特別聲明，否則對于檢測"一種"或"一個" 部分(例如目標(biāo)分析物)的論述，涵蓋一種以上或一個以上的該部分。 本文所討論的所有的范圍均包括端點以及端點之間的所有的值。 定義
術(shù)語"核苷酸堿基"是指一種或多種經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的芳香環(huán)。 在某些實施方式中，所述一種或多種芳香環(huán)含有至少一個氮原子。在某 些實施方式中，所述核苷酸堿基能夠與合適的互補(bǔ)核苷酸堿基形成
Watson-Crick氫鍵(沃森-克里克氫鍵)和/或Hoogsteen氫鍵(霍氏氫鍵)。示 例性的核苷酸堿基及其類似物包括但不限于，天然存在的核苷酸堿基， 例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶，和天然存在的核苷 酸堿基的類似物，例如7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮鳥嘌呤、 7隱脫氮-8-氮腺嘌昤、N6-A2-異戊烯基腺嘌呤(6iA)、 N6-A2-異戊烯基-2-甲
10硫代腺嘌呤(2ms6iA)、 N2-二甲基鳥嘌呤(dmG)、 7-甲基鳥嘌呤(7mG)、肌 苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黃嘌 呤、假尿嘧啶核苷、假胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、異胞嘧啶、 異鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、2-硫代嘧啶、6-硫代鳥嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、 4-硫代尿嘧啶、0《-甲基鳥嘌呤、M-甲基腺嘌呤、C^-甲基胸腺嘧啶、5,6-二氫胸腺嘧啶、5，6-二氫尿嘧P定、吡唑并[3,4-D]瞎啶(見，例如美國專利 6,143,877號和6,127,121號以及PCT公布申請WO 01/38584)、亞乙烯基 腺嘌呤(ethenoadenine)、諸如硝基fl引哚和4-甲基fl引哚等H引哚類物質(zhì)、和諸 如硝基吡咯等吡咯類物質(zhì)。某些示例性核苷酸堿基可參見Fasman, 1989, Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology,第385-394頁， CRC Press, Boca Raton, Fla.以及其中所引的參考文獻(xiàn)。
術(shù)語"核苷酸"是指包含有連接到糖的C-l'碳的核苷酸堿基的化合 物，所述糖例如是核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖、和它們的糖類似物。 術(shù)語核苷酸還包含核苷酸類似物。所述糖可以是被取代的，也可以是未 被取代的。被取代的核糖包括，但不限于，其中一個或多于一個的碳原 子(例如2'-碳原子)被Cl、 F、 -R、 ~OR、 -NR2或鹵素基團(tuán)中的一種或多 于一種的相同或不同的取代基取代的核糖，其中每個R獨立地為H、d-C6 的烷基或Cs-d4芳基。示例性的核糖包括，但不限于，2'-(Cl-C6)烷氧基 核糖、2'-(C5-C14)芳氧基核糖、2'，3'-二脫氫核糖、2'-脫氧-3'-鹵代核糖、 2'-脫氧-3'-氟代核糖、2'-脫氧-3'-氯代核糖、2'-脫氧-3'-氨基核糖、2'-脫氧 -3'-(Cl-C6)垸基核糖、2'-脫氧-3'-(Cl-C6)烷氧基核糖和2'-脫氧-3'-(C5-C14) 芳氧基核糖、核糖、2'-脫氧核糖、2',3'-二脫氧核糖、2'-鹵代核糖、2'-氟 代核糖、2'-氯代核糖和2'-烷基核糖，例如2'-0-甲基，4，-a-異頭核苷酸、 l'-a-異頭核苷酸、2'-4'-和3'-4'-連接的和其它"鎖定的"或"LNA"，雙環(huán)糖 修飾物(例如見PCT公開申請WO 98/22489號、WO 98/39352號和WO 99/14226號)。多核苷酸中的示例性LNA糖類似物包括但不限于以下結(jié) 構(gòu)2'-4' LNA 3'-4' LNA
其中B可以是任何核苷酸堿基。
核糖的2'-位或3'-位上的修飾包括但不限于氫、羥基、甲氧基、乙氧 基、烯丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、甲氧基乙基、烷氧基、苯 氧基、疊氮基、氨基、垸基氨基、氟基、氯基和溴基。核苷酸包括但不限 于天然D型光學(xué)異構(gòu)體以及L型光學(xué)異構(gòu)體形式(例如見Garbesi (1993) Nucl. Acids Res. 21:4159-4165; Fujimori (1990) J. Amer. Chem. Soc. 112:7435; Urata， (1993) Nucleic Acids Symposium Ser. No. 29:69-70)。當(dāng)所 述核苷酸堿基是如A或G等嘌呤時，則核糖連接到該核苷酸堿基的N9-位。當(dāng)所述核苷酸堿基是如C、 T或U等嘧啶時，則該戊糖連接到該核 苷酸堿基的NL位，但是假尿嘧啶核苷除外，在假尿嘧啶核苷中，戊糖連 接到尿嘧啶核苷酸堿基的C5位(例如見，Komberg和Baker, (1992) DiVJ i e/ /fc加'ow， 第二版，F(xiàn)reeman, San Francisco, CA)。
核苷酸的一個或多于一個的戊糖碳可以被具有下式的磷酸酯取代
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其中cx是0 4的整數(shù)。在某些實施方式中，a是2并且該磷酸酯連接到 戊糖的3'-或5'-碳。在某些實施方式中，所述核苷酸是其中核苷酸堿基為 嘌呤、7-脫氮嘌呤、嘧啶、或它們的類似物的核苷酸。"核苷酸5'-三磷酸 酯"是指在5'-位具有三磷酸酯基的核苷酸，并且有時表示為"NTP"、或 "dNTP"和"ddNTP"從而具體指出核糖的結(jié)構(gòu)特征。該三磷酸酯基可以 包括取代各種氧的硫取代基，例如a-硫代-核苷酸5'-三磷酸酯。關(guān)于核苷 酸化學(xué)的綜述，可見例如Shabarova， Z.和Bogdanov， A, v4dva"ced Ogam'cC7ze油^y o/iVwc/e/c爿c魄VCH, New York, 1994。
術(shù)語"核苷酸類似物"是指其中核苷酸的戊糖和/或核苷酸堿基和/ 或一種或多于一種的磷酸酯可以被其相應(yīng)的類似物替代的實施方式。在 某些實施方式中，示例性的戊糖類似物是上述的戊糖類似物。在某些實 施方式中，核苷酸類似物具有上述的核苷酸堿基類似物。在某些實施方 式中，示例性的磷酸酯類似物包括但不限于烷基磷酸酯、甲基磷酸酯、 氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二 硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、酰苯胺磷酸酯 (phosphoroanilidate)、 氨基磷酸酯(phosphoroamidate)、 含硼磷酸酉旨 (boronophosphate)等，并且可以包括相關(guān)的反離子。
包括在"核苷酸類似物"定義中的還有可以聚合成多核苷酸類似物 的核苷酸類似物單體，所述多核苷酸類似物中DNA/RNA磷酸酯和/或糖 磷酸酯骨架被不同類型的核苷酸之間的鍵替代。示例性多核苷酸類似物 包括但不限于，肽核酸，其中多核苷酸的糖磷酸酯骨架被肽骨架替代。
如本文所用，術(shù)語"多核苷酸"、"寡核苷酸"和"核酸"可以相互 替代使用，并且是指核苷酸單體的單鏈和雙鏈聚合物，包括由核苷酸之 間的磷酸二酯鍵連接的2'-脫氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)、或 核苷酸之間的類似物，以及相關(guān)的反離子，例如ET、 nh/、三烷基銨、 Mg^和Na+等。多核苷酸可以完全由脫氧核糖核苷酸組成、完全由核糖核 苷酸組成、或由它們的嵌合混合物組成。核苷酸單體單元可以包括本文 所述的任何核苷酸，包括但不限于核苷酸及核苷酸類似物。多核苷酸可 以包含一種或多種損傷(leskm)。多核苷酸的大小通常從數(shù)個單體單元(例 如5 40)(這在本領(lǐng)域中有時被稱為寡核苷酸)到數(shù)千個單體核苷酸單元。 除非另外指出，否則只要給出了多核苷酸序列，就應(yīng)該理解為核苷酸從 左到右為5'到3'的順序，并且除非另外指出，否則"A"表示脫氧腺苷或 其類似物，"C"表示脫氧胞苷或其類似物，"G"表示脫氧鳥苷或其類似 物，"T"代表胸苷或其類似物。
多核苷酸可以由單一類型的糖部分組成，例如在RNA或DNA的情 況中，也可以由不同的糖部分的混合物組成，例如在RNA/DNA嵌合體
13的情況中。在某些實施方式中，核酸是如以下結(jié)構(gòu)式的核糖多核苷酸和 2'-脫氧核糖多核苷酸
R R
其中每一個B獨立地為核苷酸的堿基部分，例如嘌呤、7-脫氮嘌呤、嘧 啶或它們的類似物；每一個m限定了相應(yīng)核酸的長度并且可以從0到數(shù) 千、數(shù)萬甚至更多；每一個R獨立地選自由包括氫、羥基、鹵素、—R"、 —OR"和—NR"R"的組，其中每一個R"獨立地為(d-C6)垸基或(C5-d4)芳 基，或者兩個相鄰的R可以一起成鍵從而使核糖為2',3'-二脫氫核糖，并 且每一個R'可以獨立地為羥基或
O 1 0
-o-
o
0-
p-
-OH
0-
其中a是0、 l或2。
在如上所示的核糖多核苷酸和2'-脫氧核糖多核苷酸的某些實施方式 中，如前所述，核苷酸堿基B共價連接到糖部分的C1'碳。
術(shù)語"核酸"、"多核苷酸"和"寡核苷酸"還可以包括核酸類似物、 多核苷酸類似物和寡核苷酸類似物。術(shù)語"核酸類似物"、"多核苷酸類
14似物"和"寡核苷酸類似物"可以相互替代使用，并且是指含有至少一 種核苷酸類似物和/或至少一種磷酸酯類似物和/或至少一種戊糖類似物 的多核苷酸。多核苷酸類似物可以包含一種或多種損傷。同樣包含在多 核苷酸類似物的定義之中的還有其中磷酸酯和/或糖磷酸酯鍵被其它類型
的鍵替代的多核苷酸，所述其它類型的鍵有例如N-(2-氨基乙基)-甘氨酸 酰胺和其它酰胺(見，例如Nielsen等，1991, 5We"ce 254: 1497-1500; WO 92/20702;美國專利5,719,262號；美國專利5，698，685號)；嗎啉并(見， 例如美國專利5,698,685號；美國專利5,378,841號；美國專利5,185,144 號)；氨基甲酸酯(見，例如Stirchak和Summerton，1987，JC^. Ozem.52: 4202);亞甲基(甲基亞氨基)(見，例如Vasseur等，1992,爿m. CTzem. 5bc. 114:4006); 3'-硫代甲乙縮醛(3'-thioformacetal)(見，例如Jones等，1993, / C7zem. 58: 2983);氨基磺酸酯(見，例如美國專利5，470，967號)；2-氨基乙基甘氨酸(通常稱為PNA)(見，例如Buchardt, WO 92/20702;Nielsen (1991) Science 254:1497-1500);以及其它鍵(見，例如美國專利5,817,781 號；Frier和Altaian, 1997, Wwc/. 25:4429以及其中所引用的參考
文獻(xiàn))。磷酸酯的類似物包括但不限于(i) CrC4烷基磷酸酯，例如甲基磷 酸酯；(ii)氨基磷酸酯；(iii) C廣C6烷基-磷酸三酯；(iv)硫代磷酸酯和(v) 二硫代磷酸酯。
術(shù)語"退火"和"雜交"可以相互替代使用，并且是指一種核酸與 另一中核酸之間的堿基配對相互作用，該作用導(dǎo)致形成雙鏈、三鏈或其 它更高等級的結(jié)構(gòu)。在某些實施方式中，基本相互作用是通過沃森/克里 克氫鍵和霍氏氫鍵鍵合的堿基特異性，例如A/T和G/C。堿基堆疊和疏 水相互作用也可以有助于雙鏈穩(wěn)定。
本申請中，關(guān)于一個序列與另一個序列相同或互補(bǔ)的表述涵蓋兩個 序列完全相同或彼此互補(bǔ)的情況，和只是其中一個序列的一部分與另一 序列的一部分或全部相同或互補(bǔ)的情況。這里，術(shù)語"序列"包含但不 限于核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、探針、引物、引物特異性部分和 目標(biāo)物特異性部分。
本申請中，關(guān)于一個序列與另一個序列互補(bǔ)的表述包括其中兩個序
15列具有錯配的情況。雖然錯配，但兩個序列在適宜條件下可以相互選擇 性地雜交。
術(shù)語"選擇性地雜交"是指，對于非常相似的序列，非常相似的序 列的大部分與給定的所需一種或多種序列雜交，并且非常相似序列的大 部分不與其它的非所需的序列雜交。各種情況中，"非常相似序列的大部 分"是指非常相似序列的總數(shù)中的一部分，而不是指單個非常相似序列 中的一部分。在某些實施方式中，"非常相似序列的大部分"是指非常相
似序列中的至少70%。在某些實施方式中，"非常相似序列的大部分"是 指非常相似序列中的至少80%。在某些實施方式中，"非常相似序列的大 部分"是指非常相似序列中的至少90%。在某些實施方式中，"非常相似 序列的大部分"是指非常相似序列中的至少95%。
在某些實施方式中，可存在的錯配的數(shù)量隨組成的復(fù)雜性而變化。 因此，在某些實施方式中，組成越復(fù)雜，則與非所需的序列雜交的可能 性越大。例如，在某些實施方式中，對于給定的錯配數(shù)量，當(dāng)對下列二 種組成均使用相同的雜交條件和洗脫條件時，探針雜交到具有整個基因 組DNA的組成中的非所需序列的可能性要比雜交到具有較少DNA序列 的組成中的非所需序列的可能性要大。因此，該給定的錯配數(shù)量可能適 合于具有較少DNA序列的組成，但更少的錯配對于具有整個基因組DNA
的組成可能更理想。
在某些實施方式中，如果序列具有不超過20%的錯配的核苷酸，則 它們是互補(bǔ)的。在某些實施方式中，如果序列具有不超過15%的錯配的 核苷酸，則它們是互補(bǔ)的。在某些實施方式中，如果序列具有不超過10% 的錯配的核苷酸，則它們是互補(bǔ)的。在某些實施方式中，如果序列具有 不超過5%的錯配的核苷酸，則它們是互補(bǔ)的。在各種實施方式中，如果 序列具有不超過0%、 1°/。、 2%或3%的錯配的核苷酸，則它們是互補(bǔ)的。
本申請中，關(guān)于一個序列與另一個序列雜交或結(jié)合的表述包含兩個 序列的全部彼此雜交或結(jié)合的情況，和只有一個序列或二個序列的一部 分與另一個序列的全部或另一序列的一部分雜交或結(jié)合的情況。這里， 術(shù)語"序列"包含但不限于核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、探針、引物、引物特異性部分和目標(biāo)物特異性部分。
本文所用的術(shù)語"引物"或"寡核苷酸引物"是指可以在適合的條件下由其合成引物延伸產(chǎn)物的寡核苷酸。在某些實施方式中，所述適合的條件包括該引物與互補(bǔ)核酸雜交，并于適合的溫度、pH、金屬濃度、鹽濃度等在例如核苷酸、諸如DNA或RNA聚合酶等聚合引發(fā)劑的存在下溫育。在各種實施方式中，引物長5個核苷酸 100個核苷酸。在各種實施方式中，引物長8個核苷酸 75個核苷酸、10個核苷酸 60個核苷酸、10個核苷酸 50個核苷酸、10個核苷酸 40個核苷酸或10個核苷酸 35個核苷酸。
本文所用的術(shù)語"連接"是指兩個多核苷酸末端的共價結(jié)合。在各種實施方式中，連接涉及一條多核苷酸的3'末端共價結(jié)合到另一條多核苷酸的5'末端的共價結(jié)合。在各種實施方式中，連接得到在多核苷酸末端之間形成的磷酸二酯鍵。在各種實施方式中，連接可以通過導(dǎo)致多核苷酸末端的共價結(jié)合的任何酶、化學(xué)品或方法介導(dǎo)。在某些實施方式中，連接是由連接酶介導(dǎo)的。
本文所用的術(shù)語"分析物"是指要使用一種或多于一種的近感檢測探針檢測的物質(zhì)。所述物質(zhì)包括但不限于，蛋白質(zhì)、肽、抗體、碳水化合物、激素、小分子、細(xì)胞、微生物和可以為其開發(fā)出分析物結(jié)合部分的任何其它物質(zhì)。分析物不是核酸。
本文所用的術(shù)語"目標(biāo)核酸"是指被選擇用于檢測的RNA或DNA。示例性RNA包括但不限于，mRNA、 tRNA、 snRNA、 rRNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒、非編碼的小RNA、 microRNA、多核糖體RNA、 mRNA前體、內(nèi)含子RNA和病毒RNA。示例性DNA包括但不限于，基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、核仁DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、 cDNA、合成的DNA、酵母人工染色體DNA ( "YAC")、細(xì)菌人工染色體DNAC"BAC")、其它染色體外DNA和引物延伸產(chǎn)物。用于檢測短核酸的示例性方法，例如使用莖環(huán)引物和/或短引物的示例性方法，可參見例如Chen等的美國專利公報US 2005/0266418號和Lao等的美國專利公報US2006/0057595號。
17本文所用的術(shù)語"多功能性裂解緩沖液"是指能夠裂解、勻化和/或提取所選擇的生物樣品而基本不降解目標(biāo)核酸、并同時保持適當(dāng)?shù)姆治鑫锝Y(jié)構(gòu)從而使近感檢測探針能夠結(jié)合裂解物中的分析物的緩沖液。在各
種實施方式中，少于1°/。、少于5%、少于10%、少于15%、少于20°/。、少于25%、少于30%或少于50%的目標(biāo)核酸被降解。在各種實施方式中，至少99%、至少95%、至少90%、至少85°/。、至少75%、至少70°/。或至少50%的目標(biāo)分析物保持適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)從而使近感檢測探針能夠結(jié)合裂解物中的分析物。
在各種實施方式中，在用于進(jìn)行本文所述方法的適當(dāng)溫度和稀釋條件下，多功能性裂解緩沖液與本文所述方法相容。在某些實施方式中，多功能性裂解緩沖液包含選自NDSB-201 (3-(l-吡啶并)-l-丙烷磺酸鹽)、LDAO (十二烷基二甲基氧化胺)、CHAPS (3-[(3-膽氨基丙基)二甲基銨基]-l-丙垸磺酸鹽)、DEDTAB(溴化十二烷基乙基二甲基銨)、Zwittergent3-10 (正癸基-N，N-二甲基-3-銨-l-丙烷磺酸鹽)和CAPSO (3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1 -丙烷磺酸)中的至少 一種化學(xué)品。
本文所用的術(shù)語"生物樣品"是指被懷疑含有目標(biāo)分析物和/或目標(biāo)核酸的任何樣品。示例性的生物樣品包括但不限于，原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、組織樣品、病毒顆粒、噬菌體、傳染性顆粒、病原體、真菌、食物樣品、體液(包括但不限于粘液、血液、血漿、血清、尿液、唾液和精液)、水樣和來自例如水和空氣的過濾物。
本文所用的"近感檢測探針"是包含共價或非共價連接到至少一種寡核苷酸部分的至少一種分析物結(jié)合部分的探針。在某些實施方式中，所述寡核苷酸部分包含結(jié)合對的第一成員，所述分析物結(jié)合部分包含結(jié)合對的第二成員，其中結(jié)合對的第一成員和結(jié)合對的第二成員在用于近感檢測探針結(jié)合和雜交和/或連接的條件下能夠穩(wěn)定地相互作用。在各種實施方式中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠選擇適合的結(jié)合對。在某些實施方式中，近感檢測探針包含將至少一種分析物結(jié)合部分連接到至少一種寡核苷酸部分的一種或多種接頭。在各種實施方式中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠選擇適合的接頭。本文所用的"分析物結(jié)合部分"是指與目標(biāo)分析物結(jié)合的部分?？杀挥米鞣治鑫锝Y(jié)合部分的示例性的部分包括但不限于，能夠結(jié)合分析物的單克隆抗體及其片段、能夠結(jié)合分析物的多克隆抗體及其片段、蛋白質(zhì)、肽、凝集素、核酸、適體、碳水化合物、溶解性細(xì)胞表面受體、小分子、和對目標(biāo)分析物具有特異性的任何其它結(jié)合部分。
本文所用的術(shù)語"近感檢測測定法"或"PDA"是指涉及使分析物與至少兩種近感檢測探針接觸的測定法，其中每種探針包含分析物結(jié)合部分和寡核苷酸部分。每種探針的分析物結(jié)合部分可以相同，也可以不同。每種探針的寡核苷酸部分可以相同，也可以不同。在某些實施方式中，使分析物與近感檢測探針組接觸。在各種實施方式中，近感檢測探針組包括2、 3、 4、 5或多于5種的近感檢測探針。在某些實施方式中，近感檢測探針組是一對近感檢測探針，或"近感檢測探針對"。在某些實施方式中，近感檢測探針組中的每種探針的分析物結(jié)合部分不相同。在某些實施方式中，近感檢測探針組中的每種探針的分析物結(jié)合部分能夠與分析物中的不同表位結(jié)合。如本文所用的，不同表位可以是分析物序列中的和/或三維空間中的重疊表位或非重疊表位。在某些實施方式中，近感檢測探針組中的每種探針的寡核苷酸部分包含不同的序列。
在各種實施方式中，在將分析物與至少兩種近感檢測探針接觸之后，近感檢測探針中的至少兩種的寡核苷酸部分能夠彼此相互作用。在各種實施方式中，可以通過一種或多于一種的額外的寡核苷酸介導(dǎo)所述相互作用。在某些實施方式中，近感檢測探針中的至少兩種的寡核苷酸部分的至少一部分彼此雜交。在某些實施方式中，近感檢測探針的寡核苷酸部分中的每一種的至少一部分與另一寡核苷酸雜交。例如，在某些實施方式中，加入至少一種額外的寡核苷酸(本文中稱為"夾板寡核苷酸")，所加入的寡核苷酸通過與近感檢測探針中的每一種的寡核苷酸部分的至少一部分雜交，從而介導(dǎo)至少兩種近感檢測探針之間的相互作用。在下述情況下，近感檢測測定法(PDA)也可以被稱為"近感相互作用測定法"或"PIA":其中寡核苷酸部分彼此雜交，或與可在至少兩種寡核苷酸部分之間形成接橋的另一寡核苷酸雜交，其中所述寡核苷酸部分不彼此連
19接。
在某些實施方式中，通過多核苷酸連接酶，近感檢測探針中的至少兩種的寡核苷酸部分能夠被連接在一起。在某些實施方式中，寡核苷酸部分中每一種的連接性末端是通過至少一種其它寡核苷酸(也被稱為"夾板寡核苷酸")而并到一起的，所述其它寡核苷酸能夠與每種近感檢測探針的寡核苷酸部分中的至少一部分雜交。其中近感檢測探針的寡核苷酸
部分被連接在一起的近感檢測測定法(PDA)也可以被稱為"近感連接測定法"或"PLA"。
在各種實施方式中，在至少兩種近感檢測探針的寡核苷酸部分雜交和/或連接后，可以通過本領(lǐng)域中任何已知的方法檢測經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分。檢測經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分的示例性方法包括但不限于，直接檢測、實時PCR(包括但不限于，5'-核酸酶實時PCR)、滾環(huán)擴(kuò)增、連接和PCR的組合、和預(yù)擴(kuò)增及隨后的檢測步驟(例如但不限于第二擴(kuò)增、直接檢測、連接等)。本文描述了檢測核酸的某些示例性方法。
在例如美國專利6,511,809號B2;美國專利公報US 2002/0064779號；PCT公報WO 2005/123963號；和Gustafsdottir等的C7/". 52:1152-1160 (2006)中對示例性的近感檢測測定法進(jìn)行了描述。
本文所用的術(shù)語"核酸定量檢測測定法"是指能夠?qū)悠分械奶囟ê怂嵝蛄械牧窟M(jìn)行定量的測定法。本文的題為"某些示例性方法"的部分中描述了某些示例性的核酸定量檢測測定法。
本文所用的術(shù)語"檢測探針"是指在擴(kuò)增反應(yīng)中所用的有利于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的分子。示例性的擴(kuò)增反應(yīng)包括但不限于，定量PCT、實時PCR和終點分析擴(kuò)增反應(yīng)(end-point analysis amplification reaction)。在各禾中實施方式中，所述檢測探針能夠用于監(jiān)測目標(biāo)核酸和/或?qū)φ蘸怂岬臄U(kuò)增。在各種實施方式中，存在于擴(kuò)增反應(yīng)中的檢測探針適合于監(jiān)測隨著時間而產(chǎn)生的一種或多種擴(kuò)增子的量。
在各種實施方式中，檢測探針是"基于序列的"，這表示它以序列特異性的方式檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。作為非限制性的實例，基于序列的檢測探針
20可以包含能夠與特異性擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的寡核苷酸。在某些實施方式中，檢測探針是"不依賴序列的"，這表示它不依賴擴(kuò)增產(chǎn)物的序列而檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。
某些示例性檢測探針包括但不限于，5'核酸酶測定法中使用的探針(例如，在例如美國專利5,538,848號中所述的TaqMan⑧探針)；莖環(huán)分子信標(biāo)(見，例如美國專利6,103,476號和5,925,517號以及Tyagi和Kramer，1996， A^ww歷otec/mo/ow 14:303-308);無莖信標(biāo)或線性信標(biāo)(見，例如WO 99/21881)、 PNA分子信標(biāo)TM (見，例如美國專利6,355,421號和6，593，091號)；線性PNA信標(biāo)(見，例如Kubista等，2001， SPIE4264:53-58);非FRET探針(見，例如美國專利6,150,097號)；Sunrise⑧/Amplifluor⑧探針(美國專利6,548,250號)；莖環(huán)探針和雙鏈Scorpion TM探針(Solinas等，2001, Nucleic Acids Research 29:E96和美國專利6,589,743號)；凸環(huán)探針(美國專利6，590，091號)；假結(jié)探針(美國專利6,589,250號)、環(huán)狀體(cyclicon)(美國專禾(J 6,383,752號)；MGB Eclipse TM探針(EpochBiosciences);發(fā)夾探針(美國專利6,596,490號)；肽核酸(PNA)照亮探針(light-upprobe);自組裝納米粒子探針；和二茂鐵改性的探針。某些示例性檢測探針在例如以下文獻(xiàn)中有描述美國專利6,485，901號；Mhlanga等，2001,方法(Methods)25:463-471; Whitcombe等，1999,自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology.) 17:804-807; Isacsson等，2000，分子細(xì)胞探針(Molecular Cell Probes). 14:321-328; Svanvik等，2000，分析生物化學(xué)(Anal Biochem.) 281:26-35; Wolffs等，2001,生物技術(shù)(Biotechniques)766:769-771; Tsourkas等，2002,核酸研究(Nucleic Acids Research.)30:4208-4215 ; Riccelli 等，2002, 核酸研究(Nucleic AcidsResearch.)30:4088-4093; Zhang等，2002 Shanghai. 34:329-332; Maxwell等，2002，美國化學(xué)會志(J. Am. Chem. Soc.) 124:9606-9612; Broude等，2002，生物技術(shù)進(jìn)展(TrencJs Biotechnol.) 20:249-56; Huang等，2002,毒理學(xué)化學(xué)研究(Chem Res. Toxicol.) 15:118-126;和Yu等，2001，美國化學(xué)會志(J. Am. Chem, Soc.)14:11155-11161。
在各種實施方式中，檢測探針可包含淬滅劑。示例性的淬滅劑包括
21但不限于，黑洞淬滅劑(Biosearch)、 Iowa Black (IDT)、 QSY淬滅劑(Molecular Probes)和Dabsyl (4-二甲胺基苯基偶氮苯磺?；?和Dabcel的磺酸酯(或鹽)/羧酸酯(或鹽)淬滅劑(Epoch)。在某些實施方式中，檢測探針
可以包含兩種探針，例如，其中一種探針含有熒光性部分而另一種探針含有淬滅劑，其中所述兩種探針共同在目標(biāo)物上的雜交可淬滅信號，或
者其中所述兩種探針在目標(biāo)物上的雜交可經(jīng)由熒光的改變而改變信號。在Lao等的例如美國專利公報US 2006/0014191號中描述了某些示例性的包含兩種探針的檢測探針。某些示例性檢測探針還包括但不限于，以S03替代羧酸酯(或鹽)基團(tuán)的熒光素(fluorescenin)染料的磺酸酯(或鹽)衍生物、熒光素的亞磷酰胺形式、和CY5的亞磷酰胺形式(可從例如Amersham商購獲得)。
在某些實施方式中，檢測探針包括嵌入標(biāo)記(intercalating label)。示例性的嵌入標(biāo)記包括但不限于，溴化乙啶、SYBR Green I (MolecularProbes)和PicoGreen (Molecular Probes),所述標(biāo)記在不存在核酸探針的情況下使得擴(kuò)增產(chǎn)物實時可視化或終點可視化。在某些實施方式中，包含嵌入標(biāo)記的檢測探針是不依賴序列的檢測探針。在某些實施方式中，實時可視化可包括不依賴序列的檢測探針和基于序列的檢測探針。
在某些實施方式中，當(dāng)未與擴(kuò)增反應(yīng)中的互補(bǔ)序列雜交時，檢測探針至少被部分淬滅，當(dāng)與擴(kuò)增反應(yīng)中的互補(bǔ)序列雜交時，檢測探針至少部分未被淬滅。在各種實施方式中，檢測探針可進(jìn)一步包括各種修飾，例如小溝結(jié)合劑(見，例如美國專利6,486,308號)，從而進(jìn)一步提供所需的熱力學(xué)特性。在某些實施方式中，檢測探針響應(yīng)識別部分或識別部分互補(bǔ)區(qū)，也被稱為拉鏈碼(zip-code)。識別部分在例如以下文獻(xiàn)中有描述美國專利6,309,829號(在其中被稱為"標(biāo)簽片段")；6，451，525號(在其中被稱為"標(biāo)簽片段")；6，309，829號(在其中被稱為"標(biāo)簽片段")；5，981，176號(在其中被稱為"網(wǎng)格寡核苷酸"(grid oligonucleotide)); 5,935,793號(在其中被稱為"識別子標(biāo)簽"(identifier tags));和PCT公報WO 01/92579號(在其中被稱為"可尋址支持特異性序列"(addressable support-specificsequence)) 0
22檢測探針可以是"差異可檢的"，這表示可以通過至少一種檢測方法將它們彼此區(qū)分。差異可檢的檢測探針包括但不限于，發(fā)射不同波長的光的檢測探針、吸收不同波長的光的檢測探針、散射不同波長的光的檢測探針、具有不同熒光衰減壽命的檢測探針、具有不同光譜特征的檢測探針、具有不同放射性衰減性質(zhì)的檢測探針、具有不同電荷的檢測探針和具有不同大小的檢測探針。在某些實施方式中，檢測探針發(fā)射熒光信號。
"終點聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"或"終點PCR"是在PCR反應(yīng)完成后而不在該反應(yīng)正在進(jìn)行時檢測核酸目標(biāo)序列的存在或量的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。
"實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"或"實時PCR"是當(dāng)反應(yīng)正在進(jìn)行時檢測核酸目標(biāo)序列的存在或量的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。在某些實施方式中，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的每一個循環(huán)的過程中，'存在于反應(yīng)組合物中的一種或多于一種的探針?biāo)l(fā)射的信號被作為引物延伸產(chǎn)物的合成的指示物受到監(jiān)測。在某些實施方式中，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的每一個循環(huán)的過程中所發(fā)射的熒光被作為引物延伸產(chǎn)物的合成的指示物受到監(jiān)測。
"多重擴(kuò)增反應(yīng)"是其中在同一反應(yīng)中擴(kuò)增兩種以上目標(biāo)核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)。"多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"或"多重PCR"是其中在同一反應(yīng)中擴(kuò)增兩種以上目標(biāo)核酸序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。
"單重擴(kuò)增反應(yīng)"是其中在反應(yīng)中只擴(kuò)增一種目標(biāo)核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)。"單重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"或"單重PCR"是其中在反應(yīng)中只擴(kuò)增一種目標(biāo)核酸序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。
"循環(huán)閾值"或"CT"被定義為來自核酸定量檢測測定法的所觀察到的信號超過固定的閾值時的循環(huán)數(shù)。在某些實施方式中，所述固定的閾值被設(shè)定為在不含目標(biāo)核酸序列的反應(yīng)中所觀察到的信號的量。在某些實施方式中，所述固定的閾值被設(shè)定在超出背景噪聲信號的水平。例如，在某些實施方式中，所述固定的閾值被設(shè)定在對應(yīng)于背景噪聲信號和背景噪聲信號的均方根的組合的3倍以上的值。在某些實施方式中，
所觀察的信號來自熒光標(biāo)記。
23術(shù)語"標(biāo)準(zhǔn)化物對照"是指能夠被用于將在近感檢測測定法中所檢測到的目標(biāo)分析物和/或目標(biāo)核酸的量標(biāo)準(zhǔn)化的存在于生物樣品和/或生物樣品的裂解物中的分子。在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是分析物。在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是核酸。
在各種實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照可以被稱為"外源性"或"內(nèi)源性"。在某些實施方式中，在收集生物樣品之后將外源性標(biāo)準(zhǔn)化物對照加入生物樣品。在某些實施方式中，外源性標(biāo)準(zhǔn)化物對照已經(jīng)被加入到生物樣品的裂解物中。在各種實施方式中，生物樣品和/或生物樣品的裂解物天然地包含一定量的可被用作外源性標(biāo)準(zhǔn)化物對照的相同的分析物和/或核酸，但是由于添加了額外量的分析物和/或核酸，該標(biāo)準(zhǔn)化物對照被認(rèn)為是外源性的。
在某些實施方式中，在收集樣品以用于分析時，內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)化物對照就已經(jīng)存在于生物樣品中。在某些實施方式中，內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)化物對照已經(jīng)存在于生物樣品的裂解物中，而不必先行向裂解物中添加。在某些實施方式中，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化物對照不需先行添加即以高含量存在于生物樣品和/或生物樣品的裂解物中時，就將其稱為"看家的"。在某些實施方式中，看家標(biāo)準(zhǔn)化物對照以高含量存在于多于一種的不同類型的生物樣品中。
在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是內(nèi)源性分析物。在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是內(nèi)源性蛋白質(zhì)。在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是內(nèi)源性的看家蛋白質(zhì)。某些示例性的內(nèi)源性看家蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化物對
照包括但不限于GAPDH、酸性核糖體蛋白質(zhì)、P-肌動蛋白、HPRT、 |3-葡糖醛酸糖苷酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、 ICAMl和p53。
在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是外源性分析物。在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是外源性蛋白質(zhì)。某些示例性的外源性蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化物對照包括但不限于，細(xì)菌蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)標(biāo)簽、病毒蛋白質(zhì)、完整的病毒粒子、昆蟲蛋白質(zhì)、在所選的生物樣品中非正常表達(dá)的哺乳動物蛋白質(zhì)、和在所選的生物樣品中以低水平正常表達(dá)的哺乳動物蛋白質(zhì)。可用作外源性蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化物對照的某些示例性的細(xì)菌蛋白質(zhì)包括但不限于，P-半乳糖苷酶和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)?？捎米魍庠葱缘鞍踪|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化物對照的某些示例性的蛋白質(zhì)標(biāo)簽包括但不限于，組氨酸標(biāo)簽(例如
His6標(biāo)簽)、流感標(biāo)簽(flu tag)、血凝素標(biāo)簽、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽和螢光素酶。在某些實施方式中，外源性蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化物包含與另一蛋白質(zhì)融合的蛋白質(zhì)標(biāo)簽。
在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是內(nèi)源性的核酸。在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是內(nèi)源性的基因組DNA片段。在某些實施方式中，內(nèi)源性的基因組DNA片段包含單一拷貝基因的至少一部分。在某些實施方式中，內(nèi)源性的基因組DNA片段包含以多于一個拷貝存在于基因組中的基因的至少一部分。某些示例性的內(nèi)源性單一拷貝基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)化物對照包括但不限于，核糖核酸酶P基因的至少一部分和短串聯(lián)重復(fù)(STR)基因座的至少一部分。某些示例性的STR基因座包括但不限于，D3S1358 、 HUMTH01 、 D21S11 、 D18S51 、 G475 、 Amelogenin 、HUMvWFA31、 D8S1179、 HUMTPOX、 HUMFIBRA、 D5S818、 D7S820、D13S317、 D16S539、 HUMCSF1P0和S159。例如美國專利7,008,771中描述了某些STR基因座。
在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是內(nèi)源性的RNA。在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是內(nèi)源性的看家RNA。某些示例性的內(nèi)源性看家RNA標(biāo)準(zhǔn)化物對照包括但不限于GAPDH、 18S、 p-肌動蛋白、酸性核糖體蛋白質(zhì)、HPRT、 P-葡糖醛酸糖苷酶、半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、 ICAM1和p53。在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是編碼至少一種待檢測的目標(biāo)分析物的內(nèi)源性mRNA。
在各種實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照是外源性核酸。在各種實施方式中，外源性核酸包括RNA和/或DNA。示例性的RNA包括但不限于，mRNA、tRNA、 snRNA、rRNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒、非編碼的小RNA、microRNA、多核糖體RNA、 mRNA前體、內(nèi)含子RNA和病毒RNA。示例性DNA包括但不限于，基因組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、核仁DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、 cDNA、合成的DNA、酵母人工染色體DNA("YAC")、細(xì)菌人工染色體DNA( "BAC")、其它染色體外DNA和引物延伸產(chǎn)物。在某些實施方式中，外源性核酸包含PNA。在某些實施方
25式中，外源性核酸包括一般見于除從其中收集所述生物樣品的生物之外的生物中的序列。在某些實施方式中，外源性核酸包括一般見于從其中收集所述生物樣品的生物中的序列。在某些實施方式中，外源性標(biāo)準(zhǔn)化物對照包括在已知的生物中不常見的序列。在某些實施方式中，外源性
標(biāo)準(zhǔn)化物對照包括在一種類型的核酸(例如mRNA)中常見的序列，但所述外源性標(biāo)準(zhǔn)化物對照包含在另一種類型的核酸(例如DNA)中的序列。在某些實施方式中，外源性核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照是TaqMan⑧外源性固有陽性對照試齊ll(TaqMan⑧Exogenous Internal Positive Control Reagent) (AppliedBiosystems目錄號為4308323)。
在各種實施方式中，使用"德爾塔Ct法"或"ACt法"(涉及ACT的計算)可以針對標(biāo)準(zhǔn)化物對照將目標(biāo)核酸的量標(biāo)準(zhǔn)化。在某些實施方式中，從來自用以檢測目標(biāo)核酸的核酸定量檢測測定法的CT減去來自用以檢測標(biāo)準(zhǔn)化物對照的核酸定量檢測測定法的CT，可以算得ACt。在某些實施方式中，由ACT計算標(biāo)準(zhǔn)化物對照和目標(biāo)核酸的量的倍差(folddifference)。在某些實施方式中，根據(jù)公式2—ACT由ACT計算標(biāo)準(zhǔn)化物對照和目標(biāo)核酸的量的倍差。
在各種實施方式中，使用"德爾塔Ct法"或"ACt法"(涉及ACT的計算)可以針對標(biāo)準(zhǔn)化物對照將目標(biāo)分析物的量標(biāo)準(zhǔn)化。在某些實施方式中，從來自用以檢測目標(biāo)分析物的核酸定量檢測測定法的Cr減去來自用以檢測標(biāo)準(zhǔn)化物對照的核酸定量檢測測定法的CT，可以算得ACt。在某些實施方式中，由ACT計算標(biāo)準(zhǔn)化物對照和目標(biāo)分析物的量的倍差。在某些實施方式中，根據(jù)公式2-ACT由ACT計算標(biāo)準(zhǔn)化物對照和目標(biāo)分析物的量的倍差。
在各種實施方式中，使用"比較Ct法"或"AAGr法"(涉及AACT的計算)可以針對標(biāo)準(zhǔn)化物對照將目標(biāo)核酸的量標(biāo)準(zhǔn)化。在各種實施方式中，使用"比較CT法"或"AACt法"(涉及AACT的計算)可以針對標(biāo)準(zhǔn)化物對照將目標(biāo)分析物的量標(biāo)準(zhǔn)化。在某些實施方式中，通過從"測試裂解物"的ACt減去"校準(zhǔn)物裂解物"的ACT來計算AACT。某些示例性校準(zhǔn)物裂解物包括但不限于，從未經(jīng)處理的細(xì)胞制備的裂解物和從特定
26組織制備的裂解物。某些示例性測試裂解物包括但不限于，從經(jīng)處理的 細(xì)胞制備的裂解物和從除了制備校準(zhǔn)物裂解物的組織之外的組織制備的
裂解物。在某些實施方式中，通過從測試裂解物的ACt減去校準(zhǔn)物裂解 物的AGr來計算AAGr。
在某些實施方式中，根據(jù)公式2_AACT由AACT計算校準(zhǔn)物裂解物和測 試裂解物中的目標(biāo)核酸的量的倍差。在某些實施方式中，根據(jù)公式2-a^t 由AAGr計算校準(zhǔn)物裂解物和測試裂解物中的目標(biāo)分析物的量的倍差。在 Applied Biosystems, "Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using Real-Time Quantitative PCR"; 和Applied Biosystems, User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, (1997年12 月11日(2001年10月更新))中對AACt方法的使用有描述。
術(shù)語"封閉劑"是指包括在反應(yīng)中以減少非特異性相互作用的物質(zhì)。 在某些實施方式中，反應(yīng)中包括封閉劑以減少涉及分析物的非特異性相 互作用。在某些實施方式中，反應(yīng)中包括封閉劑以減少涉及核酸的非特 異性相互作用。
在某些實施方式中，封閉劑是分析物。作為分析物的封閉劑可以被 稱為"分析物封閉劑"。在某些實施方式中，封閉劑是蛋白質(zhì)。作為蛋白 質(zhì)的封閉劑可以被稱為"蛋白質(zhì)封閉劑"。某些示例性蛋白質(zhì)封閉劑包括 但不限于，BSA、酪蛋白、隨機(jī)肽文庫片段、哺乳動物IgG組分的制備 物、和脫脂奶粉。在某些實施方式中，封閉劑是明膠。作為明膠的封閉 劑可以被稱為"明膠封閉劑"。某些示例性的明膠封閉劑包括但不限于， 魚源明膠(包括但不限于冷魚明膠(cold fish gelatin) (Sigma # G7765))、牛 源明膠和豬源明膠。在某些實施方式中，反應(yīng)中以0.01% 5%的濃度包 含分析物封閉劑。在某些實施方式中，反應(yīng)中以0.01% 2%的濃度包含 分析物封閉劑。在某些實施方式中，多功能性裂解緩沖液中以0.05% 0.5%的濃度包含分析物封閉劑。例如Vogt等， / /mww"o/. Me仇，101(1): 43-5 (1987)描述了某些示例性的封閉劑。
在某些實施方式中，封閉劑是核酸。作為核酸的封閉劑可以被稱為 "核酸封閉劑"。在各種實施方式中，封閉劑包括RNA和/或DNA。在各
27種實施方式中，封閉劑包括單鏈核酸和/或雙鏈核酸。在某些實施方式中， 封閉劑主要包含單鏈核酸。主要是單鏈核酸的封閉劑可以被稱為"單鏈 核酸封閉劑"。在某些實施方式中，封閉劑主要包含雙鏈核酸。主要是雙 鏈核酸的封閉劑可以被稱為"雙鏈核酸封閉劑"。某些示例性的單鏈核酸
封閉劑包括但不限于多聚A和多聚dC。某些示例性的雙鏈核酸封閉劑包 括但不限于基因組DNA、經(jīng)剪切的基因組DNA、多聚dC+多聚dG和多 聚dl+多聚dC。某些示例性的經(jīng)剪切的基因組DNA包括但不限于經(jīng)剪切 的鮭魚精DNA和經(jīng)剪切的小牛胸腺DNA。
某些示例性試劑
某些示例性的近感檢測探針
近感檢測探針包含至少一種分析物結(jié)合部分和至少一種寡核苷酸部 分。分析物結(jié)合部分能夠結(jié)合所選的分析物。在某些實施方式中，近感 檢測探針包含一種分析物結(jié)合部分和一種寡核苷酸部分。在某些實施方 式中，近感檢測探針包含多于一種的分析物結(jié)合部分。在某些實施方式 中，近感檢測探針包含多于一種的寡核苷酸部分。例如Fredriksson的美 國專利公報US 2005/0003361 Al描述了某些示例性的多價近感探針。
在各種實施方式中，近感檢測探針的寡核苷酸部分可以包含核糖核
苷酸、脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸的類似物、和脫氧核糖核苷酸的類 似物中的一種或多種。示例性的核糖核苷酸的類似物和脫氧核糖核苷酸 的類似物包括但不限于，包含對核苷酸的糖、磷酸和/或堿基部分的一種 或多種修飾的類似物。示例性的寡核苷酸類似物包括但不限于，LNA(見， 例如美國專利6,316，198號)、PNA(見，例如美國專利6,451,968號)和本 文所討論的或本領(lǐng)域中已知的任何其它核苷酸類似物(見，例如Loakes， iVwc/dc ^cz'A 2001年6月15日；29(12):2437-2447,和Karkare等,^ ; / M/craWo/所ofec/z"o/. 2006年8月;71(5):575-586. Epub 2006年5月9日)。 在各種實施方式中，近感檢測探針的寡核苷酸部分可以包含至少10 個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少 40個、至少50個、至少60個、至少75個、或至少100個核苷酸。在各 種實施方式中，近感檢測探針的寡核苷酸部分可以包含10 1000個核苷
28酸。在各種實施方式中，寡核苷酸部分可以包含10 500個核苷酸。在 各種實施方式中，寡核苷酸部分可以包含10 200個核苷酸。在各種實 施方式中，寡核苷酸部分可以包含10 100個核苷酸。
近感檢測探針的寡核苷酸部分和分析物結(jié)合部分可以彼此共價地或 非共價地相互作用。使分析物結(jié)合部分與寡核苷酸部分共價地和非共價 地相互作用的某些方法是本領(lǐng)域中已知的。
在某些實施方式中，寡核苷酸部分包含結(jié)合對的第一成員，并且分 析物結(jié)合部分包含結(jié)合對的第二成員，其中在用于近感檢測探針結(jié)合和 雜交和/或連接的條件下，結(jié)合對的第一成員和結(jié)合對的第二成員能夠穩(wěn) 定地聯(lián)合。在某些實施方式中，在檢測經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸 部分的過程中，結(jié)合對不需要穩(wěn)定地聯(lián)合。某些示例性的結(jié)合對包括但 不限于，抗體/抗原、生物素/抗生物素蛋白、生物素/鏈霉抗生物素蛋白、 多種雜交性核酸、受體/配體、葉酸/葉酸結(jié)合蛋白、維生素B12/內(nèi)因子、 蛋白A/Fc、和蛋白G/Fc、金屬/螯合劑等。在某些實施方式中，通過使用 磺基-SMCC試劑(例如見，Pierce目錄號為22322)可以使鏈霉抗生物素蛋 白與寡核苷酸部分連接。在某些實施方式中，可以使近感檢測探針的分 析物結(jié)合部分和寡核苷酸部分共價結(jié)合。在不同分子之間形成共價鍵的 某些方式是本領(lǐng)域中已知的，并且可參見例如Pierce目錄。例如Gullberg 等，A^/. ^cad 101(22): 8420-8424 (2004)中描述了制作近感檢測 探針的某些示例性方法。
在各種實施方式中，寡核苷酸部分的3'末端或5'末端與分析物結(jié)合
部分聯(lián)合。在某些實施方式中，寡核苷酸部分在除了寡核苷酸部分的3'
末端或5'末端之外的其它部位與分析物結(jié)合部分聯(lián)合，例如，通過寡核
苷酸序列中的一種或多以一種的核苷酸或經(jīng)修飾的核苷酸聯(lián)合。
在各種實施方式中，將兩種以上近感檢測探針組合以形成近感檢測
探針組。在各種實施方式中，第一近感檢測探針與第二近感檢測探針配 對從而形成近感檢測探針對。近感檢測探針組中的近感檢測探針可以各 自與相同的或不同的分析物結(jié)合。在某些實施方式中，組中的近感檢測 探針各自與相同的分析物結(jié)合。在某些實施方式中，組中的近感檢測探
29針各自與不同的分析物結(jié)合。在某些實施方式中，組中的第一亞組的近 感檢測探針各自與第一分析物結(jié)合，并且組中的第二亞組的近感檢測探 針各自與第二分析物結(jié)合。在某些實施方式中，組中的第一亞組的近感 檢測探針與第一分析物結(jié)合，并且組中的第二亞組的近感檢測探針與第 二分析物結(jié)合，其中在某些條件下所述第一分析物和所述第二分析物能 夠相互聯(lián)合。在各種實施方式中，所述近感檢測探針組可以例如被用于 檢測所述第一分析物和所述第二分析物在某些條件下的聯(lián)合。
在某些實施方式中，通過近感檢測探針的同一分析物結(jié)合部分或通 過近感檢測探針的多個分析物結(jié)合部分，近感檢測探針能夠結(jié)合一種以 上分析物。在某些實施方式中，近感檢測探針能夠結(jié)合相關(guān)分析物家族 中的兩種以上分析物。
在各種實施方式中，近感檢測探針組的第一成員的寡核苷酸部分的 至少一部分能夠與近感檢測探針組的第二成員的寡核苷酸部分的至少一
部分雜交。在各種實施方式中，經(jīng)雜交的區(qū)域包含至少5個堿基對、至 少10個堿基對、至少15個堿基對、至少20個堿基對、至少25個堿基 對、至少30個堿基對、至少40個堿基對、至少50個堿基對、至少75 個堿基對、或至少100個堿基對。
在各種實施方式中，近感檢測探針組的第一成員的寡核苷酸部分不 能夠與近感檢測探針組的第二成員的寡核苷酸部分雜交。例如，在某些 實施方式中，可以向所述近感檢測測定物添加至少一種夾板寡核苷酸， 其中一種或多種所述夾板寡核苷酸能夠與第一近感檢測探針的寡核苷酸 部分的至少一部分雜交，并且還能夠與第二近感檢測探針的寡核苷酸部 分的至少一部分雜交。在各種實施方式中，所述一種或多種夾板寡核苷 酸與近感檢測探針的寡核苷酸部分之間的雜交區(qū)域包含至少5個堿基對、 至少10個堿基對、至少15個堿基對、至少20個堿基對、至少25個堿 基對、至少30個堿基對、至少40個堿基對、至少50個堿基對、至少75 個堿基對、或至少100個堿基對。在各種實施方式中，夾板寡核苷酸是 對稱的，例如它與每種寡核苷酸部分的相等數(shù)量的堿基雜交。在各種實 施方式中，夾板寡核苷酸是非對稱的，例如它雜交到第一寡核苷酸部分的堿基的數(shù)量大于雜交到第二寡核苷酸部分的堿基的數(shù)量。例如PCT公 報WO 2005/123963號中描述了某些示例性的非對稱夾板。
在各種實施方式中，夾板寡核苷酸以下述方式與所述第一寡核苷酸 部分和所述第二寡核苷酸部分雜交寡核苷酸部分中的一個寡核苷酸部 分的3'末端與其他寡核苷酸部分的5'末端相鄰。在某些實施方式中，近感 檢測探針對的寡核苷酸部分的3'末端和5'末端能夠被連接到一起。在某些 實施方式中，寡核苷酸部分中的一個寡核苷酸部分的3'末端以1個以上 的核苷酸的空隙與其他寡核苷酸部分的5'末端分開。在某些實施方式中， 使用聚合酶填補(bǔ)所述空隙從而使被填補(bǔ)的末端能夠被連接到一起。
在各種實施方式中，夾板寡核苷酸可以包含核糖核苷酸、脫氧核糖 核苷酸、核糖核苷酸的類似物和脫氧核糖核苷酸的類似物中的一種或多 種。示例性的核糖核苷酸的類似物和脫氧核糖核苷酸的類似物包括但不 限于，包含對核苷酸的糖、磷酸和/或堿基部分的一種或多種修飾的類似 物。示例性的寡核苷酸類似物包括但不限于，LNA (見，例如美國專利 6，316，198號)、PNA (見，例如美國專利6,451,968號)和本文所討論的或 本領(lǐng)域中已知的任何其它核苷酸類似物(見，例如Loakes， i^c/ez'c A z'ds
2001年6月15日;29(12):2437-47，和Karkare等，^ ; / M'craWo/ 說otec/z"o/. 2006年8月;71(5):575-86. Epub 2006年5月9日)。在某些實 施方式中，夾板寡核苷酸包含代替至少一個脫氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸的至 少一個脫氧尿嘧啶(dU)核苷酸。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所需的用途能夠為近感檢測探針的寡核苷酸 部分和/或夾板寡核苷酸選擇適合的序列和長度。關(guān)于選擇用于近感檢測 探針的寡核苷酸部分和或夾板寡核苷酸的示例性方法的討論可見于例如 美國專利6,511,809 B2號和PCT公報WO 2005/123963號。
某些示例性多功能性裂解緩沖液
如上所述，多功能性裂解緩沖液能夠裂解、勻化和/或提取所選擇的 生物樣品而基本不降解目標(biāo)核酸，并且同時保持適當(dāng)?shù)姆治鑫锉砦唤Y(jié)構(gòu)， 從而使近感檢測探針能夠結(jié)合裂解物中的分析物。
在某些實施方式中，多功能性裂解緩沖液包含選自NDSB-201、
31LDAO、 CHAPS、 DEDTAB、 Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一種化 學(xué)品。在各種實施方式中，多功能性裂解緩沖液包含0.01% 20%的選自 NDSB-201、 LDAO、 CHAPS、 DEDTAB、 Zwittergent 3-10和CAPSO中 的至少一種化學(xué)品。在各種實施方式中，多功能性裂解緩沖液包含 0.05% 10%、 0.05% 5%、 0.1°/。 5%、或0.1% 2%的選自NDSB-201、 LDAO、 CHAPS、 DEDTAB、 Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一種化 學(xué)品。在各種實施方式中，多功能性裂解緩沖液包含0.05%、 0.1%、 0.2%、 0.50/。、 1%、 2%、 5%或10。/。的選自NDSB-201、 LDAO、 CHAPS、 DEDTAB、 Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一種化學(xué)品。
在某些實施方式中，多功能性裂解緩沖液包含一種或多種適合于生 物緩沖液的附加成分。示例性的附加成分包括但不限于，緩沖劑、二價 陽離子螯合劑(例如EDTA、檸檬酸鹽和EGTA)、 一價鹽、二價鹽、還原 劑、BSA、酶抑制劑(例如磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和核糖核酸酶抑 制劑)、核酸(例如多聚A、鮭魚精DNA等)、單鏈DNA結(jié)合蛋白等。在 各種實施方式中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所需的應(yīng)用能夠選擇一種或多 種附加成分。在某些實施方式中，多功能性裂解緩沖液包含至少一種緩 沖劑和至少一種二價陽離子螯合劑。在某些實施方式中，多功能性裂解 緩沖液包含選自Tris、 Hepes、 MOPS、 BES、 BICINE、 CAPS、 EPPS、 MES、 PIPES、 TAPS、 TES和TRICINE中的至少一種緩沖劑。在某些實 施方式中，多功能性裂解緩沖液包含Tris和EDTA。
在各種實施方式中，多功能性裂解緩沖液包含10mM 200mM、或 20 mM 100mM的至少一種緩沖劑。
在各種實施方式中，多功能性裂解緩沖液可以具有適于所需用途的
pH，例如適于目標(biāo)核酸和目標(biāo)分析物的pH。在某些實施方式中，多功能 性裂解緩沖液具有5 9的pH。在某些實施方式中，多功能性裂解緩沖 液具有6 8.5的pH。在某些實施方式中，多功能性裂解緩沖液具有6.5 8的pH。
某些示例性的多功能性裂解緩沖液含有NDSB-201 、 Tris和EDTA。
某些示例性蛋白酶
32在各種實施方式中，以蛋白酶處理裂解物以釋放用于分析的核酸。 在某些實施方式中，蛋白酶的選擇基于一種或多種的以下特性使該蛋 白酶失活的容易性、該蛋白酶的活性是否需要金屬離子、該蛋白酶的活 性是否需要去污劑、該蛋白酶消化是否導(dǎo)致核酸的降解、和該蛋白酶是 否釋放目標(biāo)核酸。
在某些實施方式中，選擇能夠被加熱失活的蛋白酶。在某些實施方 式中，選擇能夠被化學(xué)失活的蛋白酶。能夠被用來使蛋白酶失活的某些
示例性的化學(xué)品包括但不限于，AEBSF、抑酶肽、苯丁抑制素、抑凝乳 蛋白酶素、E-64、 EDTA、 EGTA、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制劑A、 1,10-菲咯啉、膦酰二肽和PMSF。在某些實施方式中，該方法中使用了一種或 多種絲氨酸蛋白酶。在某些實施方式中， 一種或多種蛋白酶選自枯草桿 菌蛋白酶(subtilisin carlsberg protease)、鏈霉菌蛋白酶(streptomyces griseus protease)和蛋白酶K。當(dāng)選用鏈霉菌屬蛋白酶時，在某些實施方式中，該 蛋白酶被熱失活。當(dāng)選用蛋白酶K時，在某些實施方式中，該蛋白酶被 化學(xué)失活。
在某些實施方式中，在該方法中使用了多于一種的蛋白酶。當(dāng)使用 多于一種的蛋白酶時，所述蛋白酶可以同時加入，也可以在不同時間加 入。在各種實施方式中，當(dāng)使用多于一種的蛋白酶時，該方法可以包括 一個失活步驟或多于一個的失活步驟。另外，在各種實施方式中，所述 失活步驟可以相同，也可以不同，例如一種或多種失活步驟可以是熱處 理，而一種或多種失活步驟可以是化學(xué)品處理。
在各種實施方式中，例如當(dāng)目標(biāo)分析物是蛋白質(zhì)或肽時，在近感檢 測探針組雜交和/或連接之后，添加蛋白酶。
某些示例性的方法
可以以所例舉的事項的邏輯上可能的任何順序、以及所例舉的事項 順序來進(jìn)行本文所提供的方法。
對于重組DNA、寡核苷酸合成和組織培養(yǎng)可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)?？梢?根據(jù)制造商的說明書和/或如本領(lǐng)域中逋常實施的和/或如本文所述來進(jìn) 行酶促反應(yīng)和純化技術(shù)。 一般可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的常規(guī)方法和按照
33各種常規(guī)的和比較具體的參考文獻(xiàn)所描述的方法來進(jìn)行上述技術(shù)和程 序，所述參考文獻(xiàn)包括但不限于本說明書通篇所引用和討論的參考文獻(xiàn)。
例如參見Sambrook等.分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (1989)); Lehninger，生物化學(xué)(Biochemistry) (Worth Publishers, Inc.);酶學(xué)方法(Methods in Enzymology) (S. Colowick禾口 N. Kaplan編,Academic Press, Inc.);寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis) (N. Gait編，1984);分子克隆實用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)(第2版,Wily Press, l兆8)。除非給出特定定義，否則與本文所述 的與生物學(xué)、生物化學(xué)、分析化學(xué)和有機(jī)合成化學(xué)相關(guān)而使用的術(shù)語和、 實驗室程序和技術(shù)均是本領(lǐng)域中已知和使用的。
本發(fā)明提供了檢測生物樣品中的目標(biāo)分析物和目標(biāo)核酸的方法。在 各種實施方式中，該方法允許檢測同一容器中的至少一種分析物和至少 一種目標(biāo)核酸。例如，在各種實施方式中，將用于檢測至少一種分析物 而進(jìn)行的方法和用于檢測至少一種核酸而進(jìn)行的方法應(yīng)用于同一樣品。 因此，在各種實施方式中，該方法使得所檢測的目標(biāo)分析物的量和所檢 測的目標(biāo)核酸的量之間更好地關(guān)聯(lián)，這是因為例如，該樣品未被分開并 且未經(jīng)歷不同的條件和方法，而不同的條件和方法可能對某些檢測方法 的效率產(chǎn)生不同的影響。
在各種實施方式中，方法包括裂解生物樣品、利用近感檢測測定法 檢測目標(biāo)分析物、和檢測目標(biāo)核酸。在各種實施方式中，檢測目標(biāo)分析 物和檢測目標(biāo)核酸是在同一容器中進(jìn)行的。在各種實施方式中，利用同 一檢測方法檢測一種或多于一種的近感檢測探針組和一種或多于一種的 目標(biāo)核酸。在各種實施方式中，同時檢測一種或多于一種的近感檢測探 針組和一種或多于一種的目標(biāo)核酸。在各種實施方式中，該方法在檢測 一種或多于一種的近感檢測探針組和/或撿測一種或多于一種的目標(biāo)核酸 之前不包括核酸純化步驟。例如，在某些實施方式中，使用第一標(biāo)記來 檢測近感檢測探針組并使用第二標(biāo)記來檢測目標(biāo)核酸。在某些實施方式 中，使用不用的標(biāo)記來檢測各自不同的近感檢測探針組和各自不同的核酸分子。
圖18和圖19顯示了用于根據(jù)某些實施方式來檢測生物樣品中的目 標(biāo)分析物和目標(biāo)核酸的某些示例性作業(yè)流程圖。
圖18顯示下述的用于某些方法的非限制性示例性作業(yè)流程。在多功 能性裂解緩沖液中裂解、勻化和/或提取生物樣品，向裂解物加入至少一 組近感檢測探針。隨后，在可使近感檢測探針的分析物結(jié)合部分與目標(biāo) 分析物結(jié)合的條件下溫育該裂解物。在各種實施方式中，在0t: 45'C的 溫度進(jìn)行溫育。在某些實施方式中，在大于45"C進(jìn)行溫育。在各種實施 方式中，在0。C 10。C、 4。C 15。C、 4'C 30。C、 10。C 20。C、 15°C 30°C、 20°C 30°C、或20'C 40。C的溫度進(jìn)行溫育。在各種實施方式中， 在4°C、 10°C、 20°C、 25°C、 30。C、 37。C或42。C進(jìn)行溫育。在各種實施 方式中，溫育進(jìn)行至少過夜。在各種實施方式中，溫育進(jìn)行至少IO分鐘、 至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少3小時或至少4小時。在 各種實施方式中，溫育進(jìn)行1小時 4小時。
在各種實施方式中，在添加至少一個近感檢測探針組的之前、同時 或之后，向裂解物加入至少一種夾板寡核苷酸。在各種實施方式中，添 加至少一個近感檢測探針組之后，向裂解物加入連接混合物。在某些實 施方式中，該連接混合物在適合的緩沖液中包含適用于將近感檢測探針 組的寡核苷酸部分的末端連接在一起的連接酶。在某些實施方式中，添 加至少一種夾板寡核苷酸之后，添加連接混合物。在某些實施方式中， 在添加至少一種夾板寡核苷酸的同時添加連接混合物。
向裂解物加入連接混合物之后，在各種實施方式中，將該裂解物溫 育至少2分鐘、至少5分鐘、至少10分鐘、至少15分鐘、至少30分鐘 或至少1小時。在某些實施方式中，將裂解物溫育5分鐘 10分鐘。在 各種實施方式中，添加連接混合物之后，將裂解物在(TC 25'C的溫度溫 育。在某些實施方式中，將裂解物在高于25'C的溫度溫育。在各種實施 方式中，將裂解物在0。C 1(TC、 4°C 15°C、 4°C 20°C、 10。C 2(TC或 15。C 25X:的溫度溫育。在某些實施方式中，連接反應(yīng)被終止。在某些 實施方式中，通過向反應(yīng)加入至少一種蛋白酶以終止連接反應(yīng)。當(dāng)夾板
35寡核苷酸包含至少一個dU核苷酸時，在某些實施方式中，通過加入尿嘧
啶DNA糖基化酶來終止連接反應(yīng)。
在各種實施方式中，在向裂解物加入至少一個近感檢測探針組的之 前、同時或之后，向裂解物加入至少一種夾板寡核苷酸。在各種實施方 式中，可省略上述連接步驟。例如，在某些實施方式中，在近感檢測探 針組加入并溫育之后添加至少一種夾板寡核苷酸的情況中，以足以使至 少一種夾板寡核苷酸與至少一種近感檢測探針雜交的溫度和時間進(jìn)一步 溫育裂解物。在各種實施方式中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠為所述雜交選 擇適合的時間和溫度。在各種實施方式中，雜交條件包括0'C 75"的溫 度。在各種實施方式中，溫育在0。C 65。C、 4°C 50°C、 10°C 45°C、 或15。C 40。C進(jìn)行。在各種實施方式中，溫育在10。C、 20°C、 25°C、 30°C、 37°C、 42°C、 50°C、 55°C、 60°C、或65'C進(jìn)行。在各種實施方式 中，溫育進(jìn)行至少4小時。在各種實施方式中，溫育進(jìn)行至少5分鐘、 至少10分鐘、至少30分鐘、至少1小時或至少2小時。
在各種實施方式中，以至少一種蛋白酶處理裂解物。在各種實施方 式中，添加至少一種蛋白酶之后，將裂解物溫育至少5分鐘、至少10分 鐘、至少15分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時或至少4小 時。在各種實施方式中，在(TC 65X:溫育裂解物。在各種實施方式中， 在0。C 55。C、 4'C 50。C、 10。C 45。C或15。C 40。C溫育裂解物。在各 種實施方式中，在4°C、 10°C、 20°C、 25°C、 30°C、 37。C或42。C進(jìn)行溫 育。在某些實施方式中，使至少一種蛋白酶在溫育后失活。在某些實施 方式中，例如通過在至少5(TC溫育裂解物至少5分鐘，至少一種蛋白酶 因加熱而失活。在某些實施方式中，將裂解物在至少55'C、至少60'C、 至少65t:、至少70。C或至少75T:溫育以使蛋白酶熱失活。在某些實施方 式中，例如通過加入至少一種化學(xué)品而使至少一種蛋白酶失活。在某些 實施方式中，通過加入PMSF而使至少一種蛋白酶失活。
在各種實施方式中，使至少一種蛋白酶失活之后，檢測目標(biāo)核酸和 經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的近感檢測探針組。在各種實施方式中，對至少一 種目標(biāo)核酸和至少一種經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的近感檢測探針組的檢測包
36括多重定量PCR。在某些實施方式中，在目標(biāo)核酸是RNA的情況中，在 檢測前將該RNA逆轉(zhuǎn)錄，或?qū)⒃揜NA的逆轉(zhuǎn)錄作為檢測的一部分。
圖19顯示了以下用于某些方法的非限制性示例性作業(yè)流程。圖19 所示的方法與圖18的上述方法相同(貫穿連接步驟)。然而，在蛋白酶 處理之前，取出裂解物的一份等分試樣用于檢測至少一種經(jīng)雜交的和/或 經(jīng)連接的近感檢測探針組。
取出所述等分試樣之后，如以上圖18所述處理剩余的裂解物。剩余 的裂解物被用來檢測所述至少一種目標(biāo)核酸，而所取出的所述等分試樣 被用來檢測所述至少一個經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的近感檢測探針組。在某 些實施方式中，對所述至少一種目標(biāo)核酸的檢測和/或?qū)λ鲋辽僖粋€經(jīng) 雜交的和/或經(jīng)連接的近感檢測探針組的檢測包括定量PCR。在某些實施 方式中，在檢測多于一種的目標(biāo)核酸和/或多于一個的經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連 接的近感檢測探針組的情況中，該檢測包括多重定量PCR。在某些實施 方式中，在目標(biāo)核酸是RNA的情況中，在檢測前將該RNA逆轉(zhuǎn)錄，或 將該RNA的逆轉(zhuǎn)錄作為檢測的一部分。
下面將進(jìn)一步詳細(xì)地描述某些方法的某些方面。
某些示例性裂解
在各種實施方式中，在檢測目標(biāo)分析物和目標(biāo)核酸之前，將所選擇 的生物樣品裂解、勻化和/或提取。在某些實施方式中，在多功能性裂解 緩沖液中進(jìn)行所述裂解、勻化和/或提取。
在各種實施方式中，在所選的生物樣品是個體細(xì)胞的形式的情況中， 以100細(xì)胞4d 200，000細(xì)胞4d的濃度將細(xì)胞重懸在多功能性裂解緩沖 液中。在各種實施方式中，將細(xì)胞以小于100細(xì)胞4d或大于200,000細(xì) 膨W的濃度重懸。在各種實施方式中，將細(xì)胞以500細(xì)淑jal 100，000細(xì) 胞/pl、 1，000細(xì)胞4d 100,000細(xì)胞/ji1、 5,000細(xì)胞/(i 75，000細(xì)胞4d或 10,000細(xì)胞/pl 75,000細(xì)胞l的濃度重懸。在各種實施方式中，將細(xì) 胞以至少1，000細(xì)胞/^1、至少2，000細(xì)胞/pl、至少5,000細(xì)胞/^d、至少 10,000細(xì)膨pl、至少15,000細(xì)膨^11、至少20,000細(xì)鵬|11、至少25，000細(xì) 胞/pi、至少30,000細(xì)胞/pl、至少40,000細(xì)胞/pl或至少50,000細(xì)胞4d的濃度重懸。
在各種實施方式中，在所選的生物樣品是組織的形式的情況中，考 慮到該組織能夠被勻化的效率，可以將該組織勻化到多功能性裂解緩沖 液中，從而使被裂解的組織細(xì)胞的濃度大概相當(dāng)于以上討論的獨立細(xì)胞 濃度。例如，在某些實施方式中，如果該組織的20%不能勻化，則為了
確定細(xì)胞濃度，將其余的80%進(jìn)行計數(shù)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠為多功
能性裂解液中的組織樣品選擇適合的濃度。
相似的是，在所選的生物樣品為其它形式的情況中，例如食物產(chǎn)品 或水或空氣的過濾物，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠估計該樣品中的細(xì)胞(例如 病原體)的預(yù)期數(shù)量，并相應(yīng)地調(diào)整多功能性裂解緩沖液的體積。在各種 實施方式中，在以多功能性裂解緩沖液進(jìn)行裂解、勻化和/或提取之前， 可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方法濃縮所選的生物樣品。
在各種實施方式中，在多功能性裂解緩沖液中懸浮所選的生物樣品 之后，對該裂解物進(jìn)行物理處理從而促進(jìn)該樣品的裂解。所述物理處理 包括但不限于渦旋、凍融循環(huán)(例如，使用干冰、液氮等)、在所選的溫 度旋轉(zhuǎn)、超聲處理等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠選擇適合的物理處理來促 進(jìn)所選的生物樣品的裂解。
裂解之后，在某些實施方式中，離心裂解物以沉淀固體物質(zhì)。在各 種實施方式中，隨后可以將澄清的裂解物轉(zhuǎn)移到新的容器中以存儲。在
各種實施方式中，將裂解物儲存在4'C或冷凍，例如在標(biāo)準(zhǔn)的冷凍機(jī)中、 或在-80 °C冷凍機(jī)中或在液氮中冷凍。 某些示例性的近感檢測測定法
例如美國專利6,511,809 B2號；美國專利公報US 2002/0064779號； PCT公報WO 2005/123963號；美國專利公報US 2005/0003361 Al號； 美國專利公報US 2007/0026430號；Fredricksson等，自然生物技術(shù)(A^ww 說ofec/z.) 20: 473-477 (2002);和Gustafsdottir等，臨床化學(xué)(C"". C/zem/ 52: 1152-1160 (2006)中描述了某些示例性的近感檢測測定法。
在各種實施方式中，近感檢測測定法包括在使得至少一個近感檢測 探針組與至少一種目標(biāo)分析物可相互作用的條件下，將生物樣品或裂解
38物與至少一個近感檢測探針組溫育。當(dāng)該近感檢測測定法是近感連接測 定法時，在各種實施方式中，對于每個近感檢測探針組，向混合物中加 入至少一種夾板寡核苷酸，并且在使得所述至少一種夾板寡核苷酸和近 感檢測探針組的寡核苷酸部分之間可雜交的條件下溫育該混合物。在某 些實施方式中，所述夾板寡核苷酸與兩種寡核苷酸部分雜交從而使第一
寡核苷酸部分的3'末端與第二寡核苷酸部分的5'末端相鄰。在某些實施方 式中，第一寡核苷酸部分的3'末端與第二寡核苷酸部分的5'末端被連接在 一起。在某些實施方式中，由連接酶介導(dǎo)連接。
在某些實施方式中，通過至少一種本文所述的方法檢測經(jīng)連接的產(chǎn) 物。在某些實施方式中，在檢測方法之前，使經(jīng)連接的產(chǎn)物和經(jīng)雜交的 夾板寡核苷酸經(jīng)歷引物延伸反應(yīng)，或者將所述引物延伸反應(yīng)作為檢測方 法的一部分。在某些實施方式中，所述引物延伸反應(yīng)產(chǎn)生雙鏈寡核苷酸。 在某些實施方式中，所述引物延伸反應(yīng)包括與經(jīng)連接的產(chǎn)物互補(bǔ)的至少 一種寡核苷酸引物。在某些實施方式中，所述夾板寡核苷酸在引物延伸 反應(yīng)中與另一寡核苷酸引物一起作為引物。在某些實施方式中，在引物 延伸反應(yīng)中包括了除所述夾板寡核苷酸之外的兩種寡核苷酸引物。在某 些實施方式中，在產(chǎn)生雙鏈寡核苷酸的引物延伸反應(yīng)之后，該雙鏈寡核 苷酸的第一條鏈包含經(jīng)連接的寡核苷酸部分，并且第二條鏈包含了夾板 寡核苷酸的序列，所述夾板寡核苷酸連接在(i)與第一寡核苷酸部分的至 少一部分互補(bǔ)的第一序列，并且還連接在(ii)與第二寡核苷酸部分的至少 一部分互補(bǔ)的第二序列。
在各種實施方式中，在檢測方法涉及一種或多于一種的寡核苷酸(例 如， 一種或多于一種的寡核苷酸引物和/或含有寡核苷酸的檢測探針)的雜 交的情況中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠選擇適合的核苷酸序列從而使該寡 核苷酸能夠被用來特異性地檢測經(jīng)連接的產(chǎn)物。例如，在某些實施方式 中，在使經(jīng)連接的寡核苷酸部分進(jìn)行引物延伸反應(yīng)的情況中，可以選擇 與引物延伸產(chǎn)物雜交并且不與所述寡核苷酸部分或夾板寡核苷酸雜交的 一種或多于一種的的寡核苷酸。在各種實施方式中，所述寡核苷酸可以 被用于直接檢測方法和/或涉及擴(kuò)增步驟的檢測方法。在某些實施方式中，可以選擇一種或多于一種的的寡核苷酸來擴(kuò)增經(jīng)連接的寡核苷酸部分從 而使擴(kuò)增只當(dāng)所述部分已被連接在一起時發(fā)生。
在各種實施方式中，當(dāng)近感檢測測定法是近感相互作用測定法時， 第一近感檢測探針的寡核苷酸部分能夠與第二近感檢測探針的寡核苷酸 部分雜交。作為選擇，在某些實施方式中，對于每個近感檢測探針組， 向該混合物中加入至少一種夾板寡核苷酸。在各種實施方式中，隨后在 可使可雜交的寡核苷酸部分之間、和/或寡核苷酸部分與至少一種夾板寡 核苷酸之間雜交的條件下溫育該餛合物。
在某些實施方式中，在檢測方法之前使經(jīng)雜交的寡核苷酸進(jìn)行引物 延伸反應(yīng)，或?qū)⒃撗由旆磻?yīng)作為檢測方法的一部分。在某些實施方式中， 當(dāng)寡核苷酸部分相互雜交時，引物延伸反應(yīng)從每一寡核苷酸部分的末端 延伸從而產(chǎn)生雙鏈寡核苷酸，該雙鏈寡核苷酸包含含有與互補(bǔ)于第二 寡核苷酸部分的至少一部分的序列相連接的第一寡核苷酸部分的第一條 鏈，和含有與互補(bǔ)于第一寡核苷酸部分的至少一部分的序列相連接的第 二寡核苷酸部分的第二條鏈。在某些實施方式中，利用至少一種寡核苷 酸引物對所述雙鏈寡核苷酸進(jìn)行進(jìn)一步的引物延伸反應(yīng)。在某些實施方 式中，利用至少兩種寡核苷酸弓i物對所述雙鏈寡核苷酸進(jìn)行進(jìn)一步的弓f 物延伸反應(yīng)。
在某些實施方式中，當(dāng)至少一種夾板寡核苷酸與寡核苷酸部分雜交 時，該夾板寡核苷酸在引物延伸反應(yīng)中與第二寡核苷酸引物共同作為引 物，從而產(chǎn)生雙鏈寡核苷酸。在某些實施方式中，所述雙鏈寡核苷酸包 含含有所述寡核苷酸部分中的每一種寡核苷酸部分的序列的至少一部 分的第一條鏈，和含有所述夾板寡核苷酸的序列的第二條鏈，所述夾板 寡核苷酸的序列連接于與所述寡核苷酸部分中的一種寡核苷酸部分的至 少一部分互補(bǔ)的序列。
在某些實施方式中，通過本文所述的至少一種方法檢測經(jīng)雜交的寡 核苷酸。在各種實施方式中，在所述檢測方法涉及一種或多于一種的寡 核苷酸(例如， 一種或多于一種的寡核苷酸引物和域含有寡核苷酸的檢測 探針)的雜交的情況中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠選擇適合的核苷酸序列從而使該一種或多于一種的寡核苷酸能夠被用來特異性地檢測經(jīng)雜交的產(chǎn) 物。例如，在某些實施方式中，在對經(jīng)雜交的寡核苷酸部分進(jìn)行引物延 伸反應(yīng)的情況中，可以選擇與引物延伸產(chǎn)物雜交并且不與所述寡核苷酸 部分雜交的一種或多于一種的的寡核苷酸。在各種實施方式中，所述寡 核苷酸可以被用于直接檢測方法中和/或涉及擴(kuò)增步驟的檢測方法中。 用于近感檢測測定法的某些示例性的標(biāo)準(zhǔn)化物對照
在各種實施方式中，可以針對至少一種標(biāo)準(zhǔn)化物對照將目標(biāo)核酸的 量標(biāo)準(zhǔn)化。在各種實施方式中，可以針對至少一種標(biāo)準(zhǔn)化物對照將目標(biāo)
分析物的量標(biāo)準(zhǔn)化。例如本文和PCT公報WO 2005/123963號描述了某 些示例性的標(biāo)準(zhǔn)化物對照。在各種實施方式中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠 為具體應(yīng)用選擇一種或多于一種的標(biāo)準(zhǔn)化物對照。
在各種實施方式中，樣品含有至少一種標(biāo)準(zhǔn)化物對照、至少兩種標(biāo) 準(zhǔn)化物對照、至少三種標(biāo)準(zhǔn)化物對照、至少四種標(biāo)準(zhǔn)化物對照、或至少 五種標(biāo)準(zhǔn)化物對照。在某些實施方式中，樣品含有至少一種分析物標(biāo)準(zhǔn) 化物對照和至少一種核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照。在某些實施方式中，樣品含有 至少一種內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)化物對照和至少一種外源性標(biāo)準(zhǔn)化物對照。在某些 實施方式中，樣品中的所有標(biāo)準(zhǔn)化物對照均是內(nèi)源性的。在某些實施方 式中，樣品中的所有標(biāo)準(zhǔn)化物對照均是外源性的。在某些實施方式中， 分析物標(biāo)準(zhǔn)化物對照被用來使目標(biāo)分析物標(biāo)準(zhǔn)化。在某些實施方式中， 核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照被用來使目標(biāo)分析物標(biāo)準(zhǔn)化。在某些實施方式中，核 酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照被用來使目標(biāo)核酸標(biāo)準(zhǔn)化。在某些實施方式中，分析物 標(biāo)準(zhǔn)化物對照被用來使目標(biāo)核酸標(biāo)準(zhǔn)化。在某些實施方式中，使目標(biāo)核 酸和目標(biāo)分析物針對同一標(biāo)準(zhǔn)化物對照標(biāo)準(zhǔn)化。在某些實施方式中，使 目標(biāo)核酸和目標(biāo)分析物針對不同的標(biāo)準(zhǔn)化物對照標(biāo)準(zhǔn)化。
在某些實施方式中，在檢測目標(biāo)分析物和/或目標(biāo)核酸的同一裂解物 中檢測標(biāo)準(zhǔn)化物對照。在某些實施方式中，在檢測目標(biāo)分析物和/或目標(biāo) 核酸的同一容器中使用相同或不同的方法檢測標(biāo)準(zhǔn)化物對照。在各種實 施方式中，將裂解物分開或分份，并在不同的容器中使用相同或不同的 方法檢測標(biāo)準(zhǔn)化物對照以及目標(biāo)分析物和目標(biāo)核酸中的至少一種。在各
41種實施方式中，在檢測目標(biāo)分析物和目標(biāo)核酸中的至少一種的同時檢測 標(biāo)準(zhǔn)化物對照。
在某些實施方式中，可以使用ACT法針對標(biāo)準(zhǔn)化物對照將目標(biāo)分析 物的量標(biāo)準(zhǔn)化。在某些實施方式中，可以使用AACT法針對標(biāo)準(zhǔn)化物對照 將目標(biāo)分析物的量標(biāo)準(zhǔn)化。在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照的使用使 得可以不必使用分析物來制備外部標(biāo)準(zhǔn)曲線，該分析物可以產(chǎn)生與當(dāng)裂 解物中存在相等含量的所述分析物時所觀察到的Ct僮不同的Ct惶。
在某些實施方式中，可以使用ACT法針對標(biāo)準(zhǔn)化物對照將目標(biāo)核酸 的量標(biāo)準(zhǔn)化。在某些實施方式中，可以使用AACT法針對標(biāo)準(zhǔn)化物對照將 目標(biāo)核酸的量標(biāo)準(zhǔn)化。在某些實施方式中，標(biāo)準(zhǔn)化物對照的使用使得可 以不必使用核酸來制備外部標(biāo)準(zhǔn)曲線，該核酸可以產(chǎn)生與通過裂解物的 相等含量的所述核酸所觀察到的Ct僮不同的Ct僮。
在各種實施方式中，使用標(biāo)準(zhǔn)化物對照可以控制近感檢測測定法中 的變量。近感檢測測定法中的某些示例性的變量包括但不限于，核酸降 解度、分析物降解度、分析物表位結(jié)構(gòu)得以保持的程度、近感檢測探針 與分析物結(jié)合的效率、連接反應(yīng)的效率和實時PCR反應(yīng)的效率。
在各種實施方式中，使用近感檢測測定法檢測分析物標(biāo)準(zhǔn)化物對照。 本文描述了某些示例性的近感檢測測定法。在某些實施方式中，使用與 目標(biāo)分析物相同的方法(利用適合的近感檢測探針)并在與目標(biāo)分析物相 同的容器中檢測分析物標(biāo)準(zhǔn)化物對照。在某些實施方式中，使用與目標(biāo) 分析物相同的方法(利用適合的近感檢測探針)但在與目標(biāo)分析物不同的 容器中檢測分析物標(biāo)準(zhǔn)化物對照。
在各種實施方式中，通過直接檢測法或通過涉及擴(kuò)增步驟的檢測法， 檢測核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照和/或用于檢測分析物標(biāo)準(zhǔn)化物對照的近感檢測探 針。本文描述了檢測核酸和/或近感檢測探針的某些示例性方法。在某些 實施方式中，使用不同的標(biāo)記來檢測核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照、目標(biāo)核酸、用 于檢測分析物標(biāo)準(zhǔn)化物對照的近感檢測探針、和/或用于檢測目標(biāo)分析物 的近感檢測探針。
在核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照是RNA的各種實施方式中，將該核酸標(biāo)準(zhǔn)化物
42對照進(jìn)行預(yù)處理從而將其轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蚴褂门c用于檢測近感檢測探針、目 標(biāo)核酸和/或第二核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照的方法相同的方法進(jìn)行檢測的形式。
在各種實施方式中，使用實時PCR檢測核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照和/或用于 檢測分析物標(biāo)準(zhǔn)化物對照的近感檢測探針。在某些實施方式中，使用PCR 和連接的組合來檢測核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照和/或用于撿測分析物標(biāo)準(zhǔn)化物對 照的近感檢測探針。例如，在某些實施方式中，通過首先以PCR擴(kuò)增和 隨后應(yīng)用連接探査(ligation inquiry)來檢測核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照和/或用于檢 測分析物標(biāo)準(zhǔn)化物對照的近感檢測探針。某些示例性的所述方法是本領(lǐng) 域中已知的，并且在例如Chen等，"A homogeneous, ligase-mediated DNA diagnostic test," C e"ome及^. 8(5):549-56 (1998)中有描述。
在某些實施方式中，使用涉及首先進(jìn)行連接反應(yīng)、隨后進(jìn)行PCR擴(kuò) 增的方法來檢測核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照。某些示例性的所述方法是本領(lǐng)域中 已知的，并且在例如美國專利4,797,470號中有描述。例如，在某些實施 方式中，核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照能夠與至少兩種寡核苷酸雜交。在某些實施 方式中，通過連接使所述至少兩種寡核苷酸能夠接合。在某些實施方式 中，所述寡核苷酸中每一種的可連接末端被核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照帶到一起。 在某些實施方式中，兩種寡核苷酸與連接模板雜交，從而使第一寡核苷 酸的3'末端與第二寡核苷酸的5'末端相鄰。在某些實施方式中，通過連接 將所述寡核苷酸中每一種的可連接末端接合。在某些實施方式中，該連 接由連接酶介導(dǎo)。通過涉及連接的方法檢測核酸標(biāo)準(zhǔn)化物對照可以在某 些實施方式中控制近感檢測測定法中的連接反應(yīng)步驟的效率。
某些示例性封閉劑
在某些實施方式中，在至少一種封閉劑的存在下進(jìn)行近感檢測測定 法。在各種實施方式中，在分析物封閉劑和/或核酸封閉劑的存在下進(jìn)行 近感檢測測定法。在某些實施方式中，分析物封閉劑是蛋白質(zhì)。在某些 實施方式中，蛋白質(zhì)封閉劑是明膠。在某些實施方式中，核酸封閉劑主 要是單鏈核酸。在某些實施方式中，核酸封閉劑主要是雙鏈核酸。
在某些實施方式中，向多功能性裂解緩沖液加入至少一種封閉劑。 在某些實施方式中，向裂解物加入至少一種封閉劑。在某些實施方式中，在添加一種或多于一種的近感檢測探針的之前或同時，向裂解物加入至 少一種封閉劑。在某些實施方式中，在檢測經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的核酸 部分和/或目標(biāo)核酸之前，向裂解物加入至少一種封閉劑。在某些實施方 式中，加入至少一種分析物封閉劑和至少一種核酸封閉劑。在各種實施 方式中，當(dāng)加入多于一種的封閉劑時，可以在相同或不同的時間加入所 述多于一種的封閉劑。
圖20顯示在某些分析物封閉劑、0.1%冷魚明膠和1%BSA的存在下 進(jìn)行的檢測VEGF的近感連接測定法的示例性結(jié)果。在這些示例性結(jié)果 中，近感連接反應(yīng)在0.1%冷魚明膠和1%BSA中進(jìn)行的同樣好。
圖21顯示在某些核酸封閉劑、多聚A、多聚dC、多聚dG+多聚dC、 和經(jīng)剪切的小牛胸腺DNA( "CFD")的存在下進(jìn)行的檢測VEGF的近感 連接測定法的示例性結(jié)果。圖21中的對照是在于4。C儲存至少2周的多 聚A的存在下進(jìn)行的。在這些示例性結(jié)果中，在雙鏈核酸封閉劑(多聚dG+ 多聚dC和經(jīng)剪切的小牛胸腺DNA)的存在下進(jìn)行的近感連接測定法比在 單鏈核酸封閉劑(多聚A和多聚dC)的存在下進(jìn)行的近感連接測定法顯示 了更大的檢測范圍。
某些示例性的連接反應(yīng)終止
在某些實施方式中，在檢測經(jīng)連接的產(chǎn)物之前要終止近感連接測定 法中的連接反應(yīng)。在某些實施方式中，在儲存近感連接測定物之前終止 連接反應(yīng)?？梢栽跈z測經(jīng)連接的產(chǎn)物之前或之后儲存近感連接測定物。 在某些實施方式中，連接反應(yīng)的終止減少了可以隨著時間(例如，在近感 檢測測定物的儲存過程中)而積累的額外的已連接產(chǎn)物的量。
在某些實施方式中，通過以蛋白酶處理來終止該連接反應(yīng)。本文描 述了某些示例性的蛋白酶。在某些實施方式中，通過改變夾板寡核苷酸 來終止連接反應(yīng)。在某些實施方式中，近感檢測測定法中所用的夾板寡 核苷酸包含替代脫氧胸腺嘧啶(dT)的脫氧尿嘧啶(dU)。在某些實施方式 中，通過在連接步驟之后向近感檢測測定物中加入尿嘧啶-DNA糖基化酶 (UNG)來改變含dU的夾板寡核苷酸。在某些實施方式中，改變夾板寡核 苷酸減少了可在檢測經(jīng)連接的產(chǎn)物的過程中形成的不需要的引物延伸產(chǎn)物。
圖22顯示使用含dU的夾板寡核苷酸檢測MCP-1的近感檢測測定法 的示例性結(jié)果。在連接反應(yīng)之后經(jīng)過和不經(jīng)過UNG處理，并且在檢測連 接產(chǎn)物之前經(jīng)過和不經(jīng)過凍融循環(huán)，由此來進(jìn)行所述測定法。顯示的有 以O(shè)U、 0.002 U、 0.02 U和0.2 U的UNG的示例性處理。在該示例性實 驗中，在37。C持續(xù)15分鐘、隨后在95i:持續(xù)3分鐘來進(jìn)行UNG處理。 另外，在該示例性實驗中，在UNG處理之后立即(實線)、和UNG處理 與1循環(huán)凍融24小時之后(虛線)進(jìn)行qPCR來檢測連接產(chǎn)物。示例性數(shù) 據(jù)顯示UNG溫育步驟的引入，在某些實施方式中，減少了連接產(chǎn)物隨時 間的積累。
近感檢測探針和目標(biāo)核酸的某些示例性檢測
在各種實施方式中，可以分別地和/或同時地，在各種實施方式中， 檢測近感檢測探針的經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分和目標(biāo)核酸。 在某些實施方式中，在同一容器中，同時地或不同時地檢測近感檢測探 針的經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分和目標(biāo)核酸。在某些實施方式 中，例如當(dāng)目標(biāo)核酸是RNA時，將該目標(biāo)核酸進(jìn)行預(yù)處理從而將其轉(zhuǎn)變 為能夠使用與用于檢測近感檢測探針的經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸 部分的方法相同的方法進(jìn)行檢測的形式。所述預(yù)處理包括但不限于逆轉(zhuǎn) 錄。
在某些實施方式中，將近感檢測探針的經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核 苷酸部分進(jìn)行預(yù)處理從而將它們轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蚴褂门c用于檢測目標(biāo)核酸的 方法相同的方法進(jìn)行檢測的形式。所述預(yù)處理包括但不限于連接和引物 延伸反應(yīng)。在某些實施方式中，當(dāng)對經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部 分的檢測涉及擴(kuò)增時，預(yù)處理引物延伸反應(yīng)不是必須的，這是因為擴(kuò)增 條件將使弓I物延伸反應(yīng)在擴(kuò)增之前或擴(kuò)增的同時發(fā)生。
在某些實施方式中，將裂解物分開或分份，并在分開的容器中使用 相同的或不同的方法檢測目標(biāo)核酸和近感檢測探針的經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連 接的寡核苷酸部分。在某些實施方式中，在近感檢測探針已被雜交和/或 連接之后將裂解物分開。在某些實施方式中，在直到檢測之前的所有步
45驟都已經(jīng)進(jìn)行之后將裂解物分開。例如，在某些實施方式中，將裂解物 單獨分開以利于分別檢測近感檢測探針組和目標(biāo)核酸，從而，例如，可 以在各自的檢測方法中使用相同的檢測探針進(jìn)行檢測。在各種實施方式 中，可以在裂解之后、近感檢測探針結(jié)合之后、近感檢測探針的雜交和/ 或連接之后、或蛋白酶處理之后將裂解物分開。
在目標(biāo)核酸是RNA的某些實施方式中，在所選的檢測方法之前或進(jìn) 行該方法的過程中對目標(biāo)核酸進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。目標(biāo)核酸的DNA拷貝也被稱 為目標(biāo)核酸(雖然RNA拷貝可以被稱為目標(biāo)RNA核酸，DNA拷貝可以 被稱為目標(biāo)DNA核酸)。在各種實施方式中，在目標(biāo)核酸RNA己經(jīng)被逆 轉(zhuǎn)錄成為目標(biāo)核酸DNA之后，可以通過與檢測近感檢測探針的經(jīng)雜交的 和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分的方法相同的方法檢測目標(biāo)核酸DNA。在某 些實施方式中，在同一容器中并通過相同的檢測方法同時檢測目標(biāo)核酸 DNA和近感檢測探針的經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分。
在某些實施方式中，在同一容器中同時檢測多種近感檢測探針的經(jīng) 雜交的和/或經(jīng)連接的多種寡核苷酸部分和多種目標(biāo)核酸。在某些實施方 式中，使用不同的標(biāo)記以鑒定不同的近感檢測探針組和不同的目標(biāo)核酸。 例如，在某些實施方式中，如果在生物樣品中檢測五種目標(biāo)分析物和五 種目標(biāo)核酸，并且使用單一的檢測反應(yīng)來檢測五種不同的近感檢測探針 組的經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分和五種不同的目標(biāo)核酸，則可 以使用十種不同的標(biāo)記來分別鑒定不同的產(chǎn)物。在各種實施方式中，所 述標(biāo)記可以是本文所討論的檢測探針的形式、或適合于在該檢測方法中 使用的本領(lǐng)域中已知的任何其它標(biāo)記的形式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠根 據(jù)各種實施方式選擇適合的一種或多種標(biāo)記。
在某些實施方式中，可以使用實時PCR來檢測近感檢測探針的經(jīng)雜 交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分和/或目標(biāo)核酸。進(jìn)行實時PCR的示例 性方法包括但不限于，5'核酸酶實時PCR及其多重方案。5'核酸酶實時 PCR的某些示例性方法是本領(lǐng)域中已知的，并且在例如Livak, "SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction,"分子生物學(xué)方法(Mef/20(is M / 所o/.) 212:129-47 (2003); Lee等，"Seven-color, homogeneous detection of sixPCR products,"生物技術(shù)(歷ofec^"/《way, 27(2):342-349 (1999); Livak, "Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay," 遺傳分析(Gfe""14(5曙6):143-149 (1999); Heid等，"Real time quantitative PCR,"基因組研究(Ge"owe及as.) 6(10):986-994 (1996);和Lee 等，"Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes," 核酸研究(iVwcto'c Jcz'A ll;21(16):3761-3766 (1993)中有描述。示例性 的定量PCR在例如A-Z Quantitative PCR, Bustin， S.編，IUL Biotechnology Series (2004)中有描述。例如Watson等，J 7b;dco/. 2005 May-Jun;24(3):139-145,以及美國專利6,890,718號；6,773,817號和 6,258,569號也描述有實時PCR的某些示例性方法。在某些實施方式中， 使用TaqMan —步qRT-PCR (Applied Biosystems)檢測目標(biāo)核酸。
在各種實施方式中，可以在定量PCR方法中使用惰性參比染料 (passive reference dye)。例如美國專利5,736,333號描述了某些示例性的惰 性參比染料。在各種實施方式中，可以在定量PCR方法中使用外部對照。 例如美國專利6，890，718號描述了某些示例性的定量對照。
在某些實施方式中，使用PCR和連接的組合來檢測近感檢測探針的 經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分和/或目標(biāo)核酸。作為非限制性實 例，通過首先進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后應(yīng)用連接探查，可以檢測近感檢測探 針的經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分。某些示例性的所述方法是本 領(lǐng)域中已知的，并且在例如Chen等，"A homogeneous, ligase-mediated DNA diagnostic test," Was. 8(5):549-56 (1998)中有描述。作為另一
個非限制性實例，通過首先進(jìn)行連接反應(yīng)、隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以檢 測近感檢測探針的經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分。某些示例性的 所述方法是本領(lǐng)域中已知的，并且在例如美國專利4，797，470中有描述。
在各種實施方式中，例如在美國專利6,511,810號所述，連接測定物 可以包含側(cè)翼核酸內(nèi)切酶(flap endo皿clease)。
在某些實施方式中，將近感檢測探針的經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核 苷酸部分和/或目標(biāo)核酸在第一 "預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)"(例如在PCT公報 WO2004/051218號中所述)中擴(kuò)增，然后在第二擴(kuò)增反應(yīng)中譯碼。某些示
47例性的所述方法是本領(lǐng)域中已知的，并且在例如美國專利6，605，451號； Lao等的美國專利申請11/090,468號和Andersen等的美國專利申請 11/090,830號中有描述。
檢測近感檢測探針的經(jīng)雜交的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分和/或目 標(biāo)核酸的某些示例性方法還在例如美國專利6,511,809 B2號；美國公報 US 2002/0064779 Al號；和PCT公報WO 2005/123963號中有描述。例 如Bodeau等的美國專利申請11/372,242號描述了某些示例性的多重檢測 方法。
在各種實施方式中，檢測探針被用于促進(jìn)對近感檢測探針的經(jīng)雜交 的和/或經(jīng)連接的寡核苷酸部分和/或目標(biāo)核酸和/或擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。本文 討論了某些示例性的檢測探針。在各種實施方式中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員 能夠根據(jù)所需應(yīng)用選擇一種或多于一種的適合的檢測探針。
示例性試劑盒
在各種實施方式中，提供了包含用于進(jìn)行所述方法的至少一種成分 的試劑盒。在各種實施方式中，試劑盒包含至少一種多功能性裂解緩沖 液。在各種實施方式中，試劑盒包含至少一個近感檢測探針組。在各種 實施方式中，試劑盒包含至少一種蛋白酶。在各種實施方式中，試劑盒 包含至少一種連接酶。在各種實施方式中，試劑盒包含至少一種標(biāo)準(zhǔn)化
物對照。
在各種實施方式中，試劑盒包含檢測近感檢測探針組和/或目標(biāo)核酸
用的至少一種成分。在各種實施方式中，試劑盒包含檢測標(biāo)準(zhǔn)化物對照 用的至少一種成分。示例性的成分包括但不限于，檢測探針、引物、聚 合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。 實施例
實施例l:細(xì)胞裂解物中蛋白質(zhì)和mRNA的定量檢測 通過在1000xg離心5分鐘來沉淀Raji人B-細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞。以 50,000細(xì)胞/pl的PBS的濃度重懸細(xì)胞。向懸浮液加入等體積的2X緩沖 液N (2x緩沖液N是0.2% NDSB-201 、 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)和1 mM EDTA (pH 8.0))，并通過渦旋充分混合5秒鐘。
48近感連接測定法
選擇五種目標(biāo)分析物以通過近感連接測定法檢測。所述目標(biāo)分析物
是 ADAM9 (ADAM 金屬肽酶結(jié)構(gòu)域 9; http:〃www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl gene=ADAM9&search=ADA M9);CCL5(趨化因子(C-C基元)配體 5; http:〃www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl gene=CCL5&search=ccl5); CSTB (半胱氨酸蛋白酶抑制劑 B; http :〃www.genecards. org/ cgi-bin/ carddisp .pl gene=CSTB&search=cy statin+ B); SMAD4 (Mothers against DPP 同源物 4; http:〃www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl gene=SMAD4&search=smad4); 和 RUNX1 (Runt 相 關(guān) 轉(zhuǎn) 錄 因 子 1; http:〃www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl gene=RUNXl &search=runx 1 )。 在該實驗中，對于每一種目標(biāo)分析物分別進(jìn)行近感連接測定法。
近感檢測探針由Simon Fredriksson提供。PCT公報WO 2005/123963 號描述了示例性的近感檢測探針和設(shè)計近感檢測探針的方法。對于每一 種分析物，合成兩種寡核苷酸，第一種具有5'-結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白， 第二種具有3'-結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白。將5 pi的200 nM的第一種鏈 霉抗生物素蛋白結(jié)合的寡核苷酸的儲備液與5 ^的200 nM的生物素化的 抗所選目標(biāo)分析物的多克隆抗體(所有生物素化的多克隆抗體均獲得自 R&D Systems)在緩沖液C (1 XPBS(pH 7.4), 0.1% BSA, 5 nM EDTA)中的 儲備液混合。相似地，將5 ^的200nM的第二種鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合 的寡核苷酸的儲備液與5 ^的200 nM的生物素化的抗所選目標(biāo)分析物的 多克隆抗體在緩沖液C中的儲備液混合。將混合物在室溫溫育1小時。 通過將99|il緩沖液D(l XPBS (pH 7.4)、 1°/。 BSA、 1 mM生物素和16嗎/ml 多聚A)加到近感檢測探針中，將每種近感檢測探針在緩沖液D中稀 釋至lnM。這得到用于五種目標(biāo)分析物中每一種的第一和第二近感檢測 探針(即近感檢測探針組)。
為了形成五種單獨的溶液，其中每種溶液具有五種不同的近感檢測 探針組中的一個，將探針組的第一和第二近感檢測探針在緩沖液D中以
49每種近感檢測探針100 pM的濃度結(jié)合。通過以緩沖液D稀釋來制備具有 5000細(xì)胞/^il、 500細(xì)胞/pl或50細(xì)胞4d的當(dāng)量的3種濃度的細(xì)胞裂解物。 向細(xì)胞裂解物稀釋液中加入磷酸酶抑制劑混合物(100XHALT磷酸酶抑 制劑混合物，Pierce目錄號為7S420)至1 X的濃度從而保護(hù)第二近感檢測 探針的5'磷酸。將lpi的在緩沖液N中的細(xì)胞裂解物與1^1的近感檢測探 針對溶液混合并在37X:溫育1小時。探針結(jié)合混合物中的每一種近感檢 測探針的濃度為50pM。
對于探針連接， 一種或多種夾板寡核苷酸由SimonFredriksson提供。 PCT公報WO 2005/123963號描述了示例性的夾板寡核苷酸和設(shè)計夾板 寡核苷酸的方法。每種夾板寡核苷酸能夠與近感檢測探針組的寡核苷酸 部分中的每一種的一部分雜交從而使近感檢測探針組中的第一寡核苷酸 部分的自由3'末端與近感檢測探針組中的第二寡核苷酸部分的自由5'末 端相鄰。每種夾板寡核苷酸均是非對稱的(見例如PCT公報WO 2005/123963號)。向探針結(jié)合混合物中加入120 jlU的連接溶液(l XPCRII 緩沖液(Applied Biosystems)、 100 nM夾板寡核苷酸、1.5 mM MgCl2、 0.3 mM NAD、 10mMDTT和2.5單位擴(kuò)增酶(Ampligase)(Epicentre))。 Raji細(xì)胞 在3種連接混合物(對于每個近感檢測探針組)中的當(dāng)量濃度是約41.7細(xì) 胞/nl、 4.17細(xì)胞/pl和0.417細(xì)胞爾1。將連接混合物在3(TC溫育10分鐘。 取出2(^1約含有41.7細(xì)胞/jil和4.17細(xì)胞/nl的連接混合物留作mRNA 檢測用(在下文描述)。
使用實時PCR按照以下方式檢測經(jīng)連接的近感檢測探針組。將iow 的連接混合物與10(^1的2 X Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems;目錄號4367218)和每種0.04 jil的正向和反向引物混合(對于 每種引物，弓i物終濃度是400nM)，所述正向和反向引物是為了擴(kuò)增近感 檢測探針對的經(jīng)連接的寡核苷酸部分、而不是擴(kuò)增未連接的近感檢測探 針而設(shè)計的。正向和反向引物由Simon Fredriksson提供。PCT公報WO 2005/123963號描述了示例性的正向和反向引物序列。根據(jù)Power SYBR Green PCR Master Mix方案(Applied Biosystems;目錄號431025 l)進(jìn)行實 時PCR。mRNA檢測
在37。C以5 jil的鏈霉菌蛋白酶(streptomyces griseus protease) (Fluka 目錄號81748; 6.34 U/mg，濃度2，5 U/pl)處理20 jil連接混合物樣品60分 鐘。隨后用10分鐘將該混合物加熱至75X:以降低或消除蛋白酶活性。經(jīng) 蛋白酶處理的連接混合物被稱為"mRNA樣品"。Raji細(xì)胞在兩種mRNA 樣品(對于每個近感檢測探針組)中的當(dāng)量濃度約為33.3細(xì)胞/nl和3.33細(xì)
通過加入100 pl水和5 pl的50嗎/jal BSA(Ambion;目錄號2616)將 25 lil的mRNA樣品按約l:5稀釋。BSA在經(jīng)稀釋的mRNA樣品中的終 濃度因此約為2嗎/ji1，并且Raji細(xì)胞在兩種經(jīng)稀釋的mRNA樣品(對于 每個近感檢測探針組)中的當(dāng)量濃度約為6.6細(xì)胞/pJ和0.66細(xì)胞/pl。在 25 jil TaqMan —步qRT-PCR反應(yīng)中使用5^1的經(jīng)稀釋的mRNA樣品。對 于每個近感檢測探針組，RT-PCR反應(yīng)中的Raji細(xì)胞的當(dāng)量總數(shù)約為33 細(xì)胞和3.3細(xì)胞，假定RNA濃度為約15 pg/細(xì)胞，則其分別約相當(dāng)于 0.5 ng總RNA和0.05 ng總RNA。以1 X的濃度使用TaqMan基因表達(dá) 測定引物和探針(Applied Biosystems;目錄號SMAD4: Hs00232068—ml; CCL5: Hs00174575—ml; CSTB: Hs00164368—ml; ADAM9: Hs00177638—ml; RUNX1: Hs00234079—ml)，并根據(jù)制造商的方案 (Applied Biosystems;試劑盒目錄號4309169;方案目錄號4310299)使用 Applied Biosystems TaqMan —步RT-PCR Mastermix試劑盒進(jìn)行一步 RT-PCR反應(yīng)。將連接混合物中18SRNA的檢測作為對照(使用18SRNA 對照試劑，Applied Biosystems,目錄號4308329)。最后，對于每種所選目 標(biāo)均使用100 ng從Raji細(xì)胞純化的RNA作為陽性對照。除了在單一孔 中進(jìn)行的陽性對照，每一反應(yīng)均按3次重復(fù)進(jìn)行。五種所選的目標(biāo)分析 物全部使用FAM檢測，而18S則使用VIC檢測。
該實驗中的近感連接測定法和mRNA檢測測定法的結(jié)果如下所示。 圖1顯示了對于每種目標(biāo)分析物在3種所檢測的Raji細(xì)胞裂解物濃度的 平均循環(huán)閾值(Ct)。該數(shù)據(jù)表明這一近感連接測定法實驗成功地以計量依 賴的方式檢測到了CSTB。圖2顯示了如上所述對于用于檢測目標(biāo)mRNA的TaqMan —步 qRT-PCR反應(yīng)中的每一種的熒光相對增加(ARn)對循環(huán)的關(guān)系。圖2中只 檢測了 FAM層，所以使用VIC的18S反應(yīng)是不可檢測的。除了陽性對照， 每一反應(yīng)均按3次重復(fù)進(jìn)行。該數(shù)據(jù)顯示了幾乎所有的TaqMan —步 qRT-PCR反應(yīng)均產(chǎn)生了可檢測的擴(kuò)增產(chǎn)物。大幅度的熒光相對增加表明 對于每種目標(biāo)mRNA均實現(xiàn)了相對明顯的擴(kuò)增。
圖3通過在其中進(jìn)行反應(yīng)的96孔板中的孔位，顯示了對于TaqMan 一步qRT-PCR反應(yīng)中的每一種的循環(huán)閾值(Ct)的圖。圖3中只檢測了 FAM 層，所以使用VIC的18S反應(yīng)是不可檢測的。反應(yīng)的孔位如下。孔A1-A12 (圖3上的l-12)含有對于五種目標(biāo)mRNA中的四種(ADAM9在孔A1-A3 中、CCL5在孔A4-A6中、CSTB在孔A7-A9中、SMAD4在孔A10-A12 中)使用較高Raji細(xì)胞當(dāng)量濃度(33細(xì)胞/反應(yīng))的3次重復(fù)反應(yīng)。孔Bl-B6 (圖3上的13-18)含有對于RUNXl (孔B1-B3)和對照RNA 18S (孔B4-B6) 使用最高Raji細(xì)胞當(dāng)量濃度(33細(xì)胞/反應(yīng))的3次重復(fù)反應(yīng)?？譈7-B12 (圖3上的19-24)含有陽性對照反應(yīng)，所述陽性對照反應(yīng)使用從Raji細(xì)胞 中純化的100 ng RNA以檢測每種所選目標(biāo)(分別在孔B7-B11中的 ADAM9、 CCL5、 CSTB、 SMAD4)和18S RNA (孔B12)。孔C1-C12 (圖 3上的25-36)含有對于五種目標(biāo)mRNA中的四種(ADAM9在孔Cl-C3中、 CCL5在孔C4-C6中、CSTB在孔C7-C9中、SMAD4在孔C10-C12中) 使用較低的Raji細(xì)胞當(dāng)量濃度(3.3細(xì)胞/反應(yīng))的3次重復(fù)反應(yīng)?？譊l-D6 (圖3上的13-18)含有對于RUNXl (孔D1-D3)和對照RNA 18S (孔D4-D6) 使用較低的Raji細(xì)胞當(dāng)量濃度(3.3細(xì)胞/反應(yīng))的3次重復(fù)反應(yīng)。這些數(shù)據(jù) 顯示對于全部所選擇目標(biāo)，使用33細(xì)胞/反應(yīng)在TaqMan —步qRT-PCR 反應(yīng)中均檢測到mRNA。
假定33細(xì)胞/反應(yīng)相當(dāng)于約0.5 ng/反應(yīng)，則使用了 100 ng經(jīng)純化的 Raji RNA的陽性對照反應(yīng)含有約200X以上的RNA。對于200X以上的 RNA，預(yù)計循環(huán)閾值(ACt)的差異為約7.6，這約等于所觀察到的(將孔1-3 與孔19相比、孔4-6與孔20相比、孔7-9與孔21相比、孔10-12與孔 22相比、孔13-15與孔23相比)。所測定的平均ACt對于ADAM9是6.99、
52對于CCL5是6.00、對于CSTB是5.21、對于SMAD4是4.97、對于RUNX1 是3.03。
圖4顯示了對于用于檢測18S RNA的TaqMan —步qRT-PCR反應(yīng)中 的每一反應(yīng)的熒光相對增力B(ARii)對循環(huán)的關(guān)系。圖4中只檢測了VIC層， 所以使用FAM的目標(biāo)mRNA反應(yīng)是不可檢測的。除了陽性對照，每一 反應(yīng)均按3次重復(fù)進(jìn)行。該數(shù)據(jù)顯示用于檢測18S RNA的所有TaqMan 一步qRT-PCR反應(yīng)都產(chǎn)生可檢測的擴(kuò)增產(chǎn)物。大幅度的熒光相對增加表 明對于所有反應(yīng)中的18SRNA均實現(xiàn)了相對明顯的擴(kuò)增。
圖5通過在其中迸行反應(yīng)的96孔板中的孔位，顯示了對于TaqMan 一步qRT-PCR反應(yīng)中的每一種的循環(huán)閾值(Ct)的圖。圖3中只檢測了 VIC 層，所以只有18S反應(yīng)是可檢測的。這些反應(yīng)的孔位如圖3所述。這些 數(shù)據(jù)顯示在每一反應(yīng)中均可檢測18SRNA。
實施例2:使用RT和不使用RT、以及經(jīng)過蛋白酶處理和不經(jīng)過蛋 白酶處理的mRNA檢測
進(jìn)行mRNA檢測實驗來測定使用和不使用逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)反應(yīng)中的 18SRNA的含量。還進(jìn)行了經(jīng)過和不經(jīng)過蛋白酶處理的反應(yīng)。通過進(jìn)行 使用和不使用RT的反應(yīng)，能夠確定含有RNA和基因組DNA的反應(yīng)與 只含有基因組DNA的反應(yīng)之間的ACt。
在該實驗中，將Raji細(xì)胞在三種不同的裂解緩沖液中按5000細(xì)胞/pl 的終濃度裂解。第一緩沖液，即緩沖液Na，含有10%NDSB-201、 50mM Tris 8.0和1 mMEDTA;第二緩沖液，即緩沖液Nb，含有1%NDSB-201、 50 mM Tris 8.0和1 mM EDTA;第三緩沖液，即緩沖液Nc，含有0.1% NDSB-201、 50 mM Tris 8.0和1 mM EDTA。在37。C以鏈霉菌蛋白酶 (2.5U"l)對每種Raji細(xì)胞裂解物中的一半處理30分鐘，隨后在75'C熱處 理5分鐘。將樣品中的另一半在37'C溫育30分鐘，隨后在75'C熱處理 5分鐘，但不加入蛋白酶。經(jīng)蛋白酶處理的樣品變粘，而未經(jīng)處理的樣品 不變粘。
圖6顯示了 10 ^的每種裂解物的瓊脂糖凝膠電泳。該凝膠顯示經(jīng)蛋 白酶處理的樣品釋放RNA和基因組DNA，而未經(jīng)處理的樣品則不釋放RNA和基因組DNA。
隨后將三種Raji細(xì)胞裂解物(在緩沖液Na、緩沖液Nb、和緩沖液 Nc中)在50 mM Tris (pH 8.0)中稀釋，根據(jù)需要利用1 mM EDTA標(biāo)準(zhǔn)化 為0.P/。NDSB-201的濃度。結(jié)果，經(jīng)稀釋的緩沖液Na裂解物含有50細(xì) 胞/fal，經(jīng)稀釋的緩沖液Nb裂解物含有500細(xì)胞/]al，緩沖液Nc裂解物保 持為5000細(xì)胞4il。在每種25 ^的TaqMan —步qRT-PCR反應(yīng)中使用5 )il 的裂解物以檢測18S RNA。將使用和不使用RT的每種裂解物(每種細(xì)胞 濃度，經(jīng)過和未經(jīng)過蛋白酶處理)按3次重復(fù)進(jìn)行測試。使用ABIPRISM 7700系統(tǒng)分析反應(yīng)。
圖7顯示了該實驗的結(jié)果。反應(yīng)的孔位如下?？譇1-A12(圖7中的 l-12)含有采用RT的反應(yīng)，這些反應(yīng)使用經(jīng)蛋白酶處理的裂解物250細(xì) 胞/反應(yīng)(孔Al-A3)、2500細(xì)胞/反應(yīng)(孔A4-A6)、25,000細(xì)胞/反應(yīng)(孔A7-A9) 和無模板的對照("NTC" ) ( L A10-A12)?？譈1-B12 (圖7中的13-24)含 有不使用RT的反應(yīng)，這些反應(yīng)使用經(jīng)蛋白酶處理的裂解物250細(xì)胞/ 反應(yīng)(孔B1-B3)、 2500細(xì)胞/反應(yīng)(孔B4-B6)、 25,000細(xì)胞/反應(yīng)(孔B7-B9) 和無模板的對照("NTC")(孔B10-B12)。孔Cl-C9 (圖7中的25-33)含 有使用RT的反應(yīng)，這些反應(yīng)使用未經(jīng)蛋白酶處理的裂解物250細(xì)胞/ 反應(yīng)(孔Cl-C3)、2500細(xì)胞/反應(yīng)(孔C4-C6)和25,000細(xì)胞/反應(yīng)(孔C7-C9)。 孔Dl-D9 (圖7中的37-45)含有不使用RT的反應(yīng)，這些反應(yīng)使用未經(jīng)蛋 白酶處理的裂解物250細(xì)胞/反應(yīng)(孔Dl-D3)、 2500細(xì)胞/反應(yīng)(孔D4-D6) 和25,000細(xì)胞/反應(yīng)(孔D7-D9)。
這些數(shù)據(jù)顯示，在可檢測地擴(kuò)增18S RNA或基因組DNA的實驗中 對裂解物進(jìn)行蛋白酶處理是必要的。另外，TaqMan —步qRT-PCR反應(yīng) 在檢測250細(xì)胞/反應(yīng)時可很好地檢測到18S RNA或基因組DNA，但在 2500細(xì)胞/反應(yīng)和25,000細(xì)胞/反應(yīng)時不能很好地進(jìn)行檢測(將圖7的孔1-3 和13-15與孔4-9和15-21比較)。最終，使用RT的反應(yīng)(孔l-3)和不使用 RT的反應(yīng)(孔13-15)之間的ACt約為8.5。該ACt表示18S RNA的擴(kuò)增和 18S基因組DNA的擴(kuò)增之間的ACt。據(jù)估計， 一個二倍體的Raji細(xì)胞含 有約540拷貝的18S基因組序列和約l，OOO,OOO拷貝的18S RNA。因此，
5418S RNA比18S基因組DNA多2000倍，這將可以預(yù)測到會得到約11 的八Ct。所觀察到的8.5的ACt和預(yù)測的11的ACt之間的差異可能是18S RNA擴(kuò)增的較低效率導(dǎo)致的。 實施例3:去污劑測試
測試了不同的去污劑和親水性化合物在裂解Raji細(xì)胞和釋放完整核 酸方面的效率(通過瓊脂糖凝膠確定)。所測試的有以下化學(xué)品NMP (Sigma) 、 Mackernium (CJ Petrow)、 Empigen (Calbiochem)、 NDSB-201 (Calbiochem) 、 Zwittergent 3-10 (Calbiochem) 、 Zwittergent 3-14 (Calbiochem) 、 TMACL (Sigma) 、 DDMAB (Calbiochem) 、 CAPSO (Sigma)、 CHAPS (Calbiochem) 、 LDAO (Calbiochem) 、 Sarkosyl (Sigma) 、 CTAB (Calbiochem)、 DEDTAB (Fluka)、 DLS (Sigma)和DTAB (Sigma)。以 50,000 Raji細(xì)胞4U，在含有50 mM Tris(pH 8.0)、 1 mM EDTA的緩沖液 中以0.5%測試了每種化學(xué)品的裂解。
圖8顯示了裂解物中的核酸的瓊脂糖凝膠電泳的示例性結(jié)果。上方 的泳道是分別使用NMP、 Mackemium、 Empigen、 NDSB-201、 Zwittergent 3-10、 Zwittergent 3-14、 TMACL和DDMAB的裂解物。下方的泳道是分 別使用CAPSO、 CHAPS、 LDAO、 Sarkosyl、 CTAB、 DEDTAB、 DLS禾口 DTAB的裂解物。通過該實驗可以將NMP、 Empigen、 NDSB-201 、 Zwittergent 3-10、 Zwittergent 3-14、 DDMAB、 CAPSO、 CHAPS、 LDAO、 CTAB、 DEDTAB和DTAB確認(rèn)為用于本文所述方法中的可能候選物。
此外，進(jìn)行了篩選研究以在瓊脂糖凝膠上確定使用每種化學(xué)品的裂 解物在加熱后是否含有完整的核糖體RNA帶，以及這些化學(xué)品在0.1% 的濃度是否與TaqMan —步qRT-PCR反應(yīng)相容(數(shù)據(jù)未顯示)。在這些實驗 之后，選擇NDSB-201 (非去污劑磺基甜菜堿-201; 3-(l-吡啶并)-l-丙烷磺 酸鹽)、LDAO(十二烷基二甲氧化胺)、CAPSO (3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙烷磺酸)和CHAPS (3-[(3-膽胺基丙萄二甲基銨基]-l-丙垸磺酸鹽)以用 于進(jìn)一步篩選。探究近感連接測定法的抑制的實驗還表明DEDTAB (溴化 十二烷基乙基二甲基銨)和Zwittergent 3-10 (正癸基-N,N-二甲基-3-銨-l— 丙烷磺酸鹽)也是用于本文所述方法的候選物(數(shù)據(jù)未顯示)。
55在可表明抗原/抗體相互作用被保持的ELISA測定法中，測試了全部 四種化學(xué)品的相容性。在使用VEGF作為目標(biāo)的夾心ELISA測定法中， 全部四種化學(xué)品顯示了至少部分相容性(數(shù)據(jù)未顯示)。使用NDSB-201、 LDAO和CAPSO，以PBS為標(biāo)準(zhǔn)，利用100 pg/ml VEGF和R&D Systems VEGF ELISA試劑盒以及ELISA讀板儀進(jìn)行了第二 ELISA實驗。在該實 驗中，CAPSO和LDAO顯示了與BSA相當(dāng)?shù)谋尘白x數(shù)和與BSA相當(dāng)?shù)?樣品讀數(shù)。NDSB-201同樣顯示了與BSA相當(dāng)?shù)谋尘白x數(shù)，但比BSA高 的樣品讀數(shù)(數(shù)據(jù)未顯示)。
在另一項實驗中，在2% NDSB-201或5 mM CAPSO中產(chǎn)生Raji細(xì) 胞裂解物。隨后將每種裂解物按1:5和1:10稀釋，并且在于37'C溫育 30分鐘、隨后于50'C溫育5分鐘的過程中評價裂解物和裂解物稀釋液抑 制核糖核酸酶降解核糖體RNA的能力。圖9顯示了該結(jié)果。RNA在所 有的被測試樣品中均顯示保持未被降解。發(fā)現(xiàn)LDAO在溫育延長時保護(hù) RNA的效率較差(數(shù)據(jù)未顯示)。
NDSB-201是相關(guān)化學(xué)品大家族中的成員，該家族還包括 NDSB-195、 -211、 -221、 -256和-256-HT。例如見Calbiochem目錄。針 對裂解Raji細(xì)胞和保護(hù)RNA，對這些化學(xué)品中的每一種都進(jìn)行了篩選。 在這些實驗中，NDSB-201在所測試的化學(xué)品中表現(xiàn)最好(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例4:其它試劑測試
使用在緩沖液N中的Raji細(xì)胞裂解物的各種稀釋液進(jìn)行近感連接測 定法。在用于檢測VEGF的近感連接測定法中，使用由在緩沖液N中 50，000細(xì)胞/nl的Raji細(xì)胞裂解物開始，在緩沖液D中1:5、 1:10、 1:50 和1:100倍的稀釋液。該測定法按照以上實施例1中所述的方法進(jìn)行。結(jié) 果在圖10中顯示。在該實驗中，裂解物的1:50的稀釋液(在2 Jul的結(jié)合 反應(yīng)中得到1,000個細(xì)胞)顯示了最佳結(jié)果(即最低的平均循環(huán)閾值)。
進(jìn)行實驗以確定在緩沖液N中的Raji細(xì)胞裂解物中的RNA的穩(wěn)定 性。在存在或不存在1 |il抗核糖核酸酶抑制劑(Anti-RNAse inhibitor)(儲備 液是22 u/|4 Ambion;目錄號2690)的情況下在37。C將8 裂解物(50，000細(xì) 胞/Vl)溫育0、 1或4小時。溫育之后，加入含有0.5% SDS和2嗎爾1
56蛋白酶K (Ambion;目錄號2546)的32 pl溶液，并使裂解物在55。C溫育 30分鐘。隨后向每種裂解物加入40 pl的2X甘油上樣緩沖液(2XGLB; 50%甘油、0.5XTBE，含有溴酚藍(lán)和二甲苯青染料)。隨后將16pl的裂解 物上樣于1.4%瓊脂糖凝膠上。該結(jié)果在圖11中顯示。在該實驗中，在所 有被測試的條件下RNA在Raji裂解物中均穩(wěn)定。在該實驗中無需核糖核 酸酶抑制劑來保護(hù)RNA。
隨后在與上一段中所述的測定法相似的RNA穩(wěn)定性測定法中測試 了 Tween-20的效果。在這一實驗中，以50,000細(xì)胞/jil在上述的緩沖液 Na (10% NDSB-201)、緩沖液Nb (1% NDSB-201)和緩沖液Nc (0.1% NDSB-201)中制備Raji細(xì)胞裂解物。在37。C將8 pl裂解物與或不與0.2 pl 的20。/。Tween-20(在裂解物中的終濃度，0.5%)溫育4小時。溫育之后， 加入32 ^11含有0.5% SDS和2 pig4d蛋白酶K的溶液，并使裂解物在 55'C溫育30分鐘。隨后向每一裂解物加入40 的2XGLB。隨后將16 |il 的裂解物上樣于1.4%瓊脂糖凝膠上。該結(jié)果在圖12中顯示。RNA在只 含有NDSB-201的每一種樣品中均相對穩(wěn)定，然而，RNA在還含有含有 Tween-20的所有樣品中較不穩(wěn)定。因此表明Tween-20較不適合于在這一 實驗中的應(yīng)用。
隨后測試了緩沖液N抑制核糖核酸酶A活性的能力。在50mMTris (pH 8.0)、 1 mM EDTA和0.5 pg/|il BSA中制備核糖核酸酶A (Ambion;目 錄號2270)的1 mg/ml的儲備液。將10 pl (500 ng)的經(jīng)純化的Raji細(xì)胞 RNA (儲備液是50 ng/^il; Applied Biosystems TaqMan對照總RNA(人)，目 錄號4307281)與核糖核酸酶A儲備液在緩沖液N或50 mM Tris、 5 mM EDTA(pH 8.0)中的I:IOO，OOO、 1:1,000,000和I:IO,OOO，OOO倍的5 稀釋 液混合。將該反應(yīng)物在37t:溫育10分鐘。隨后加入1 ^的抗核糖核酸酶 抑制劑(儲備液是22 u/pl; Ambion)和4 |J的5 XRNA上樣緩沖液(Ambion; 目錄號8556; IOX儲備液，作為5X使用)，并將16 (il的反應(yīng)物上樣于1.4% 瓊脂糖凝膠上。該結(jié)果顯示在圖13中。在該實驗中，核糖核酸酶的活力 與含有緩沖液N的反應(yīng)和含有Tris/EDTA的反應(yīng)相同，這表明緩沖液N 不抑制核糖核酸酶A的活力。然而,基于以緩沖液N制備的裂解物中RNA的穩(wěn)定性，緩沖液N可以通過除抑制核糖核酸酶A以外的其它機(jī)制來穩(wěn) 定RNA。
圖14顯示了在各種處理條件下以緩沖液N制備的Raji細(xì)胞裂解物 中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。將在各種條件下在緩沖液N中制備10 |xl裂解物 (50,000細(xì)胞/^il)于37'C溫育4小時。在上樣到10% SDS-丙烯酰胺凝膠之 前，將裂解物在1XNovagenSDS-變性凝膠上樣緩沖液(Novagen;目錄號 70607)中于95-C處理5分鐘。在每一泳道中上樣1.5 pl裂解物。使用Pierce Gel Code Stain (Pierce Chemical;目錄號24590)將該凝膠染色過夜。在該實 驗中，在包括于37'C溫育至少4小時在內(nèi)的各種條件下Raji細(xì)胞蛋白質(zhì) 在緩沖液N中均穩(wěn)定。
實施例5:蛋白酶測試
進(jìn)行實驗以確定各種蛋白酶在如實施例1所述的近感連接測定法和 mRNA檢測測定法中的適用性。在蛋白酶的選擇中所考慮的特性包括 該蛋白酶能否被加熱失活、對于活性該蛋白酶是否需要金屬離子、該蛋 白酶是否需要諸如SDS等去污劑、該蛋白酶消化是否降解RNA和該蛋 白酶是否充分釋放RNA。
篩選了以下的蛋白酶胃蛋白酶(Sigma)、膠原酶(Sigma)、 I型蛋白 酶粗制物(來自牛胰)(Sigma)、蛋白酶(枯草桿菌)(Sigma)、 X型蛋白酶(嗜 熱溶蛋白芽孢桿菌，bacillus thermoproteolyticus， Calbiochem)、 XIII型蛋 白酶(曲霉菌，aspergillus saitoi， Sigma)、 XXI型蛋白酶(鏈霉菌，F(xiàn)luka) 和蛋白酶K (Ambion)。對于每種測試，將Raji細(xì)胞在PBS中的2 jil懸浮 液(50,000細(xì)胞爾l)與8 ^的緩沖液Na (含有10% NDSB-201)混合從而裂 解細(xì)胞。向Raji細(xì)胞裂解物加入4jil的約20mg/ml蛋白酶，并將該混合 物在37"C溫育30分鐘。30分鐘之后，檢測裂解物的粘度?？莶輻U菌蛋 白酶、鏈霉菌蛋白酶和蛋白酶K均使裂解物變得粘稠。牛胰粗制蛋白酶 也使裂解物變得稍微粘稠。其余的蛋白酶不顯著增加裂解物的粘度。
隨后將裂解物在1.4°/。的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，從而確定蛋白酶是 否釋放RNA和DNA，以及它們是否引起RNA和DNA的降解。圖15 顯示了該實驗的結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示，在該實驗中，枯草桿菌蛋白酶、鏈霉
58菌蛋白酶和蛋白酶K在釋放裂解物中的RNA和DNA方面最有效。該實 驗顯示，牛胰粗制蛋白酶釋放DNA，但不釋放RNA。該實驗顯示，膠原 酶可能導(dǎo)致DNA和/或RNA的降解。
利用在兩種不同的裂解緩沖液中裂解的Raji細(xì)胞進(jìn)行第二次蛋白酶 篩選。第一種裂解緩沖液是緩沖液Na加0.2% LDAO。第二種制劑是緩 沖液Nc。將5 fil的在PBS中的Raji細(xì)胞(50，000細(xì)胞/pl)與5 |il的2X裂 解緩沖液混合，并在室溫溫育15分鐘。向Raji細(xì)胞裂解物加入4 pl的約 20 mg/ml蛋白酶，并將該混合物在37"C溫育30分鐘。隨后加入5 pl的 50mMEDTA，.并將裂解物在75。C溫育5分鐘。加入5pl的GLB，并將 樣品在1.4%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。該實驗中測試了以下的蛋白酶 胃蛋白酶、膠原酶、蛋白酶(枯草桿菌)、X型蛋白酶(嗜熱溶蛋白芽孢桿 菌)、xin型蛋白斷曲霉菌)、XXI型蛋白斷鏈霉菌)和蛋白酶K。
該實驗的結(jié)果在圖16和圖17中顯示。圖16顯示了利用含有0.2% LDAO的緩沖液Na的結(jié)果，而圖17顯示了利用緩沖液Nc的結(jié)果。在該 實驗中，向含有NDSB-201的緩沖液加入LDAO并不在蛋白酶消化的過 程中增強(qiáng)RNA的穩(wěn)定性(見圖16)。
雖然已經(jīng)通過參考各種應(yīng)用、方法和組成描述了本文所公開的教導(dǎo)， 但應(yīng)該認(rèn)識到，可以不背離本文的教導(dǎo)情況下做出各種變化和改進(jìn)。上 述實施例是用以更好地闡明本發(fā)明的教導(dǎo)，而不是意圖限制本發(fā)明的教 導(dǎo)的范圍。根據(jù)所附權(quán)利要求書可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的教導(dǎo)的某些方 面。
權(quán)利要求
1.一種檢測細(xì)胞中的至少一種目標(biāo)分析物和至少一種目標(biāo)核酸的方法，所述方法包括a)在多功能性裂解緩沖液中裂解所述細(xì)胞從而產(chǎn)生細(xì)胞裂解物；b)使用近感檢測測定法檢測所述細(xì)胞裂解物中的至少一種目標(biāo)分析物；和c)使用核酸定量檢測測定法檢測所述細(xì)胞裂解物中的至少一種目標(biāo)核酸；其中(b)和(c)在同一容器中進(jìn)行。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法,其中至少一種目標(biāo)分析物選自蛋白質(zhì)、 肽、碳水化合物和激素。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中至少一種目標(biāo)分析物是蛋白質(zhì)。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述近感檢測測定法包括a) 將所述細(xì)胞裂解物與第一近感檢測探針和第二近感檢測探針在使 得所述第一近感檢測探針和所述第二近感檢測探針之間能夠相互作用的 條件下溫育；和b) 檢測所述第一近感檢測探針和所述第二近感檢測探針之間的所述 相互作用。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述第一近感檢測探針包含第一 寡核苷酸部分和第一分析物結(jié)合部分，并且其中所述第二近感檢測探針 包含第二寡核苷酸部分和第二分析物結(jié)合部分。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第一分析物結(jié)合部分和所述 第二分析物結(jié)合部分能夠結(jié)合相同的目標(biāo)分析物。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第一分析物結(jié)合部分和所述 第二分析物結(jié)合部分能夠結(jié)合不同的目標(biāo)分析物。
8. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第一近感檢測探針和所述第 二近感檢測探針之間的所述相互作用包括選自所述第一寡核苷酸部分和 所述第二寡核苷酸部分之間的雜交和所述第一寡核苷酸部分和所述第二寡核苷酸部分的連接中的至少一種方法。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述第一近感檢測探針和所述第 二近感檢測探針之間的所述相互作用包括所述第一寡核苷酸部分和所述 第二寡核苷酸部分的連接。
10. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述溫育包括至少一種夾板寡 核苷酸。
11. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種目標(biāo)核酸是至少一 禾中mRNA。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述核酸定量檢測測定法包括 逆轉(zhuǎn)錄和實時PCR。
13. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種目標(biāo)核酸中的至 少一種目標(biāo)核酸編碼所述至少一種目標(biāo)分析物中的至少一種目標(biāo)分析 物。
14. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多功能性裂解緩沖液包含 選自NDSB-201、 LDAO、 CHAPS、 DEDTAB、 Zwittergent 3-10和CAPSO 中的至少一種化學(xué)品。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述多功能性裂解緩沖液包含 NDSB-201。
16. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測至少一種目標(biāo)分析物 包括第一實時PCR反應(yīng)，并且所述檢測至少一種目標(biāo)核酸包括第二實時 PCR反應(yīng)。
17. —種檢測細(xì)胞中的至少一種目標(biāo)分析物和至少一種目標(biāo)核酸的 方法，所述方法包括a) 在多功能性裂解緩沖液中裂解所述細(xì)胞從而產(chǎn)生細(xì)胞裂解物；b) 將所述細(xì)胞裂解物與下述物質(zhì)溫育(i)至少一個近感檢測探針組，其中每個近感檢測探針組包括至少兩 種近感檢測探針，并且其中每種近感檢測探針包含至少一種分析物結(jié)合部分和至少一種寡核苷酸部分；Cii)至少一種夾板寡核苷酸；和(iii)至少一種連接酶；由此形成至少一種經(jīng)連接的近感檢測探針組； C)將所述細(xì)胞裂解物與至少一種蛋白酶溫育；d) 檢測所述至少一種經(jīng)連接的近感檢測探針組；和e) 檢測至少一種目標(biāo)核酸。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中至少一種目標(biāo)分析物是蛋白質(zhì)。
19. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中(d)和(e)在同一容器中進(jìn)行。
20. —種檢測細(xì)胞中的至少一種目標(biāo)分析物和至少一種目標(biāo)核酸的 方法，所述方法包括a) 在多功能性裂解緩沖液中裂解所述細(xì)胞從而產(chǎn)生細(xì)胞裂解物；b) 將所述細(xì)胞裂解物與至少一個近感檢測探針組溫育，從而形成至 少一個經(jīng)雜交的近感檢測探針組，其中每個近感檢測探針組包括至少兩 種近感檢測探針，并且其中每種近感檢測探針包含至少一種分析物結(jié)合 部分和至少一種寡核苷酸部分；c) 將所述細(xì)胞裂解物與至少一種蛋白酶溫育；d) 檢測所述至少一個經(jīng)雜交的近感檢測探針組；和e) 檢測至少一種目標(biāo)核酸。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中至少一種目標(biāo)分析物是蛋白質(zhì)。
22. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中(d)和(e)在同一容器中進(jìn)行。
23. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中(b)中的所述溫育包含至少一種 夾板寡核苷酸。
24. —種多功能性裂解緩沖液，所述多功能性裂解緩沖液包含選自 NDSB-201、 LDAO、 CHAPS、 DEDTAB、 Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一種化學(xué)品。
25. 如權(quán)利要求24所述的多功能性裂解緩沖液，所述多功能性裂解 緩沖液包含NDSB-201。
26. 如權(quán)利要求24所述的多功能性裂解緩沖液，其中至少一種化學(xué) 品以0.05% 5%的濃度存在。
27. —種用于檢測至少一種目標(biāo)分析物和至少一種目標(biāo)核酸的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種多功能性裂解緩沖液，所述多功能性裂解緩沖液含有選自NDSB-201、 LDAO、 CHAPS、 DEDTAB、 Zwittergent 3-10 和CAPSO中的至少一種化學(xué)品。
28. 如權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一種連 接酶。
29. 如權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一個近 感檢測探針組。
30. 如權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一種蛋 白酶。
31. 如權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一種引 物、至少一種檢測探針和至少一種聚合酶。
32. —種含有裂解液的組合物，其中所述裂解液包含多功能性裂解緩沖液和至少一個近感檢測探針組，所述多功能性裂解緩沖液含有選自 NDSB-201、 LDAO、 CHAPS、 DEDTAB、 Zwittergent 3-10和CAPSO中的至少一種化學(xué)品。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測樣品中的至少一種分析物和至少一種核酸的方法。本發(fā)明還提供了用于實施所述方法的試劑。
文檔編號C12Q1/68GK101558167SQ200780036198
公開日2009年10月14日 申請日期2007年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月1日
發(fā)明者大衛(wèi)·W·拉夫, 馬克·E·香農(nóng) 申請人:應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司