專利名稱：蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用甲醇同化細菌分泌生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，所述蛋白質(zhì)包 括工業(yè)上有用的酶或生物活性蛋白。
背景技術(shù)：
曱醇是能夠以低成本大量獲得的發(fā)酵原料，并且其作為碳源是非常有
用的。已經(jīng)開發(fā)出使用曱醇'為主要碳源，用甲醇同化細菌生產(chǎn)L-氨基酸的 方法(專利文獻l)和使用曱醇同化細菌生產(chǎn)多糖的方法(專利文獻2)。
同樣，到目前為止已知在畢赤酵母屬酵母(戶/c/z/ayeast)中使用醇氧化酶 (AOX)基因的啟動子通過甲醇誘導在菌體內(nèi)生產(chǎn)IacZ的例子(非專利文獻1) 和使抑肽酶(牛源、胰腺胰蛋白酶抑制劑)以活性型分泌到培養(yǎng)物上清液中的
此外，在甲醇同化細菌中，已知有在非專性甲醇同化細菌扭脫曱基桿 菌(Mef/zy/okzc&n'wm exfo^ww)的細胞內(nèi)蓄積熒光蛋白(GFP)的例子(專利文 獻3、非專利文獻3),但尚未得知在專性曱醇同化細菌中向菌體外分泌蛋白 的例子。
專利文獻1:歐洲專利公開第1188822號說明書 專利文獻2:特開平11-56384號公報 專利文獻3: WO2003/046226 Al
非專利文獻1: Nucleic Acids Res. 1987 May 11;15(9):3859-76. 非專利文獻2: J Ind Microbiol. 1991 Apr;7(3):197-201. 非專利文獻3: FEMS Microbiol Lett 2000 Dec 15; 193(2): 195-200

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題是提供有效分泌生產(chǎn)目前難于用埃希氏菌屬(&c/犯nc/7/a) 本發(fā)明人等注意到源自甲醇同化細菌的啟動子、信號序列，并進行了深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過將攜帶DNA構(gòu)建體的曱醇同化細菌培養(yǎng)在以甲 醇為主要碳源的培養(yǎng)基中，所述DNA構(gòu)建體包含可在曱醇同化細菌中發(fā)揮 作用的啟動子序列以及編碼信號序列和目的蛋白的核酸序列，能夠有效地 分泌生產(chǎn)蛋白質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。 即本發(fā)明如下。
(1) 蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，該方法包括通過在以曱醇為主要碳源的液體培 養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶DNA構(gòu)建體的曱醇同化細菌，使該細菌分泌目的蛋白，其 中所述DNA構(gòu)建體包含在曱醇同化細菌中發(fā)揮功能的啟動子序列和以可表 達的形式連接于該啟動子序列的、編碼包含信號序列和所述目的蛋白序列 的多肽的核酸序列；和回收分泌的目的蛋白。
(2) 根據(jù)(1)的方法，其中所述在曱醇同化細菌中發(fā)揮功能的啟動子序列 選自曱醇脫氫酶啟動子、tac啟動子、cjE啟動子和核糖體蛋白啟動子。
(3) 根據(jù)(1)的方法，其中所述啟動子序列為具有序列號11、 12、 21或 22的》咸基序列的啟動子。
(勺根據(jù)(1卜(3)任一項的方法，其中所述信號序列為選自甲醇脫氬酶、 肌醇六磷酸酶和酸性磷酸酶的蛋白質(zhì)的信號序列。
(5) 根據(jù)(1卜(3)任一項的方法，其中所述信號序列具有選自序列號18和 20的氨基酸序列。
(6) 根據(jù)(1 ) (5)任一 項的方法，其中所述曱醇同化細菌為選自下組的細 菌嗜曱基菌屬(AfeAj;/op/n7MS)細菌、曱基菌屬(A/W/^/oZ^cz7/w力細菌、噬曱 基菌屬0W"/^/o/ /zaga)纟田菌、無色桿菌屬(Jc/7rawo6acfe。纟田菌、，l單月包菌屬 (尸seMfifowo"aw)細菌、精朊桿菌屬(尸ratom/w6acfe。細菌、曱坑單胞菌屬 (M""/^〃omowa力纟田菌、農(nóng)i環(huán)菌屬(A^'crac少c/w力纟田菌和甲基4干菌屬 (臉 /0ZwCe〃-纖)纟田菌。
(7) 才艮據(jù)(1) (6)任一項的方法，其中所述蛋白為選自肌醇六磷酸酶、白 細胞介素、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、千擾素、胰島素、酸性磷酸酶和肽合成酶(peptide synthase)的蛋白。
(8) 根據(jù)(1) (7)任一項的方法，其中所述甲醇同化細菌為專性甲醇同化
纟田菌。
(9)根據(jù)(8)的方法，其中所述專性甲醇同化細菌為選自下組的細菌嗜 曱基菌屬CM"/z_y/opfe7"》細菌、曱基菌屬(A/"/^/o^"'〃m力細菌和噬曱基菌屬
(她~/。/7/^")纟田菌。 發(fā)明的優(yōu)選實施方式
本發(fā)明的生產(chǎn)方法的特征在于通過在以曱醇為碳源的液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)攜帶DNA構(gòu)建體的曱醇同化細菌，使該細菌分泌目的蛋白，其中所述 DNA構(gòu)建體包含在曱醇同化細菌中發(fā)揮功能的啟動子序列以及以可表達的 形式連接于該啟動子序列的、編碼包括信號序列和目的蛋白序列的多肽的 核酸序列；和回收分泌的目的蛋白。在本文中術(shù)語"分泌'，指將目的蛋白 由細胞內(nèi)排出(excretion)或釋放(release)到菌體外，不包括目的蛋白在細胞內(nèi) 的蓄積。
即通過該甲醇同化細菌，首先產(chǎn)生包含信號序列和目的蛋白的多肽， 然后通過切斷信號序列將目的蛋白轉(zhuǎn)移至周質(zhì)，其后目的蛋白被分泌至菌 體外?；厥者@些分泌的蛋白即可進行目的蛋白的生產(chǎn)。以下，將使細菌分 泌蛋白、并回收該蛋白的生產(chǎn)過程成為"蛋白的分泌生產(chǎn)"。
已知通常將分泌性蛋白翻譯成前肽(prepeptide)或前肽原 (prepr叩eptide)，之后它們成為成熟蛋白。即，眾所周知在將分泌性蛋白翻 譯為前肽或前肽原后，通過切割前體部分(pre-portion)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒祀幕螂脑?(propeptide),肽原在蛋白酶的作用下其原體部分(pro-portion)進一步被切割， 從而成為成熟蛋白。擔負著這樣的信號肽切割任務的蛋白酶通常被稱為"信 號肽酶"。
在本發(fā)明中，目的蛋白可以是以成熟蛋白或肽原的形式分泌的蛋白， 當其以肽原的形式分泌時，在回收后用適當?shù)牡鞍酌高M行處理，可以獲得 成熟蛋白。
在本說明書中，術(shù)語"信號序列"是指存在于分泌性蛋白前體的N-末 端的、在蛋白分泌時被識別的序列；而術(shù)語"信號肽"是指由這些氨基酸 殘基構(gòu)成的肽。
在本發(fā)明中，同時具有前體序歹'j(pre-sequence)和原體部分(pro-portion) 的蛋白，即初級翻譯產(chǎn)物(primary translation product),可以稱為"前蛋白質(zhì) 原(preproprotein)"; 而具有原體部分4旦;殳有前體部分的蛋白可以稱為"蛋白
質(zhì)原(proprotein)"。蛋白質(zhì)原的原體部分可以稱為"原體結(jié)構(gòu)部分 (pro-structural portion)"或簡稱"原體結(jié)構(gòu)(pro-structure)";而在本i兌明書中， 蛋白質(zhì)的"原體結(jié)構(gòu)部分/原體結(jié)構(gòu)"和蛋白質(zhì)的"原體部分"可以互換使 用。
本發(fā)明的生產(chǎn)方法中使用的細菌可以通過將DNA構(gòu)建體導入甲醇同化 細菌而獲得，其中所述DNA構(gòu)建體包含在曱醇同化細菌中發(fā)揮功能的啟動 子序列和以可表達的形式連接于該啟動子序列的、編碼包括信號序列和目 的蛋白序列的多肽的核酸序列。
這里，術(shù)語"甲醇同化細菌"指能夠以甲醇為主要碳源進行生長的細
菌，包括屬于嗜曱基菌屬(似^/^/0/ /7//^)、甲基菌屬(M"/z少/W""7/w力、噬曱 基菌屬、 無色卄干菌屬(爿c/ ramo6(3Cfer)、，支單刀包菌屬 CP化z^omo"a力(特開昭45-25273號公報)、精朊桿菌屬OPrato腦'"o/^"er)(特 公昭49-125590號公報)、曱烷單胞菌屬(《ef/7awomo7^M)(特開昭50-25790 號公報)、微環(huán)菌屬(M/craqyc/w力(特開昭52-18886號公報)和曱基桿菌屬 (Me^y/o6acfen'wm)等的細菌。其中，優(yōu)選專性甲醇同化細菌，其在以葡萄 糖為唯一碳源的條件下不能生長或僅微弱生長。具體地，可以以曱醇為主 要碳源進行生長而在以葡萄糖為唯一碳源的條件下不能生長或僅微弱生長 的細菌例如有嗜曱基菌屬細菌、甲基菌屬細菌和噬曱基菌屬細菌。其中包 括嗜甲基菌屬細菌例如食曱基嗜甲基菌(Mef/^/o; /u7Ms me^y/ofrop/zws);甲 基菌屬細菌例如糖原曱基菌(Me / 少/oZ)ac/〃z^ g/少coge"e力、鞭毛曱基菌 (M^/^/o6acz'〃w /Zage〃Ww); 嗟曱基菌屬細菌例如深海噬曱基菌 (A/e/Ay/op/Mga //za/(2M/c")、海p藍甲基菌(7We^y/op/wga wan'"fl)、嗜i咸謹曱基 菌(Me /op/zaga a/ca/一//(3) (Biology of Methylotrophs; Edited by Israel Goldberg and J. Stefan Roken and published by Butterworth-Heinemann)。 jt匕夕卜, 還優(yōu)選具有向菌體外分泌甲醇脫氫酶(MDH)機能的細菌。
食曱基嗜曱基菌例如有AS1菌抹(NCIMB 10515)、W3A1 (NCIMB 11348 菌林)、ATCC 53528菌抹等。食甲基嗜曱基菌AS1菌株(NCIMB 10515)和 W3A1 (NCIMB 1l348菌抹)可以從國立工業(yè)、食品和海洋細菌保藏中心(地 址NCIMB Lts., Tony Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom)獲得。 糖原曱基菌例如有T-ll菌抹(NCIMB 11375)、 ATCC 21276菌抹、ATCC 21371菌抹、ATCC 29475菌林、ATR80菌抹(見Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994)， vol. 42, p67-72)和A513菌抹(見Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994), vol. 42， p67-72)。糖原曱基菌NCIMB 11375菌抹可以從國立工業(yè)、食品和海 洋細菌保藏中心(地址NCIMB Lts., Tony Research Station 135， Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom)獲得。
鞭毛曱基菌例如有ATCC 51484菌抹、KT菌抹(見N. I. Govorukhina等， Microbiology (Russia) 56 (1987), pp. 849-854)、 VKM B-1610菌株等。鞭毛曱 基菌VKM B-1610菌抹可以從全俄羅斯微生物保藏中心(ALL-RUSSIAN COLLECTION OF MICROORGANISMS) (Russia, 142290, Moscow Region, Pushchino, pr. Nauld, 5, IBPM)獲得。
食曱基嗜甲基菌ATCC 53528菌抹，糖原曱基菌ATCC 21276菌抹、 ATCC 21371菌抹、ATCC 29475菌株和鞭毛曱基菌ATCC 51484菌抹可以從 美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC,地址P. O. Box 1549, Manassas, VA20108, 1, United States of America)獲得。
深海噬曱基菌例如有ATCC 33145菌抹、ATCC 33146菌抹等。海噬曱 基菌例如有ATCC 35842株等。嗜石咸噬曱基菌例如有ATCCBAA-297TM等。 深海噬曱基菌ATCC 33145菌抹、ATCC 33146菌株可以從美國典型培養(yǎng)物 保藏中心(ATCC，地址P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America)獲得。
上述導入曱醇同化細菌的DNA構(gòu)建體所包含的"在曱醇同化細菌中發(fā) 揮功能的啟動子"是指在上述曱醇同化細菌中具有啟動子活性的啟動子， 但不限于源自曱醇同化細菌的啟動子，也可以是源自其它微生物的啟動子。 此外，"在曱醇同化細菌中發(fā)揮功能的啟動子"既包括曱醇誘導型啟動子， 也包括非誘導型啟動子。曱醇誘導型啟動子例如有曱醇脫氫酶基因的啟動 子、二羥基丙酮合酶基因的啟動子和甲酸脫氫酶基因的啟動子等。
在曱醇同化細菌中發(fā)揮功能的啟動子具體包括但不限于可曱醇誘導的 曱醇脫氫酶基因的啟動子(序列號11)、源自大腸桿菌的高表達啟動子tac啟 動子(序列號12)、 ciE啟動子(序列號21)和核糖體蛋白啟動子(序列號22)。
此外，啟動子序列不限于野生型啟動子，并且可以是修飾野生型的序 列以高表達目的基因而獲得的啟動子。例如，可以是在上述野生型啟動子
序列中發(fā)生幾個堿基的取代、缺失、添加或插入的序列，只要其在上述細
菌中具有啟動子活性。此外，為了增加啟動子活性，可以在-35區(qū)或-10區(qū) 對啟動子進4亍修飾，也可以調(diào)節(jié)-35區(qū)和-10區(qū)之間的間隔區(qū)(spacer region) 的長度來對啟動子進行修飾。這種修飾-35區(qū)和-10區(qū)的方法例如有EP 1,033,407中記載的方法和Nucleic Acids Res. 1999 Dec 15; 27(24): 4768-74中
記載的方法等。
啟動子的活性可以由RNA合成起始的頻率進行定義。Goldstein等的論 文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.， 1995, 1,
105-128)等中記載了啟動子活性的評價方法和能夠用于本發(fā)明的強啟動子 的實例。此外，如WO 00/18935中所公開，在目的基因的啟動子區(qū)引入幾 個堿基的堿基取代，可以將其修飾為更強的啟動子。
在導入曱醇同化細菌的DNA構(gòu)建體中，在上述啟動子的下游以可表達 的形式連接有編碼包含信號序列和目的蛋白的多肽的核酸序列。
"在曱醇同化細菌中發(fā)揮功能的信號序列"是指下述序列當其連接 于目的蛋白時，所述曱醇同化細菌能夠識別該信號序列并分泌目的蛋白。
信號序列可以是來自與目的蛋白不同的蛋白的信號序列，也可以是目 的蛋白的前體蛋白所包含的信號序列。然而，信號序列優(yōu)選來自于所使用 的宿主甲醇同化細菌的分泌性蛋白。此外，用于本發(fā)明的目的的信號序列 可以包含一部分目的蛋白的N末端側(cè)的氨基酸序列，所述目的蛋白在該信 號序列的起源前體蛋白中與該信號序列相連。
當信號序列與目的蛋白的起源不同時，可以將前蛋白原稱為"異源融 合前蛋白原(heterologous fusion preproprotein)"。 例j口, 當?shù)鞍诪樵乱膷u素時, 與"前胰島素原(preproinsulin)"或"胰島素原(proinsulin)"相對應，可以稱 為"異源、禹蟲合前月爽島素y^、(heterologous fusion preproinsulin)"。
對于信號肽，只要其可以在曱醇同化細菌中發(fā)揮功能，沒有特別的限 制，可以使用源自曱醇同化細菌分泌蛋白的信號序列，也可以使用源自其 它細菌、酵母、植物或動物等分泌蛋白的信號序列。比較具體地，例如源 自食曱基嗜甲基菌的甲醇脫氫酶(MDH)的信號序列(序列號18的氨基酸序 列)。此外，源自其它細菌的信號序列例如有由大腸桿菌的appA基因編碼 的肌醇六磷酸酶的信號序列(序列號20的氨基酸序列)、摩氏摩根氏菌(71^/^朋￡//^附0^朋")的酸性磷酸酶的信號序歹|](序列號26的位置1 20)等。 編碼這些氨基酸序列的堿基序列分別示于序列號17、 19和25。
編碼信號序列的堿基序列可以是編碼野生型信號序列的堿基序列，也 可以是發(fā)生了取代的編碼野生型信號序列的堿基序列，所述取代使其密碼 子適合在分泌生產(chǎn)蛋白的曱醇同化細菌中使用。
對于可根據(jù)本發(fā)明的方法進行分泌、回收的"目的蛋白，，沒有特別限 制，只要其通過與在上述曱醇同化細菌中發(fā)揮功能的信號序列連接從而可 以用甲醇同化細菌進行分泌，所述"目的蛋白"包括各種蛋白，例如源自 動植物、微生物的分泌性蛋白和胞內(nèi)蛋白。本發(fā)明的方法同樣適用于目前 為止無法用埃希氏菌屬(Esc/zen'c/z/a)細菌等革蘭氏陰性細菌進行分泌生產(chǎn)的 蛋白。此外，"目的蛋白"優(yōu)選與宿主曱醇同化細菌起源不同的異源蛋白。
當使用分泌蛋白作為"目的蛋白"時，可以使用具有已將前體序列和 原體序列從前體中除去的序列的蛋白，也可以使用包含原體序列的蛋白。 然而，"目的蛋白"是由前體蛋白通過切斷肽鍵而除去了構(gòu)成前體部分和原 體部分的至少一個氨基酸的蛋白即可，包括N末端區(qū)與天然成熟蛋白的N 末端區(qū)完全一致的蛋白、與天然成熟蛋白相比在N末端殘留有來自前體部 分或原體部分的至少一個氨基酸的蛋白以及氨基酸序列短于天然成熟蛋白 的蛋白。
對于適用本發(fā)明的生產(chǎn)方法的目的蛋白沒有特別的限制，例如有下列 蛋白的成熟蛋白或蛋白原。 肌醇六磷酸酶(phytase) (EC3丄3.2 3.1.3.26)
人白細胞介素2 (IL2: Genbank登錄號(Accession No.) AAK26665等，成熟型
為21~153位的氨基酸序列)
蛋白谷氨酰胺酶(protein glutaminase)
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Genbank Accession No. AF531437等)
干擾素
胰島素(特開平O7-284394等)
酸性磷酸酶
肽合成酶(WO 2004/011653 、 WO 2004/065610) 粒細胞刺激因子(GCSF)
這其中優(yōu)選的是在后述的實施例中生產(chǎn)的肌醇六磷酸酶和酸性磷酸酶。
月幾醇六石舞酸酶(又稱磷酸酐磷酸化酶(phosphoanhydride phosphorylase)) 是水解肌醇六磷酸4丐鎂(phytin)(又稱肌醇六磷酸(inositol hexakisphosphate)、 肌醇六磷酸(phytic acid))的酶，其在食品領(lǐng)域、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域和醫(yī)藥領(lǐng)域十分有 價值?？梢岳靡韵碌募〈剂姿崦?。關(guān)于各種肌醇六磷酸酶的氨基酸序 列及編碼它們的堿基序列的信息，可以參照其Genbank Accession No.獲取。 源自大腸桿菌的肌醇六磷酸酶Genbank Accession No. AAC74065 (序列號 16)成熟蛋白為23 432位的氨基酸序列
源自霉菌的肌醇六磷酸酶GenbankAccessionNo. AAU93518、 AAU93517、 AAG40885、 BAB40715
源自芽孢桿菌屬(5flc"/w力的月幾醇六磷酸酶Genbank Accession No. AAC38573、 AAG17卯3、 AAL59320
源自酵母菌的肌醇六石粦酸酶Genbank Accession No. CAB70441
源自耶爾森氏菌屬(腸油)的肌醇六磷酸酶:Genbank Accession No.
YP—070934
源自克雷伯氏菌屬(尺/eZwW/a)的肌醇六磷酸酶Genbank Accession No. AAM23271
源自黃單月包菌屬(A^"^o"w"as)的月幾醇六石奔酸酶Genbank Accession No. AAM38967
源自假單胞菌屬的肌醇六磷酸酶Genbank Accession No. AAN77879 源自蘑菇的肌醇六磷酸酶Genbank Accession No. CAC48195、 CAC48164、 CAC48234
源自玉米的月幾醇六磷酸酶Genbank Accession No. AAB52233
Genbank Accession No. AAK49438 Genbank Accession No. AAF60315 Genbank Accession No. AAA42305 酸性磷酸酶是催化酸性條件下磷酸酯水解的酶(EC3.1.3.2),可以使用例 如以下源自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶、WO 96/37603中記載的酸性磷酸酶
源自大豆的肌醇六磷酸酶 源自甘薯的肌醇六磷酸酶 源自大鼠的肌醇六磷酸酶
源自摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶Genbank Accession No. AB035805
25)，成熟蛋白為21 259位的氨基酸序列
根據(jù)所使用的宿主和/或為了獲得所需的活性，可以對編碼這些蛋白的 基因進行修飾，這其中包括使其編碼的氨基酸序列發(fā)生至少一個氨基酸的 添加、缺失或取代等的修飾。包括修飾技術(shù)、基因克隆技術(shù)、產(chǎn)生的蛋白 的檢測技術(shù)在內(nèi)的 一般分子生物學方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以 參考例^口 Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N Clover ed. 1985); FM. Ausubel et al. (eds)， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification, H. Erlich， ed., Stockton Press等。當生產(chǎn)異源蛋白時， 可以使用經(jīng)如下修飾的基因?qū)⒒蛑械拿艽a子替換為在進行分泌表達的 微生物中使用頻率高的密碼子。
使用基于已知序列設計的引物進行PCR等，可以獲得編碼蛋白的基因。 此外，還可以采用基于同源性等從微生物、動植物等的染色體中通過雜交 等方法分離編碼目的蛋白的基因，并且測定其堿基序列的基因等。此外， 還可以使用根據(jù)已知堿基序列化學合成的基因。序列信息可以從Genbank 等數(shù)據(jù)庫獲得。
此外，目的蛋白可以是在一個或多個位置上具有一個或幾個氨基酸的 取代、缺失、插入或添加的蛋白，只要其具有目的蛋白的活性。在本發(fā)明 中，因氨基酸殘基在蛋白的立體結(jié)構(gòu)中的位置或其類型而異，"一個或幾 個"具體為1至30個，優(yōu)選1至20個，更優(yōu)選1至10個。
上述的蛋白質(zhì)的取代是保持蛋白質(zhì)活性的保守取代。取代是指去除氨 基酸序列中的至少1個殘基，并且在該位置上插入其它殘基的改變。取代 酶蛋白的原有氨基酸并被認為是保守取代的氨基酸的例子包括用Ser或 Thr取代Ala;用Gln、 His或Lys取代Arg;用Glu、 Gln、 Lys、 His或Asp 取代Asn;用Asn、 Glu或Gin取代Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、 Glu、 Lys、 His、 Asp或Arg取代Gin;用Gly、 Asn、 Gln、 Lys或Asp耳又代 Glu;用Pro取代Gly;用Asn、 Lys、 Gln、 Arg或Tyr取代His;用Leu、 Met、 Val或Phe取代lie;用Ile、 Met、 Val或Phe取代Leu;用Asn、 Glu、 Gln、 His或Arg取代Lys;用Ile、 Leu、 Val或Phe.耳又代Met;用Trp、 Tyr、
Met、 lie或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser;用Ser或Ala取代Thr; 用Phe或Tyr取代Tip;用His、 Phe或Trp取代Tyr;和Met、 lie或Leu取 代Val。
編碼與上述蛋白基本上相同的蛋白的DNA可以通過對編碼這些酶的 堿基序列進行修飾而獲得，例如采用位點特異突變方法將特定位置的氨基 酸殘基取代、缺失、插入、添加或倒置(inverted)。此外，上述修飾的DNA 也可以通過常規(guī)公知的突變處理獲得。突變處理包括例如在體外用羥胺 等處理未突變的DNA的方法；通過紫外線照射或使用常規(guī)突變處理用誘變 劑來處理包含未突變的DNA的微生物例如埃希氏菌屬細菌的方法，所述常 規(guī)誘變處理用誘變劑如N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、亞硝酸等；將 PCR反應溶液中的脫氧核苷酸的組成比例例如由通常的相等比例改變?yōu)椴?等比例從而人為地引發(fā)隨機錯誤的方法，即易錯PCR法等。
在適當?shù)募毎斜磉_具有這種突變的DNA并且考察表達產(chǎn)物的活性， 可以獲得編碼基本上相同的蛋白的DNA。
同樣，從編碼突變蛋白的DNA或包含該DNA的細胞中可以獲得下述 DNA，所述DNA在嚴緊條件下與例如野生型基因堿基序列的互補序列或具 有該序列的一部分的探針雜交，并且所述DNA編碼具有目的蛋白的活性的 蛋白。在本文中術(shù)語"嚴緊條件"是指形成所謂的特異性雜交但不形成非 特異性雜交的條件。將該條件明確地數(shù)值化是困難的，可以示例性地舉出 下列條件同源性高的DNA之間例如具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)
上述值低的DNA之間不發(fā)生雜交的條件；或者在與常規(guī)Southern雜交的洗 滌條件即60°C 、 lx SSC、 0.1% SDS(優(yōu)選0.1 x SSC、 0.1% SDS)相當?shù)柠}濃
度下雜交的條件。
如上所述的目的蛋白可以直接與信號序列相連，也可以通過接頭序列 間接與信號序列相連。當包含接頭序列時，這樣的接頭序列可以使用任意
序列，只要其不抑制多肽的生產(chǎn)性能和目的蛋白的活性，例如，可以使用 多聚組氨酸等用于純化目的蛋白的序列等。
通過使用限制酶等連接編碼信號序列的核酸序列和編碼目的蛋白的核 酸序列等方法，可以適宜地制備編碼包含信號序列和目的蛋白的多肽的核
酸序列。
此外，當使用的信號序列和目的蛋白源自相同的前體蛋白時，可以采
用PCR等擴增編碼包含信號序列和目的蛋白的前體蛋白的序列以備使用。 作為PCR方法，可以使用各種公知的改進方法，這其中采用交換PCR法 (crossover PCR)有利于擴增。
通過將編碼含信號序列和目的蛋白的多肽的核酸序列以可表達的形式 連接于啟動子，可以制備導入甲醇同化細菌的DNA構(gòu)建體。"將編碼含信 號序列和目的蛋白的多肽的核酸序列以可表達的形式連接于啟動子"是指 將該構(gòu)建體導入細菌時，編碼多肽的mRNA由啟動子轉(zhuǎn)錄，從而使得該細 菌產(chǎn)生該多肽。
所述核酸序列優(yōu)選以下述形式連接于啟動子在多肽編碼序列的起始 密碼子之前連接，從而使其含有包括轉(zhuǎn)錄起始位點在內(nèi)的5'-非翻譯區(qū)。5，-非翻譯區(qū)可以使用啟動子的來源序列的5，-非翻譯區(qū)，例如使用MDH基因 啟動子時可以使用MDH基因的5，-非翻譯區(qū)。此外，5'-非翻譯區(qū)可以使用 信號序列編碼序列的來源基因的5，-非翻譯區(qū)，例如使用肌醇六磷酸酶的信 號序列時可以使用肌醇六磷酸酶基因的5，-非翻譯區(qū)。
此外，在使用5，-非翻譯區(qū)時，可以使用經(jīng)如下修飾的5，-非翻譯區(qū)對 核糖體結(jié)合位點CRBS;)與起始密碼子之間的間隔區(qū)、特別是起始密碼子鄰近 上游的序列中的數(shù)個核苷酸進行取代，因為已知上述修飾對mRNA翻譯效 率的影響顯著。
此外，為獲得如上所述的DNA構(gòu)建體而進行的操作可以使用易于基因 重組的埃希氏菌等革蘭氏陰性細菌，也可以直接使用分泌蛋白的微生物進 行。
為了對曱醇同化細菌進行修飾以使其包含上述DNA構(gòu)建體，例如可以 導入攜帶上述DNA構(gòu)建體的載體。例如，可以將編碼所述蛋白的基因片段 與在甲醇同化細菌中發(fā)揮功能的載體優(yōu)選多拷貝型載體相連，制備重組 DNA,然后導入該重組DNA來轉(zhuǎn)化曱醇同化細菌宿主。
目的啟動子、信號序列和蛋白序列，可以例如采用以含有目標序列的 動物、植物、微生物的染色體DNA為模板的PCR方法(參見PCR:聚合酶 鏈式反應；White，T丄et al., Trends Genet" 5, 185(1989))獲得。染色體DNA, 可以例如根據(jù)Saito和Miura的方法(參見H. Saito and K,Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963);生物工學實驗書、日本生物工學會編、97 ~
98頁、培風館、1992年)等，從作為DNA供體的細菌制備。用于PCR的引 物，可以基于在Genbank等公共數(shù)據(jù)庫登錄的基因序列進行制備，或者可 以基于其它的細菌等中序列在已知的基因間保守的區(qū)域的信息進行制備。
能夠在曱醇同化細菌中自主復制的載體例如可在嗜曱基菌屬 (Me^y/o; /H7w》細菌、曱基菌屬(M^/^/o6a"'〃0細菌中自主復制的質(zhì)粒。具 體而言有廣宿主范圍載體RSF1010及其衍生物等，例如pAYC32 (Chistosterdov， A. Y., Tsygankov, Y. D. Plasmid, 1986， 16， 161-167)、 pMFY42 (gene, 44, 53 (1990》、pRP301或pTB70 (Nature, 287, 396, (1980))等。
同樣，在本說明書的實施例中4吏用的pAYCTER3是優(yōu)選的載體。 pAYCTER3是在pAYC32的基礎(chǔ)上刪除了其鏈霉素抗性基因(strA,B)的上游 區(qū)域，并且在該位置插入了 pUC19的多克隆位點和大腸桿菌rrnB基因的終 止子而獲得的質(zhì)粒。即，pAYCTER3是一種高表達載體，其本身不表達鏈 霉素抗性，但如果在多克隆位點沿strA的正向插入包含啟動子序列的DNA， 則可通過連讀變?yōu)殒溍顾乜剐浴?br> 為了將上述DNA構(gòu)建體與攜帶在甲醇同化細菌中發(fā)揮功能的標記的載 體相連接從而制備重組DNA,可以用適合于目的基因的末端的限制酶切割 該載體。連接通常使用T4DNA連接酶等連接酶進行。
可以按照至今為止報導的轉(zhuǎn)化方法將如上述制備的重組DNA導入曱醇 同化細菌。例如由處于增殖階段的細胞制備感受態(tài)細胞并且將DNA導入 其中的方法(Dubunau and Davidoff-Abelson, J. Mol. Biol" 56， 209 (1971); Duncan, C. H.， Wilson, G. A. and Young， F.E.， Gene, 1， 153 (1977)),或者將宿 主細胞轉(zhuǎn)化成易于吸納重組DNA的原生質(zhì)體或原生質(zhì)球狀態(tài)從而將重組 DNA導入DNA受體細菌的方法(Chang, S. and Choen, S.N.， Molec. Gen. Genet., 168， 111 (1979》。
此外，可以使曱醇同化細菌的染色體DNA上存在單拷貝或多拷貝的本 發(fā)明的DNA構(gòu)建體，實現(xiàn)構(gòu)建含有本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的甲醇同化細菌 的目的?？梢圆捎孟率龇椒ㄔ跁醮纪毦娜旧wDNA上以單拷貝或多 拷貝的形式導入本發(fā)明的DNA構(gòu)建體利用在染色體DNA上存在多個拷 貝的序列作為靶標的同源重組，或者使用噬菌體等進行的在染色體DNA上 的隨機插入。關(guān)于在染色體DNA上存在多個拷貝的序列，可以利用轉(zhuǎn)座子、 重復序列和存在于轉(zhuǎn)座因子末端的反向重復序列等。此外，載體的擴增和
染色體上的多拷貝化可以與上述表達調(diào)控序列的修飾進行組合。
在以曱醇為碳源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上述獲得的甲醇同化細菌，使
該細菌分泌所述目的蛋白并回收分泌的目的蛋白，可以進行蛋白的生產(chǎn)。
在本說明書中，"分泌"蛋白質(zhì)或肽是指將蛋白質(zhì)或肽分子轉(zhuǎn)運至細
菌菌體外(細胞外)，其不僅包括蛋白質(zhì)或肽最終在培養(yǎng)基中處于完全游離狀
態(tài)的情況，還包括蛋白質(zhì)或肽僅部分存在于菌體外的情況，以及蛋白質(zhì)或
肽存在于菌體表層的情況。
本發(fā)明中優(yōu)選的分泌程度是可以從培養(yǎng)基或菌體回收目的蛋白。
將甲醇同化細菌培養(yǎng)在以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中。以曱醇為碳源的培
養(yǎng)基例如有添加了 0.001 30%曱醇的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基還可以含有曱醇以
外的碳源，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物等糖類， 甘油、山梨糖醇等醇類，延胡索酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸類。
作為除曱醇以外的其它培養(yǎng)基成分，可以添加在通常的培養(yǎng)中使用的 氮源、無機離子等培養(yǎng)基成分。為了獲得較高的生長，視需要還可以添加 維生素、氨基酸等有機微量營養(yǎng)元素。作為氮源，可以使用氨氣、氨水、 銨鹽或其它。作為無機離子，可以視需要適宜地使用鈣離子、鎂離子、磷
酸根離子、鉀離子、鐵離子等。培養(yǎng)例如可以在pH 5.0 9.0、 15。C 45。C的 適合范圍內(nèi)，在需氧條件下進行，培養(yǎng)時間可以是約1 7天。在這樣的條 件下培養(yǎng)曱醇同化細菌，可以在菌體內(nèi)大量產(chǎn)生并有效分泌目的蛋白。
當使用MDH基因啟動子等可甲醇誘導的啟動子時，可以在誘導條件下 進行培養(yǎng)，以提高多肽的產(chǎn)量?？梢圆捎猛ǔＳ糜谡T導MDH基因啟動子等 的條件進行誘導。通常，在曱醇中培養(yǎng)曱醇同化細菌時，無需特別誘導， MDH啟動子即可發(fā)揮功能。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，可以從培養(yǎng)后的培養(yǎng)基中分離、純
化本發(fā)明的分泌到培養(yǎng)基中的蛋白。例如，在通過離心分離等除去菌體后， 采用適合的已知方法例如鹽析、乙醇沉淀、超濾、凝膠過濾層析、離子交 換柱層析、親和層析、中高壓液相層析、反相層析或疏水層析或它們的組 合，可以進行蛋白的分離和純化。而且，當多肽包含純化用序列時，可以 利用該序列進行純化。
在通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法例如提高鹽濃度或使用表面活性劑 來溶解蛋白質(zhì)之后，按照與分泌到培養(yǎng)基中的情況相同的方式，也可以分
離和純化本發(fā)明的分泌到菌體表層的蛋白。此外，在某些情況下也可以不 進行溶解處理而使用分泌到菌體表層的蛋白，例如將其作為固定化酶。
以下通過實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但這些實施例并不在任 何意義上構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
實施例
實施例1:源自大腸桿菌K-12菌林的p-內(nèi)酰胺酶在食曱基嗜甲基菌ATCC 53528中的分泌表達
(1 )在曱基同化細菌中發(fā)揮功能的表達質(zhì)粒pAYCTER3的構(gòu)建
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法對序列號3和序列號4記載的合成 DNA進行退火，以制備多位點接頭(polylinker),所述序列號3和序列號4 記載的合成DNA被設計成含有pUC19的多克隆位點的序列。該多位點接 頭被設計成具有與用限制酶EcoRI和BglII切割后相同的末端形式。然后， 合成序列號5和序列號6記載的引物，采用PCR方法，從按常規(guī)方法(Saito 和Miura的方法，[Biochem, Biophys. Acta， 72, 619 (1963)])制備的大腸桿菌 K-12菌抹的染色體DNA中擴增出編碼miB的終止序列的區(qū)域。在序列號 3的引物中設計由限制酶BglII識別的序列，并且在序列號4的引物中設計 由限制酶Bcll識別的序列。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARABIO INC. 制造)進行PCR反應，反應條件采用制造商建議的方案。用限制酶BglII和 BclI消化該PCR片段，然后將其與前述多位點接頭連接，得到約400 bp的 DNA片段。使用DNA Ligation Kit Ver. 2.1(由TAKARA BIO INC.制造)進行 連接反應，反應條件采用制造商建議的方案。接下來，用限制酶EcoRI和 BamHI切割公知的質(zhì)粒pAYC32 (丄Gen. Microbiol., 137, 169-178 (1991)),回 收切出的約9.2 kbp的片段，通過將前述的DNA片段插入其中，構(gòu)建在食 曱基嗜曱基菌ATCC 53528中發(fā)揮功能的表達質(zhì)粒pAYCTER3 。該 pAYCTER3的結(jié)構(gòu)缺失pAYC32中的strA基因的5'側(cè)上游序列，取而代之 的是pUC19多克隆位點和rmB終止子，并且包含源自大腸桿菌的(3-內(nèi)酰胺 酶基因。
(2) p-內(nèi)酰胺酶在食甲基嗜甲基菌ATCC 53528中的分泌表達
用在上述(l)中構(gòu)建的用pAYCTER3轉(zhuǎn)化的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528，選擇在含25 mg/1氨芐西林和1%甲醇的SEIIA瓊脂培養(yǎng)基(硫酸銨5g、 K2HP041.9g、 NaH2P04.2H20 1.56g、硫酸鎂200 mg、氯化鈣72mg、硫 酸銅5 ng、碌u酸錳25 jig、石危酸鋅23 )ig、三氯化4失9.7 mg、瓊脂15 g，溶 flLH20,調(diào)至pH 7.0)上生長的菌抹。接下來，用含25 mg/l氨千西林和 2%曱醇的SEIIA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)選出的攜帶pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌 ATCC 53528，培養(yǎng)條件為37°C、 48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，對攜帶pAYCTER3 的食曱基嗜甲基菌ATCC 53528的菌體的培養(yǎng)物上清液進行SDS-PAGE，可 以檢測出培養(yǎng)物上清液中含有與(3-內(nèi)酰胺酶同分子量的蛋白。使用蛋白測 序儀PPSQ-21A(由島津制作所制造)測定該蛋白的N末端序列，結(jié)果確定其 為(3-內(nèi)酰胺酶的成熟序列，從而確認了 (3-內(nèi)酰胺酶分泌至培養(yǎng)物上清液中 的事實。
實施例2:源自大腸桿菌K-12菌林的肌醇六磷酸酶在食甲基嗜甲基菌 ATCC 53528中的分泌表達
(l)源自食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的曱醇脫氫酶基因的獲取
源自食甲基嗜曱基菌W3A1菌抹的曱醇脫氫酶基因的序列既已測定 (Genbank Accession No. U41040)。參考該序列，合成序列號1和序列號2所 示的引物，采用PCR方法，從按前述的Saito和Miura的方法制備的食曱基 嗜曱基菌ATCC 53528的染色體DNA中擴增出編碼甲醇脫氫酶序列的區(qū)域。 使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC制造)進行PCR反應，反應 條件采用制造商建議的方案。
然后，將擴增出的約l.Okb的DNA片段使用Random Primer DNA Labeling Kit Ver 2.(由TAKARA BIO INC.制造)和[a-32P]dCTP按試劑盒附帶 的說明書進行反應，由此制備DNA探針。使用制備的探針和食曱基嗜曱基 菌ATCC 53528的染色體DNA，按照如分子克隆第二版(Molecular Cloning 2nd edition) (J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press， p9.31 (1989))中描述的常規(guī)方法進行Southern印跡雜交，確 認了在用限制酶PvuII切出的約5.5 kb的片段中存在曱醇脫氫酶基因。因此， 使用EASYTRAPVer.2(由TAKARA BIO INC.制造)，通過瓊脂糖凝膠電泳回 收用限制酶PvuII消化食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的染色體DNA所得的 約5.5 kb的片段，將該片段插入pUC18 (由TAKARA BIO INC制造)的Smal 位點，然后將所得質(zhì)粒導入大腸桿菌JM109 (由TAKARA BIO INC.制造)的 感受態(tài)細胞中，由此制備文庫。
使用之前制備的曱醇脫氫酶的DNA探針，采用分子克隆第二版(J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl.91 (1989))的菌落雜交方法進行文庫篩選，獲取攜帶克隆了曱醇脫氫酶基 因片段的質(zhì)粒的菌抹，從該菌抹回收質(zhì)粒，將其命名為pUMDH。測定克隆 于pUMDH的片段的堿基序列，確認了食曱基嗜甲基菌ATCC 53528的曱醇 脫氫酶基因具有顯示與食曱基嗜曱基菌W3A1菌抹的曱醇脫氫酶基因95% 以上同源性的堿基序歹'j(序列號13)。堿基序列測定結(jié)果表明約5.5 kb的 PvuII片段包含全長曱醇脫氫酶基因及其5，側(cè)上游約2.5 kb。堿基序列的測 定使用染料終止循環(huán)測序試劑盒(terminator cycle sequencing kit;由PE Applied Biosystems制造)和DNA測序4義373A (由PE Applied Biosystems制造)。
(2)源自大腸桿菌K-12菌林的肌醇六磷酸酶基因的獲取與分泌表達質(zhì)粒的 構(gòu)建
源自大腸桿菌K-12菌抹的肌醇六磷酸酶基因的序列既已測定(Genbank Accession No. AE000200:序列號15)。參考該序列，合成序列號7和序列號 8所示的引物，采用PCR方法，從按前述的Saito和Miura的方法制備的大 腸桿菌K-12菌抹的染色體DNA中擴增出編碼肌醇六磷酸酶序列(成熟型) 的區(qū)域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARABIO INC.制造)進行PCR反 應，反應條件采用制造商建議的方案。
然后，使用序列號9和序列號IO所示的引物，采用PCR方法，從按前 述的Saito和Miura的方法制備的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的染色體 DNA中擴增出曱醇脫氫酶的啟動子區(qū)域和信號序列區(qū)域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARABIO INC.制造)進行PCR反應，反應條件采用制造 商建議的方案。為了構(gòu)建與肌醇六磷酸酶的融合基因，序列號IO所示的引 物包含編碼肌醇六磷酸酶N末端側(cè)氨基酸序列的序列。
然后，混合前述擴增出的編碼大腸桿菌K-12菌抹肌醇六磷酸酶序列(成 熟型)的區(qū)域和前述擴增出的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528曱醇脫氫酶的啟 動子區(qū)域和信號序列區(qū)域的PCR反應液作為^^莫板，使用序列號9和序 列號8的引物進行交換PCR,擴增出與食曱基嗜甲基菌ATCC 53528曱醇脫 氫酶基因的啟動子區(qū)域和信號序列區(qū)域相連的肌醇六磷酸酶的融合基因。 通過瓊脂糖凝膠電泳4企測出約2.4 kb的擴增片段。使用EASYTRAP Ver.2 (由
TAKARA BIO INC.制造)從瓊脂糖凝膠中回收該片段，將其插入pHSG398 (由TAKARA BIO INC制造)的Smal位點，從而得到pHSGMappA。對插入 片段進行堿基序列測定的結(jié)果確認構(gòu)建了如預想的融合基因。堿基序列的 測定使用染料終止循環(huán)測序試劑盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA 測序儀373A (由PE Applied Biosystems制造)。接下來，使用EASYTRAP Ver.2 (由TAKARA BIO INC.制造)從瓊脂糖凝膠中回收pHSGMappA的 BamHI-Kpnl片段，使用DNA blunting Kit (由TAKARA BIO INC.制造)將片 段的末端平端化。接下來，使用EASYTRAP Ver.2 (由TAKARA BIO INC. 制造)從瓊脂糖凝膠中回收實施例1 (l)中構(gòu)建的pAYCTER3的EcoRI片段， 使用DNA blunting Kit (由TAKARA BIO INC.制造)將所述片段的末端平端 化，然后插入已平端化的BamHI-Kpnl片段，從而得到pAYCMappA。按照 前述方法對插入片段進行堿基序列測定的結(jié)果確認構(gòu)建了如預想的異源融 合基因。
(3)肌醇六磷酸酶基因在食甲基嗜曱基菌ATCC 53528中的表達
用上述(2)中構(gòu)建的pAYCMappA (通過將源自食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的曱醇脫氫酶的啟動子序列和信號序列與源自大腸桿菌K-12菌抹的 肌醇六磷酸酶基因相連接來獲得)及作為對照的pAYCTER3分別轉(zhuǎn)化食曱 基嗜曱基菌ATCC 53528，選擇在含25 mg/1氨芐西林和1%曱醇的SEIIA瓊 脂培養(yǎng)基(硫酸銨5 g、 K2HP04 1.9 g、 NaH2P04'2 H20 1.56 g、硫酸鎂200 mg、 氯化4丐72 mg、硫酸銅5 )ig、硫酸錳25嗎、硫酸鋅23嗎、三氯化鐵9,7 mg、 瓊脂15g，溶于1LH20，調(diào)至pH7.0)上生長的菌抹。接下來，用含25mg/1 氨,西林和2%曱醇的SEIIA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)選出的攜帶pAYCMappA或 pAYCTER3的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528,分別于37。C培養(yǎng)48小時。培 養(yǎng)結(jié)束后，對攜帶pAYCMappA或pAYCTER3的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的各菌體的培養(yǎng)物上清液進行SDS-PAGE,結(jié)果僅在攜帶 pAYCMappA的菌抹的培養(yǎng)物上清液中檢出了具有目標分子量的蛋白。然 后，以各菌體的培養(yǎng)物上清液為粗酶液，測定其肌醇六磷酸酶活性。酶活 性測定采用已經(jīng)報導的方法進行(J AOAC Int. 1994 May-Jun; 77(3): 760-4.)。 其結(jié)果，對于攜帶pAYCTER3的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528,在其培養(yǎng)物 上清液中未檢出酶活性；而對于攜帶pAYCMappA的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528，檢出其培養(yǎng)物上清液中的酶活性為60 FTU/mL (37°C、 pH 5.5),從
而確認了肌醇六磷酸酶分泌至培養(yǎng)物上清液中的事實。
實施例3:源自摩氏摩根氏菌菌林的酸性磷酸酶在食甲基嗜曱基菌ATCC 53528中的分泌表達
(l)源自摩氏摩根氏菌菌林的酸性磷酸酶基因的獲取與分泌表達用質(zhì)粒的構(gòu) 建
源自摩氏摩根氏菌菌抹的酸性磷酸酶基因的序列既已測定(Genbank Accession No. AB035805:序列號25)。參考該序列，合成序列號27和序列 號28所示的引物，采用PCR方法，從按前述的Saito和Miura的方法制備 的摩氏摩根氏菌菌抹的染色體DNA中擴增出編碼酸性磷酸酶序列(成熟型) 的區(qū)域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)進行PCR反 應，反應條件采用制造商建議的方案。為了構(gòu)建與食曱基嗜甲基菌曱醇脫 氬酶的融合基因，序列號27所示的引物包含編碼曱醇脫氬酶信號序列的C 末端側(cè)氨基酸序列的序列。
然后，使用序列號9和序列號29所示的引物，采用PCR方法，從按前 述的Saito和Miura的方法制備的食甲基嗜曱基菌ATCC 53528的染色體 DNA中擴增出甲醇脫氫酶的啟動子區(qū)域和信號序列區(qū)域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARABIO INC.制造)進行PCR反應，反應條件采用制造 商建議的方案。
然后，混合前述擴增出的編碼摩氏摩根氏菌菌抹酸性磷酸酶序列(成熟 型)的區(qū)域和前述擴增出的食曱基嗜甲基菌ATCC 53528曱醇脫氫酶的啟動 子區(qū)域和信號序列區(qū)域的PCR反應液1 )il作為模板，使用序列號9和序列 號28的引物進行交換PCR，擴增出與食曱基嗜曱基菌ATCC 53528曱醇脫 氬酶基因的啟動子和信號序列相連的酸性磷酸酶的融合基因。通過瓊脂糖 凝膠電泳檢測出約1.8 kb的擴增片段。使用EASYTRAP Ver.2 (由TAKARA BIO INC.制造)從瓊脂糖凝膠中回收該片段，并且將其插入pHSG398 (由 TAKARA BIO INC.制造)的Smal位點，從而得到pHSGMphoC。對插入片段 進行堿基序列測定的結(jié)果確認構(gòu)建了如預想的融合基因。堿基序列的測定 4吏用染津+纟冬止4盾玉不測序i式劑盒(dye terminator cycle sequencing kit;由PE Applied Biosystems制造)和DNA測序儀373A (由PE Applied Biosystems制 造)。接下來，使用EASYTRAP Ver.2 (由TAKARABIO INC.制造)從瓊脂糖 凝膠中回收pHSGMphoC的BamHI-Kpnl片段,使用DNA blunting Kit (由
TAKARA BIO INC.制造)將所述片段的末端平端化。接下來，使用 EASYTRAP Ver.2 (由TAKARA BIO INC.制造)從瓊脂糖凝膠中回收實施例 l(l)中構(gòu)建的pAYCTER3的Smal片段，然后將已末端平端化的BamHI-Kpnl 片段插入，從而得到pAYCMphoC。按照前述方法對插入片段進行堿基序列 測定的結(jié)果確認構(gòu)建了如預想的異源融合基因。 (2)酸性磷酸酶基因在食曱基嗜曱基菌ATCC 53528中的表達
用上述(l)中構(gòu)建的pAYCMphoC (通過將源自食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的曱醇脫氫酶的啟動子序列和信號序列與源自摩氏摩根氏菌菌株的 酸性磷酸酶基因相連接來獲得)及作為對照的pAYCTER3分別轉(zhuǎn)化食曱基 嗜曱基菌ATCC 53528，選擇在含25 mg/1氨芐西林和1%曱醇的SEIIA瓊脂 培養(yǎng)基上生長的菌抹。接下來，用含25 mg/1氨千西林和2%曱醇的SEIIA 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)選出的攜帶pAYCMphoC或pAYCTER3的食甲基嗜曱基菌 ATCC 53528,分別于37。C培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，對攜帶pAYCMphoC 或pAYCTER3的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的各菌體的培養(yǎng)物上清液進 行SDS-PAGE,僅在攜帶pAYCMphoC的菌抹的培養(yǎng)物上清液中檢出了具有 目標分子量即約25 kDa的蛋白。然后，以各菌體的培養(yǎng)物上清液為粗酶液， 使用底物pNPP測定其磷酸酶活性，其結(jié)果對于攜帶pAYCTER3的食曱 基嗜曱基菌ATCC 53528,在其培養(yǎng)物上清液中未檢出酶活性；而對于攜帶 pAYCMphoC的食甲基嗜曱基菌ATCC 53528，在其培養(yǎng)物上清液中檢出了 酶活性，從而確認了酸性磷酸酶分泌至培養(yǎng)物上清液中的事實。 實施例4:源自更換了信號序列的大腸桿菌K-12菌林的肌醇六磷酸酶在食 曱基嗜甲基菌ATCC 53528中的分泌表達
(l)源自更換了信號序列的大腸桿菌K-12菌抹的肌醇六磷酸酶的分泌表達 質(zhì)粒的構(gòu)建
使用序列號30和序列號31所示的引物，采用PCR方法，從按前述的 Saito和Miura的方法制備的食甲基嗜甲基菌ATCC 53528的染色體DNA中 擴增出曱醇脫氫酶的啟動子區(qū)域。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIOINC.制造)進行PCR反應，反應條件采用制造商建議的方案。序列號30 所示的引物中包含限制酶HindIII的識別序列。
為了利用源自大腸桿菌K-12菌抹的肌醇六磷酸酶的信號序列，使用序 列號32和序列號33所示的引物，采用PCR方法，從按前述的Saito和Miura的方法制備的大腸桿菌K-12菌株的染色體DNA中擴增出包含信號序列的 肌醇六磷酸酶基因。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造) 進行PCR反應，反應條件采用制造商建議的方案。為了構(gòu)建與食曱基嗜曱 基菌曱醇脫氫酶的融合基因，序列號32所示的引物包含編碼曱醇脫氫酶啟 動子序列的C末端側(cè)氨基酸序列的序列，并且序列號33所示的引物包含限 制酶KpnI的識別序列。
然后，混合前述擴增出的編碼大腸桿菌K-12菌抹的肌醇六磷酸酶序列 的區(qū)域和前述擴增出的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528曱醇脫氫酶的啟動子 區(qū)域的PCR反應液lpl作為模板，使用序列號30和序列號33的引物進行 交換PCR,擴增出與食曱基嗜甲基菌ATCC 53528的曱醇脫氫酶基因的啟動 子相連的大腸桿菌肌醇六磷酸酶的信號序列和成熟基因的融合基因。通過 瓊脂糖凝膠電泳檢測出約2.4 kb的擴增片段。使用EASYTRAP Ver.2 (由 TAKARA BIO INC.制造)從瓊脂糖凝膠中回收該HindIII-KpnI片段，并且將 其插入實施例1(1)的pAYCTER3的HindIII-KpnI位點，從而得到 pAYCAappA。對插入片段進行堿基序列測定的結(jié)果確認構(gòu)建了如預想的融 合基因。石威基序列的測定使用染料終止循環(huán)測序試劑盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA測序4義373A(由PE Applied Biosystems制造)。
另 一方面，為了利用源自摩氏摩根氏菌菌抹的酸性磷酸酶的信號序列， 使用序列號34和序列號28所示的引物，采用PCR方法，從按前述的Saito 和Miura的方法制備的摩氏摩根氏菌菌抹的染色體DNA中擴增出包含信號 序列的酸性磷酸酶基因。使用Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC. 制造)進行PCR反應，反應條件采用制造商建議的方案。為了構(gòu)建與食曱基 嗜曱基菌曱醇脫氫酶的融合基因，序列號34所示的引物包含編碼甲醇脫氫 酶的啟動子序列的C末端側(cè)氨基酸序列的序列。
混合前述擴增出的酸性磷酸酶基因和前述的曱醇脫氫酶的啟動子區(qū)域 的PCR反應液lpl作為模板，使用序列號30和序列號28的引物進行交換 PCR，擴增出與食曱基嗜甲基菌ATCC 53528的曱醇脫氫酶基因的啟動子相 連的摩氏摩根氏菌的酸性磷酸酶的信號序列和成熟基因的融合基因。進一 步，以該融合基因為模板，使用序列號30和序列號35所示的引物擴增出 食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的曱醇脫氫酶基因的啟動子和摩氏摩根氏菌 的酸性磷酸酶的信號序列部分。為了構(gòu)建與大腸桿菌肌醇六磷酸酶的融合
基因，序列號35所示的引物包含編碼肌醇六磷酸酶成熟型序列的N末端側(cè) 氨基酸序列的序列。
混合前述擴增出的曱醇脫氫酶的啟動子區(qū)域與酸性磷酸酶的信號序列 的融合基因和在實施例2(2)中擴增出的肌醇六磷酸酶基因的PCR反應液 作為模板，使用序列號30和序列號33的引物進行交換PCR，擴增出與食 曱基嗜曱基菌ATCC 53528曱醇脫氬酶基因的啟動子相連的摩氏摩根氏菌 酸性磷酸酶的信號序列與大腸桿菌肌醇六磷酸酶成熟基因的融合基因。通 過瓊脂糖凝膠電泳檢測出約2.4 kb的擴增片段。用限制酶HindIII和Kpnl 處理該擴增片段，使用EASYTRAP Ver.2 (由TAKARA BIO INC.制造)從瓊脂 糖凝膠中回收HindIII-KpnI片段，并且將其插入實施例1 (l)中獲得的 pAYCTER3的Hindin-Kpnl位點，從而得到pAYCCappA。對插入片段進行 堿基序列測定的結(jié)果確認構(gòu)建了如預想的融合基因。堿基序列的測定使用 染料終止循環(huán)測序試劑盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA測序儀 373A(由PE Applied Biosystems制造)。
(2)與大腸桿菌肌醇六磷酸酶的信號序列及摩氏摩根氏菌酸性磷酸酶的信號 序列相連的大腸桿菌成熟型肌醇六磷酸酶在食曱基嗜曱基菌ATCC 53528 中的表達
用上述(l)中構(gòu)建的pAYCAappA (通過將源自食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的曱醇脫氫酶的啟動子序列和源自大腸桿菌的肌醇六磷酸酶的信號 序列與成熟型序列的基因相連接來獲得)、和pAYCCappA (通過將源自食甲 基嗜曱基菌ATCC 53528的曱醇脫氫酶的啟動子序列和源自摩氏摩根氏菌 的酸性磷酸酶的信號序列與源自大腸桿菌的肌醇六磷酸酶的成熟型序列的 基因相連接來獲得)及作為對照的pAYCTER3分別轉(zhuǎn)化食甲基嗜甲基菌 ATCC 53528，選擇在含25 mg/1氨千西林和1%曱醇的SEIIA瓊脂培養(yǎng)基上 生長的菌林。接下來，用含25 mg/1氨芐西林和2%曱醇的SEIIA液體培養(yǎng) 基培養(yǎng)選出的攜帶pAYCAappA或pAYCCappA或pAYCTER3的食曱基嗜 曱基菌ATCC 53528，分別于37。C培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，對攜帶 pAYCAappA或pAYCCappA或pAYCTER3的食甲基嗜曱基菌ATCC 53528 的各菌體的培養(yǎng)物上清液進行SDS-PAGE，結(jié)果僅在攜帶pAYCAappA和攜 帶pAYCCappA的菌抹的培養(yǎng)物上清液中檢出了具有目標分子量的蛋白。然 后，以各菌體的培養(yǎng)物上清液為粗酶液，測定其肌醇六磷酸酶活性，其結(jié)
果對于攜帶pAYCTER3的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528，在其培養(yǎng)物上清 液中未4企出酶活性；而對于攜帶pAYCAappA和攜帶pAYCCappA的食曱基 嗜曱基菌ATCC 53528，分別在其培養(yǎng)物上清液中檢出了酶活性，從而確認 了肌醇六磷酸酶分泌至培養(yǎng)物上清液中的事實。酶活性的測定方法與前述 實施例2中記載的方法相同。
實施例5:源自大腸桿菌K-12菌抹的更換了啟動子的肌醇六磷酸酶在食曱 基嗜曱基菌ATCC 53528中的分泌表達
(l)源自大腸桿菌K-12菌抹的更換了啟動子的肌醇六磷酸酶的分泌表達質(zhì) 粒構(gòu)建
為了利用tac啟動子，以pKK223-3 (由Pharmacia制造)為模板，使用序 列號36和序列號37所示的引物，采用PCR方法，擴增出tac啟動子區(qū)域。 所使用的tac啟動子的序列如序列號12所示。使用Pyrobest DNA聚合酶(由 TAKARA BIO INC.制造)進行PCR反應，反應條件采用制造商建議的方案。 序列號36所示的引物中包含限制酶EcoRI的識別序列。
以實施例2 (2)得到的pAYCMappA為模板，使用序列號38和序列號39 所示的引物，采用PCR方法，擴增出源自食曱基嗜曱基菌的曱醇脫氫酶的 信號序列與源自大腸桿菌的肌醇六磷酸酶(成熟型)的融合基因。使用 Pyrobest DNA聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)進行PCR反應，反應條件 采用制造商建議的方案。為了構(gòu)建與tac啟動子的融合基因，序列號38所 示的引物包含tac啟動子的一部分的序列，而序列號39所示的引物包含限 制酶EcoRI的識別序列。
然后，混合前述擴增出的編碼tac啟動子序列的區(qū)域和前述擴增出的編 碼源自食曱基嗜曱基菌的曱醇脫氫酶的信號序列與源自大腸桿菌的肌醇六 磷酸酶(成熟型)的融合基因的區(qū)域的PCR反應液1 (il作為模板，使用序列號 36和序列號39的引物進行交換PCR，擴增出與tac啟動子相連的源自食曱 基嗜曱基菌的曱醇脫氫酶的信號序列與源自大腸桿菌的肌醇六磷酸酶的成 熟基因的融合基因。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測出約1.6 kb的擴增片段。用 EcoRI處理該擴增片段，然后使用EASYTRAP Ver.2 (由TAKARA BIO INC. 制造)從瓊脂糖凝膠中回收所述EcoRI片段，并且將其插入實施例l(l)獲得 的pAYCTER3的EcoRJ位點，/人而得到pAYCPtacMappA。對插入片,殳進4亍 堿基序列測定的結(jié)果確認構(gòu)建了如預想的融合基因。堿基序列的測定使用
染料終止循環(huán)測序試劑盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA測序儀 373A(由PE Applied Biosystems制造)。
(2)與tac啟動子相連的源自大腸桿菌的肌醇六磷酸酶在食曱基嗜曱基菌 ATCC 53528中的表達
用上述(l)中構(gòu)建的pAYCPtacMappA (通過將tac啟動子序列和源自食 曱基嗜甲基菌ATCC 53528的曱醇脫氫酶的信號序列與源自大腸桿菌的肌 醇六磷酸酶的成熟型序列的基因相連接得到)及作為對照的pAYCTER3分 別轉(zhuǎn)化食曱基嗜曱基菌ATCC 53528菌抹，選擇在含25 mg/1氨千西林和1% 曱醇的SEIIA瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌抹。接下來，用含25mg/l氨千西林和 2%曱醇的SEIIA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)選出的攜帶pAYCPtacMappA或 pAYCTER3的食甲基嗜曱基菌ATCC 53528，分別于37。C培養(yǎng)48小時。培 養(yǎng)結(jié)束后，對攜帶pAYCPtacMappA或pAYCTER3的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528的各菌體的培養(yǎng)物上清液進行SDS-PAGE,僅在攜帶pAYCPtacMappA 的菌抹的培養(yǎng)物上清液中檢出了具有目標分子量的蛋白。然后，以各菌體 的培養(yǎng)物上清液為粗酶液，測定其肌醇六磷酸酶活性，其結(jié)果對于攜帶 pAYCTER3的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528，在其培養(yǎng)物上清液中未檢出酶 活性；而對于攜帶pAYCPtacMappA的食曱基嗜曱基菌ATCC 53528,在其 培養(yǎng)物上清液中檢出了酶活性，從而確認了肌醇六磷酸酶分泌至培養(yǎng)物上 清液中的事實。酶活性的測定方法與前述實施例2中記載的方法相同。 實施例6:源自大腸桿菌K-12菌抹的p-內(nèi)酰胺酶在糖原甲基菌ATCC 29475 中的分泌表達
(l)在糖原甲基菌ATCC 29475中發(fā)揮功能的表達質(zhì)粒pAYCTER-tet的構(gòu)建 糖原曱基菌ATCC 29475菌抹具有氨芐西林和鏈霉素抗性，但對四環(huán)素 敏感，因此將四環(huán)素抗性基因?qū)雽嵤├? (l)中制備的分泌表達質(zhì)粒 pAYCTER3。以pRK310 (見Plasmid. 1985 Mar; 13(2): 149-53)為沖莫板，使用 序列號23和序列號24的引物，采用PCR方法，擴增出四環(huán)素抗性基因。 通過瓊脂糖凝膠電泳^^測出約1.5 kb的擴增片段。用限制酶BamHI處理該 擴增片段，然后使用EASYTRAPVer.2(由TAKARABIO INC.制造)從瓊脂糖 凝膠中回收所述片段，并且將其插入實施例1 (l)得到的pAYCTER3的 BamHI位點，從而得到pAYCTER-tet。對插入片段進行石咸基序列測定的結(jié) 果確認構(gòu)建了如預想的融合基因。序列號23和序列號24所示的引物包含
限制酶BamHI的識別序列。堿基序列的測定使用染料終止循環(huán)測序試劑盒 (由PE Applied Biosystems制造)和DNA測序儀373A (由PE Applied Biosystems制造)。
(2)卩-內(nèi)酰胺酶在糖原曱基菌ATCC 29475中的分泌表達
用在上述(l)中構(gòu)建的pAYCTER-tet轉(zhuǎn)化糖原曱基菌ATCC 29475,選揭， 在含5 mg/1四環(huán)素和1%曱醇的SEIIA瓊脂培養(yǎng)基(硫酸銨5 g、K2HP04 1.9 g、 NaH2P04.2H20 1.56 g、硫酸鎂200mg、氯化鈣72mg、硫酸銅5嗎、硫酸 錳25嗎、硫酸鋅23嗎、三氯化鐵9.7mg、瓊脂15g，溶于1 LH20，調(diào)至 pH7.0)上生長的菌株。接下來，用含5mg/l四環(huán)素和2。/。曱醇的SEIIA液體 培養(yǎng)基培養(yǎng)選出的攜帶pAYCTER-tet的糖原甲基菌ATCC 29475,培養(yǎng)條件 為30°C、 48小時。培養(yǎng)結(jié)束后，對攜帶pAYCTER-tet的糖原曱基菌ATCC 29475的菌體的培養(yǎng)物上清液進行SDS-PAGE ，可以檢測出培養(yǎng)物上清中含 有與(3-內(nèi)酰胺酶同分子量的蛋白。使用蛋白測序儀PPSQ-21A (由島津制作 所制造)測定該蛋白的N末端序列，結(jié)果確定其為p-內(nèi)酰胺酶的成熟型序列， 從而確認了 )3-內(nèi)酰胺酶分泌至培養(yǎng)物上清液中的事實。 實施例7:源自大腸桿菌K-12菌抹的肌醇六磷酸酶在糖原曱基菌ATCC 29475中的分泌表達
(1) 糖原曱基菌ATCC 29475中源自大腸桿菌K-12菌株的肌醇六磷酸酶的分 泌表達質(zhì)粒的構(gòu)建
為了在糖原曱基菌ATCC 29475菌抹中分泌表達源自大腸桿菌的肌醇 六磷酸酶，將實施例6(1)中制備的四環(huán)素抗性基因的BamHI處理片段插入 實施例5(1)中制備的肌醇六磷酸酶分泌表達質(zhì)粒pAYCPtacMappA的BamHI 位點，從而得到pAYCPtacMappA-tet。對插入片段進行堿基序列測定的結(jié)果 確認構(gòu)建了如預想的融合基因。堿基序列的測定使用染料終止循環(huán)測序試 劑盒(由PE Applied Biosystems制造)和DNA測序儀373A (由PE Applied Biosystems制造)。
(2) 源自大腸桿菌的肌醇六磷酸酶在糖原甲基菌ATCC 29475中的表達
用上述(1)中構(gòu)建的pAYCPtacMappA-tet或作為對照的實施例6(2)中構(gòu) 建的pAYCTER-tet分別轉(zhuǎn)化糖原曱基菌ATCC 29475，選擇在含5 mg/1四環(huán) 素和1%甲醇的SmiA瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌抹。接下來，用含5mg/l四環(huán) 素和2Q/。曱醇的SEIIA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)選出的攜帶pAYCPtacMappA-tet或
pAYCTER-tet的糖原曱基菌ATCC 29475,分別于37。C培養(yǎng)48小時。培養(yǎng) 結(jié)束后，對攜帶pAYCPtacMappA-tet或pAYCTER-tet的糖原曱基菌ATCC 29475的各菌體的培養(yǎng)物上清液進行SDS-PAGE，結(jié)果僅在攜帶 pAYCPtacMappA-tet的菌抹的培養(yǎng)物上清液中檢出了具有目標分子量的蛋 白。然后，以各菌體的培養(yǎng)物上清液為粗酶液，測定其肌醇六磷酸酶活性， 其結(jié)果對于攜帶pAYCTER-tet的糖原曱基菌ATCC 29475,在其培養(yǎng)物上 清液中未檢出酶活性；而對于攜帶pAYCPtacMappA-tet的糖原曱基菌ATCC 29475,在其培養(yǎng)物上清液中檢出了酶活性，從而確認了肌醇六磷酸酶分泌 至培養(yǎng)物上清液中的事實。酶活性的測定方法與前述實施例2中記載的方 法相同。 工業(yè)實用性
通過本發(fā)明可以廉價、高效地進行蛋白質(zhì)的分泌生產(chǎn)。特別是可以高 效地分泌生產(chǎn)具有產(chǎn)業(yè)價值的蛋白質(zhì)，例如肌醇六磷酸酶等。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法，該方法包括通過在以甲醇為主要碳源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶DNA構(gòu)建體的甲醇同化細菌，使該細菌分泌目的蛋白，其中所述DNA構(gòu)建體包含在甲醇同化細菌中發(fā)揮功能的啟動子序列和以可表達的形式連接于該啟動子序列的、編碼包括信號序列和所述目的蛋白序列的多肽的核酸序列；和回收分泌的目的蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述在曱醇同化細菌中發(fā)揮功能的啟 動子序列選自曱醇脫氫酶的啟動子、tac啟動子、oE啟動子和核糖體蛋白啟 動子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述啟動子序列為具有序列號11、 12、 21或22的》威基序列的啟動子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項的方法，其中所述信號序列為選自曱醇脫 氫酶、肌醇六磷酸酶和酸性磷酸酶的蛋白質(zhì)的信號序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項的方法，其中所述信號序列具有選自序列 號18和20的氨基酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項的方法，其中所述甲醇同化細菌為選自下 組的細菌嗜曱基菌屬(methylophilus)細菌、曱基菌屬(methylobacillus)細菌、 逸曱基菌屬(methylophaga)細菌、無色桿菌屬achromobacter細菌、々i單月包 菌屬(pseudomonas)纟田菌、精朊桿菌屬(protaminnobacter)纟田菌、曱烷單胞菌 屬(methanomonas纟田菌、微環(huán)菌屬(microcyclus力纟田菌和甲基桿菌屬 (methylobacterium)纟田菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項的方法，其中所述蛋白為選自肌醇六磷酸 酶、白細胞介素、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、干擾素、胰島素、酸性磷酸酶和肽合成 酶(peptide synthase)的蛋白。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1 7任一項的方法，其中所述曱醇同化細菌為專性甲 醇同化細菌。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述專性曱醇同化細菌為選自下組的 細菌嗜曱基菌屬(methylophilus力細菌、甲基菌屬(methylobacillus力細菌和噬甲基菌屬methylophaga細菌
全文摘要
通過在以甲醇為主要碳源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶DNA構(gòu)建體的甲醇同化細菌，使該細菌分泌目的蛋白，其中所述DNA構(gòu)建體包含可在甲醇同化細菌中發(fā)揮功能的啟動子序列和以可表達的形式連接于該啟動子序列的、編碼包括信號序列和目的蛋白序列的多肽的核酸序列；和將分泌的目的蛋白回收。
文檔編號C12P21/02GK101175859SQ20068001631
公開日2008年5月7日 申請日期2006年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月12日
發(fā)明者伊達雅代, 板屋寬, 菊池慶實 申請人:味之素株式會社