專利名稱：圓海鏈藻的檢測探針及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于利用分子生物學方法檢測海洋環(huán)境微生物的技術領域。具體地說，它涉及可用于檢測圓海鏈藻的核苷酸序列和以此序列為基礎設計的核酸分子探針以及利用該分子探針檢測圓海鏈藻的方法。
背景技術：
圓海鏈藻(Thalassiosira rotula)是一種世界范圍內廣泛存在的廣溫廣鹽性浮游植物，也是我國近海常見的硅藻優(yōu)勢種之一，被列為中國沿岸赤潮生物種類名錄。圓海鏈藻增值速度極快，并且能夠產生一些短鏈的醛類物質，這些醛類物質能抑制撓足類卵的發(fā)育，當赤潮發(fā)生時能夠影響橈足類的種群結構，硅藻對橈足類生殖的抑制作用為目前海洋生態(tài)學的研究熱點之一。因此，準確、快速地檢測圓海鏈藻及其數(shù)量，了解其在海區(qū)的種群動態(tài)，對海洋生態(tài)環(huán)境及赤潮監(jiān)測研究具有重要意義。
在分類學上，圓海鏈藻隸屬硅藻門，圓心硅藻目，海鏈藻科，海鏈藻屬。雖然傳統(tǒng)的從形態(tài)學上區(qū)分圓海鏈藻并不十分困難，但由于這種方法操作煩瑣，費時、費力，當樣品量多時工作量極大。因此，采用新方法新技術快速識別圓海鏈藻極具現(xiàn)實意義。但是，國際國內目前并沒有針對該藻從這方面進行研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供圓海鏈藻分子生物學檢測的遺傳標記和方法，它可以從遺傳本質上客觀、準確地對該藻進行檢測。具體包括1.提供用于圓海鏈藻檢測的基因片段；2.提供基于前述基因片段的圓海鏈藻的專一性遺傳標記，即核酸分子探針；3.提供利用這些遺傳標記進行快速檢測圓海鏈藻的方法；4.提供利用這些遺傳標記同時進行快速檢測和定量計數(shù)圓海鏈藻的方法。
本發(fā)明的最主要理論基礎是核糖體基因及其轉錄間隔區(qū)的序列多態(tài)性以及5’核酸酶檢測法。本發(fā)明的發(fā)明人首先測定了一株分離自膠州灣的圓海鏈藻的rDNA及ITS區(qū)總長約3000個堿基對的序列，通過與國際互聯(lián)網(wǎng)(Genbank)中所有已經公開的rDNA區(qū)序列比較發(fā)現(xiàn)，如序列表中SEQ ID NO.1所示的圓海鏈藻rDNA序列與其它生物的相應區(qū)域的序列有很大差別。為此發(fā)明人以該序列為基礎設計出如序列表中SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的總共三個核酸分子探針。用這三個探針，發(fā)明人建立了快速、準確檢測和定量計數(shù)圓海鏈藻的分子生物學方法。
本發(fā)明所提供的用于圓海鏈藻檢測的核苷酸序列(T.rotula Seq1.)涵蓋了如圖1所示的18s rDNA部分區(qū)域。其序列及結構特征如序列表SEQ ID NO.1所示。該序列(T.rotula Seq1)可用如實施例1的方法得到；或者按該序列的核苷酸組成和順序，在商業(yè)化的DNA自動合成儀上按常規(guī)方法合成得到。
本發(fā)明所述的其中兩個圓海鏈藻專一性核酸分子探針是以上述序列(T.rotulaSeq1)為基礎，通過Internet(因特網(wǎng))與國際分子生物學數(shù)據(jù)庫中的其它所有藻類的相應序列比較后，用常規(guī)的引物設計軟件設計而成的。它們的序列組成及其結構特征分別如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，它們在序列(T.rotula Seq1)中的位置如圖2所示。序列表中SEQ ID NO.2所示的核酸探針(T.rotula primer1)是序列(T.rotula Seq1)的18s rDNA區(qū)域中的一段由21個核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補序列，或者是由其再經修飾、變化，且核苷酸變化量不超過總核苷酸數(shù)的20％的序列。序列表中SEQ ID NO.3所示的核酸探針(T.rotula primer2)是序列(T.rotula Seq1)的18s rDNA區(qū)域中的一段由25個核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補序列，或者是由其再經修飾、變化，且核苷酸變化量不超過總核苷酸數(shù)的20％的序列。
本發(fā)明所述的兩個圓海鏈藻專一性核酸分子探針(T.rotula primer1和T.rotulaprimer2)可按照本發(fā)明已描述過的序列，通過常規(guī)的DNA合成方法合成而得(例如可以用商業(yè)化的DNA自動合成儀合成)。這兩個探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發(fā)光物質進行標記。
本發(fā)明所述的兩個圓海鏈藻專一性核酸分子探針具有較好的種特異性。以它們?yōu)橐粚σ镞M行常規(guī)PCR反應，結果只能從含有圓海鏈藻的材料的DNA提取物中擴增出大小為83bp的PCR產物。因此，以這兩個核酸分子探針為引物進行常規(guī)PCR反應，通過判斷相應大小PCR產物的有無可以準確、快速地檢測圓海鏈藻，而且所需的樣品量很少。
以T.rotula Seq1的序列為基礎，通過Internet(因特網(wǎng))與國際分子生物學數(shù)據(jù)庫中的其它所有藻類的相應序列比較后，本發(fā)明的發(fā)明人還設計出了另一個圓海鏈藻專一性核酸分子探針，其序列組成和結構特征如序列表中SEQ ID NO.4所示(名稱為T.rotula TaqMan Probe)；其在序列(T.rotula Seq1)中的位置如圖2所示。它是序列(T.rotula Seq1)的18s rDNA區(qū)域中的一段由24個核苷酸組成的寡核苷酸序列或其互補序列，或者是由其再經修飾、變化，且核苷酸變化量不超過總核苷酸數(shù)的20％的序列。該探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發(fā)光物質進行標記。將該序列的5’端用報告熒光基團如羧基熒光素(Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)等標記，3’端用淬滅熒光基團如TAMRA或Dabcyl等標記后即可用于對圓海鏈藻進行定性和定量分析的實時熒光定量PCR(RQ-PCR)反應。
以T.rotula primer1和T.rotula primer2兩個圓海鏈藻專一性核酸分子探針作為引物，以標記好的T.rotula TaqMan Probe(5’端用報告熒光基團如FAM等標記，3’端用淬滅熒光基團如TAMRA或Dabcyl等標記)為TaqMan探針，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)明了一種可同時對圓海鏈藻進行檢測和定量計數(shù)分析方法，即RQ-PCR反應。這種分析方法不僅克服了常規(guī)定量PCR方法中的誤差，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。


圖1為圓海鏈藻核糖體DNA(rDNA)及轉錄單元間隔區(qū)(ITS)在染色體上的排列順序。其中18s rDNA區(qū)域為本發(fā)明所涉及的核苷酸序列存在的區(qū)域。圖中，SSU為小亞基，LSU為大亞基，ITS為轉錄單元間隔區(qū)。
圖2為PCR結果。其中，所用引物為T.rotula primer1和T.rotula primer2。各電泳道所對應的藻種為Lane2.尖刺偽菱形藻；Lane3，14.圓海鏈藻；Lane4.旋鏈角毛藻；Lane5.柔弱角毛藻；Lane6.纖細角毛藻；Lane7.微型角毛藻；Lane8米氏裸甲藻；Lane9.裸甲藻；Lane11.赤潮異灣藻；Lane12.塔瑪亞歷山大藻；Lane13.新月菱形藻；Lane15.中肋骨條藻；Lane16.微小原甲藻；Lane17.直鏈藻；Lane18.膜質周形藻；Lane19.H2O；Lane1，10.DNA標記DL2,000(從上到下各條帶大小依次為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
圖3為各稀釋度DNA溶液熒光信號曲線。圖中橫座標為循環(huán)數(shù)，縱座標為熒光強度，與橫座標平行的雙箭頭粗線為Threshold.從左至右各曲線對應的圓海鏈藻細胞濃度(個細胞/μlDNA)依次為1.1×106、1.1×105、1.1×104、1.1×103、1.1×102，每個濃度上樣三次。
圖4為定量計數(shù)圓海鏈藻的標準曲線。
具體實施例方式
以下通過具體實施例進一步說明本發(fā)明實施例1.用于檢測圓海鏈藻的核苷酸序列的制備本發(fā)明所用的圓海鏈藻分離自膠州灣天然海水樣品。通過反復在顯微鏡下挑取單個藻細胞獲得純培養(yǎng)物。所用的培養(yǎng)基是常規(guī)的F/2培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為光照/黑暗周期為12h/12h，光照強度為4000Lx，培養(yǎng)溫度為22℃～25℃。
用0.45μm的微孔濾膜或10000r/min離心收集處于對數(shù)生長期的圓海鏈藻藻細胞，用TE buffer(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)洗下藻體，加入2倍體積的預熱至55℃的抽提緩沖液(3％(w/v)CTAB，1％(w/v)sarkosyl，20mmol/LEDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl pH 8.0，1％(v/v)2-mercaptoethanol)，55℃處理1小時，其間每10分鐘顛倒混勻一次；取出于4℃冰箱靜置3分鐘，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻至呈乳濁狀，10000r/min，4℃離心10分鐘，取上相；向上相中加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，重復上步一次；之后的操作同常規(guī)的DNA提取。最后提取的DNA用50μl TE buffer溶解。
取提取的DNA溶液1μl加入49μl的PCR反應液中(在50μl的反應體系中包括50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.5U polymerase，正反向引物各3μM)進行第一輪PCR。其中正向引物的序列是5’-GCTCGNMWYWARGRTTAAGCCATGC-3’，反向引物的序列為5’-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA-3’?；靹蚝?，放入有熱蓋的PCR儀中。PCR程序為94℃3分鐘；94℃30秒，50℃30秒，72℃1分鐘，共30個循環(huán)；72℃5分鐘。將所得的PCR產物用Watson公司的PCR產物純化試劑盒純化后，取1μl加入如上所述的PCR反應體系中進行第二輪PCR。此輪PCR所用的引物分別是5’-CCTTTGTACACACCGCCC-3’(正向)，5’-CACGGTACTTGTWYRCTATCGGT-3’(反向)。PCR程序為94℃3分鐘；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共30個循環(huán)；72℃5分鐘。第二輪的PCR產物于1％的瓊脂糖凝膠上電泳后，割膠切下最亮的條帶克隆入pMD18-T載體，于XL1-Blue大腸桿菌中無性繁殖后，用M13/pUC(-20和M13/pUC(-48)引物對在商用的自動測序儀上測序，從測出的序列中即可獲得如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸組成和排列。
實施例2.T.rotula primer1和T.rotula primer2的設計和合成通過與Genbank中所有已知的其它真核生物、原核生物的相應區(qū)域的序列做比較，發(fā)現(xiàn)如序列表中SEQ ID NO.1所示的序列與其他生物的相應序列有很大差別，為此發(fā)明人以該序列為基礎設計出如序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的兩個核酸分子探針。根據(jù)這兩個探針或其互補序列的核苷酸組成和排列，在商業(yè)化的DNA合成儀上即可獲上述的核苷酸序列。
實施例3.用常規(guī)PCR法檢測圓海鏈藻本實施例選用了本實驗室藻種庫的幾株優(yōu)勢浮游植物作為參照藻，它們是分離自膠州灣的旋鏈角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、柔弱角毛藻(C.debilis)、纖細角毛藻(C.gracile)、微型角毛藻(C.minimum)、裸甲藻(Gymnodinium sp.)、米氏裸甲藻(G.mikimotoi)、尖刺偽菱形藻(Pseudonitzschia pungens)、新月菱形藻(Nitzschia closterium)、膜質舟形藻(Navicula membranacea)、直鏈藻(Melosirasp.)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、分離自渤海灣的微小原甲藻(Prorocentrem minimun)，分離自大鵬灣的塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarens)，分離自大連灣的赤潮異灣藻(Heterosigma akashiwo)，它們均通過反復在顯微鏡下挑取單個藻細胞獲得純培養(yǎng)物。按實施例1所述的方法培養(yǎng)這些藻和提取這些藻及圓海鏈藻的DNA。
取各種藻的DNA提取物1μl，按實施例1所述的PCR反應體系進行PCR，以序列表2(T.rotula primer1)和序列表3(T.rotula primer2)所述的核苷酸序列作為正反向引物。PCR程序為94℃3分鐘；94℃30秒，59℃30秒，72℃30秒，共30個循環(huán)；72℃5分鐘。PCR產物于1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳后拍照，得到如圖3所示的結果。從圖3中可知，從圓海鏈藻DNA模板中擴增出一條大小為83bp的PCR產物；從其它藻的DNA模板基本未見到特異性擴增。
因此，對于某待檢樣品，以其DNA提取物為模板，以T.rotula primer1和T.rotulaprimer2為引物，以本實施例所述的PCR程序進行PCR反應，如果PCR產物中有大小為83bp的條帶，即可判定該樣品中有圓海鏈藻的存在；如果該樣品為純培養(yǎng)物，則可判定該純培養(yǎng)物為圓海鏈藻。
本方法的優(yōu)點由于本方法使用的是圓海鏈藻的專一性引物并通過PCR反應對待測樣品進行了擴增，因此該方法能非常準確地檢測樣品中是否存在圓海鏈藻，只要有相應大小的PCR產物出現(xiàn)，即可判定待檢樣品中有圓海鏈藻存在，而且根據(jù)PCR產物量的多少，還可初步估計樣品中圓海鏈藻的多少。同時本方法靈敏度很高，只要有很少的待檢材料即可進行準確檢測。
實施例4.RQ-PCR中所用的TaqMan探針的制備根據(jù)序列表中SEQ ID NO.4所示序列，用FAM熒光物質標記其5’端，用TAMRA標記其3’端。整個合成和標記過程可在商用的探針合成和標記儀上即可一次性完成。
實施例5.圓海鏈藻的RQ-PCR檢測和定量計數(shù)取處于對數(shù)生長期(培養(yǎng)了1周)的圓海鏈藻培養(yǎng)物計數(shù)，其細胞濃度為2.2×105個/ml，收集200ml培養(yǎng)物，于4℃10000r/min離心10分鐘，小心吸棄上清，沉淀用TE buffer溶解，再加入400μl預熱至55℃的抽提緩沖液(配方見實施例1)，55℃處理1小時，其間每10分鐘顛倒混勻一次；取出于4℃冰箱靜置3分鐘，加入800μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻至呈乳濁狀，10000r/min，4℃離心10分鐘；取550μl上相，向其中加入550μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，顛倒混勻至呈乳濁狀，10000r/min，4℃離心10分鐘；之后的操作完全按照Watson公司的植物葉DNA提取試劑盒的有關操作進行，只是最后一步用40μl TE液從吸附柱上洗下DNA(每1μl DNA溶液對應1.1×106個細胞。
取上述提取的DNA，按1∶10倍比稀釋，共5個稀釋度(各稀釋度對應的細胞濃度依次為1.1×106個/μl、1.1×105個/μl、1.1×104個/μl、1.1×103個/μl、1.1×102個/μl。然后分別取1μl DNA溶液加入49μlRQ-PCR反應體系(10×Ex TaqBuffer10μl；25mmol/L MgCl28μl；dNTP mixture(各2.5mmol/L)6μl；20mmol/LTh.rotula primer1 1μl；20mmol/L Th.rotula primer2 1μl；20mmol/L Th.rotulaProbe 0.4μl，0.5U/μl Ex Taq 0.5μl，于Bioer Line-gene FQD-33A儀中，按PCR程序(94℃5分鐘(94℃15秒60℃50秒)40個循環(huán))反應，并實時記錄熒光信號，得到如圖4示結果。該圖顯示了各DNA溶液在PCR過程中的熒光信號隨著循環(huán)數(shù)增加的變化曲線。根據(jù)RQ-PCR的原理，臨界線(Threshold)與各DNA溶液熒光信號曲線的交點所對應的循環(huán)數(shù)即為該DNA溶液的CT值。從圖4獲得各稀釋度DNA溶液的CT值。結合各DNA溶液的稀釋度、各向稀釋度對應的細胞濃度和CT值，得到如表1所示的數(shù)據(jù)。
表1.各DNA溶液的稀釋度及其對應的細胞濃度和CT值、實際用于RQ-PCR的細胞數(shù)

以用于RQ-PCR的實際細胞數(shù)的對數(shù)值為橫座標，以相應的CT值為縱座標，即可繪制出如圖5示的標準曲線。該曲線的方程式為y＝-3.4857x+40.174；其回歸系數(shù)為R2＝0.9962。
對于某一待測樣品，先按上述方法提取其DNA并做RQ-PCR，測出其CT值。以其CT值即可在圖5標準曲線上算出該待測樣品的細胞數(shù)，進而推算出其中圓海鏈藻的細胞濃度。
本方法最大的優(yōu)點是能同時進行定量和定性檢測，通過該方法既可知道待檢樣品中是否有圓海鏈藻存在，還可同時知道有多少該藻種存在。
本方法另一個明顯的優(yōu)點是定量準確，這是由實時熒光定量PCR方法本身以及本方法擴增的針對的靶片段所決定的。對于某一物種來說，核糖體基因在染色體上的拷貝數(shù)是恒定的，不會隨著細胞的生理狀態(tài)、生活環(huán)境的不同而改變，也就是說樣品中細胞的數(shù)量與樣品中染色體DNA上核糖體基因的數(shù)量是呈線性相關的，由于本方法擴增的靶片段是染色體DNA上的核糖體基因，因此擴增信號的強弱直接反映了待檢樣品中細胞數(shù)量的多少。
另外本方法操作過程簡單、省時，整個過程4個小時內即可全部完成，可以實現(xiàn)海區(qū)中圓海鏈藻動態(tài)的跟蹤監(jiān)測。
序列表<110>中國海洋大學<120>圓海鏈藻的檢測探針及檢測方法<160>4<210>1<211>200<212>DNA<213>圓海鏈藻(Thalassiosira rotula)<400>1accctttgta cacaccgccc gtcgcaccta ccgattgaat ggtccggtga 50ggactcggga ttgtggcttg gctccttcat tggggcctga ccgcgagaac100ttgtccgaac cttatcattt agaggaaggt gaagtcgtaa caaggtttcc150gtaggtgaaa tctctagagg atccccgggt accgagctcg aattcgtaat200<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>2ttgtggcttg gctccttcat t 21<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>3ttgttacgac ttcaccttcc tctaa 25<210>4
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>4ggcctgaccg cgagaacttg tccg 2權利要求
1.一種圓海鏈藻的檢測探針，其特征是該探針來源于如SEQ ID NO.1所示的圓海鏈藻rDNA核苷酸序列中的兩段寡核苷酸序列或其互補序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測探針，其特征是這兩個探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發(fā)光物質進行標記。
3.根據(jù)權利要求1所述的檢測探針，其特征是其核苷酸如SEQ ID NO.2所示，序列為5’ttgtggcttggctccttcatt，或其互補序列5’-aatgaaggagccaagccacaa。
4.根據(jù)權利要求1所述的檢測探針，其特征是其核苷酸如SEQ ID NO.3所示，序列為5’ttgttacgacttcaccttcctctaa，或其互補序列5’ttagaggaaggtgaagtcgtaacaa。
5.一種圓海鏈藻的分子檢測方法，其特征是采用PCR方法，以SEQ ID NO.2和3兩個核酸分子探針為一對PCR引物進行PCR反應，通過判斷相應大小PCR產物的有無來檢測圓海鏈藻。
6.一種圓海鏈藻的快速檢測和定量計數(shù)方法，其特征是采用熒光定量PCR方法，以SEQID NO.2和3兩個核酸分子探針為PCR引物，以一條用熒光標記的寡核苷酸序列為TaqMan探針進行實時熒光定量PCR。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征是所述的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示5’-ggcctgaccgcgagaacttgtccg，或其互補序列5’-cggacaagttctcgcggtcaggcc。
8.按照權利要求7所述的用熒光標記的寡核苷酸序列，其特征是其5’端用報告熒光基團標記，3’端用淬滅熒光基團標記。
全文摘要
本發(fā)明屬于利用分子生物學方法檢測環(huán)境微生物的技術領域。本發(fā)明公開了以圓海鏈藻核糖體DNA(rDNA)核苷酸序列為基礎設計的寡核苷酸探針，以該核酸分子探針為一對引物進行PCR反應，通過判斷相應大小PCR產物的有無可以準確、快速地檢測圓海鏈藻。本發(fā)明還公開了用這些探針采用熒光定量PCR技術來快速、準確地檢測和定量計數(shù)圓海鏈藻的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1786196SQ200510104328
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月24日 優(yōu)先權日2005年10月24日
發(fā)明者于志剛, 李榮秀, 何閃英, 米鐵柱, 蔡青松, 甄毓 申請人:中國海洋大學