專利名稱：植物二氫乳清酸酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可以作為除草劑的活性成分的新靶蛋白的植物二氫乳清酸酶的鑒定。本發(fā)明還涉及編碼具有二氫乳清酸酶(EC 3.5.2.3)活性多肽的DNA序列。本發(fā)明涉及應用植物來源的能夠編碼具有二氫乳清酸酶活性蛋白質(zhì)的核酸，產(chǎn)生一個測試系統(tǒng)用于鑒定除草活性的二氫乳清酸酶抑制劑，同時涉及利用這些方法和測系統(tǒng)所鑒定的植物二氫乳清酸酶的抑制劑。另外，本發(fā)明還涉及編碼具有二氫乳清酸脫氫酶活性多肽的DNA序列以及此多肽在分子測試系統(tǒng)中作為輔助酶的應用。而且本發(fā)明還涉及利用這個編碼植物二氫乳清酸酶的核酸來生產(chǎn)對二氫乳清酸酶抑制劑抗性增加的植物。此外，本發(fā)明涉及一種清除不被需要的植被的方法，它包括用一種化合物處理要被清除的植物，此化合物特異性地與二氫乳清酸酶結(jié)合并且抑制它的功能，其中二氫乳清酸酶是由SEQ-ID NO.1所示的一段DNA序列或與此序列進行雜交的一段DNA序列編碼。
植物能夠利用二氧化碳、水和無機鹽合成它們的細胞組分。
這一方法只能通過生物化學反應合成有機物。核苷酸，作為核酸的組分，必須在植物中從頭合成。
不僅嘌呤重新生物合成的酶反應，而且嘧啶重新生物合成的酶反應，對于調(diào)節(jié)核苷酸的代謝都具有重要作用，這些酶中的一種就是二氫乳清酸酶，它催化氨甲酰天冬氨酸脫水后閉環(huán)生成二氫乳清酸，緊接著的二氫乳清酸脫氫酶經(jīng)氧化還原作用將二氫乳清酸轉(zhuǎn)變成乳清酸，參見附


圖1。
從許多種生物中分離出了編碼二氫乳清酸酶的基因，完整的cDNA序列可以從細菌(Genebank Acc.No.M97254，惡臭假單胞菌，X84262，德氏乳桿菌，AE000207，埃希氏大腸桿菌，M97253，惡臭假單胞菌，P74438集胞藍細菌屬)中獲得。在真核生物中，二氫乳清酸酶是一種位于編碼序列的多功能酶復合體的一種組分(例如X03881黑尾果蠅)。在酵母中，二氫乳清酸酶也存在于一種多功能酶復合體上(Souciet等，Mol.Gen.Genet.207(2-3)，314-319(1987))。在植物中，二氫乳清酸酶不是多功能多肽的一種成分，但卻與在大腸桿菌中的情形相似，它是以一種單獨的酶存在。迄今為止，植物的二氫乳清酸酶只能從鼠耳芥(Genebank Acc.No.AF000146；Zhou等，植物生理學(Plant Physiol)114(1997)，1569)分離得到。
在轉(zhuǎn)基因植物中，通過反義技術使酶活性減小，由此證明此酶適合作為除草劑的靶蛋白。如果酶活性的減小導致生長受抑制，可以推斷這種活性被減小的酶是除草劑活性成分的作用位點。這一點已通過轉(zhuǎn)基因馬鈴薯乙酰乳酸合成酶的實施例來說明(Hofgen等，植物生理學(PlantPhysiology)107(1995)，469-477)。
本發(fā)明的目的是，證明植物中的二氫乳清酸酶是一種合適的除草劑的靶蛋白；分離出編碼植物二氫乳清酸酶的完整cDNA并在細菌和真核細胞中進行功能性的表達；產(chǎn)生一個有效而簡便的測試系統(tǒng)進行抑制劑-酶結(jié)合的研究。
我們發(fā)現(xiàn)此目標可通過以下操作完成分離出一個編碼植物二氫乳清酸酶的基因，產(chǎn)生二氫乳清酸酶的反義構建體，在細菌和真核細胞中功能性表達二氫乳清酸酶。
首先，本發(fā)明涉及如SEQ-ID NO1所示的DNA序列，它包含來自于馬鈴薯(potato)的植物二氫乳清酸酶的編碼區(qū)，參見實施例1和2。
本發(fā)明還涉及從SEQ-ID NO1衍生或能夠與此序列雜交的DNA序列，它能夠編碼一種具有二氫乳清酸酶生物活性的蛋白質(zhì)。
人們已經(jīng)對帶有一個二氫乳清酸酶反義構建體的ROSa系植物的特征作了詳細地描述。此系植物都顯示出了不同程度的生長延遲，其中植物系ROSa-40受到很大影響以至沒有塊莖形成，因此此系中的植物無法在溫室中存活，必須在體外進行培植?？梢园l(fā)現(xiàn)生長延遲和二氫乳清酸酶蛋白數(shù)量的減少之間具有相關性，二者之間的明確關聯(lián)無疑確定二氫乳清酸酶可作為除草劑活性成分的新靶蛋白，參見實施例3-7。
為了找到植物二氫乳清酸酶的有效的抑制劑，必須提供適當?shù)臏y試系統(tǒng)用于抑制劑-酶結(jié)合的研究。因此，將馬鈴薯二氫乳清酸酶的全cDNA序列克隆到一個表達載體(pQE，Qiagen)并在大腸桿菌中進行過表達，參見實施例8。
另外，含有SEQ-ID NO1的DNA序列表達序列盒可以在，例如，其它的細菌，在酵母，真菌，藻類，植物細胞，昆蟲細胞和哺乳動物細胞中被表達。
由本發(fā)明的表達序列盒所表達的二氫乳清酸酶蛋白，特別適合用于尋找二氫乳清酸酶-特異性的抑制劑。
為此，可以分別在被檢測的活性成分存在或不存在時對二氫乳清酸酶進行酶的測試，確定二氫乳清酸酶的活性，通過比較兩種條件下的酶活性，可以對被檢測的活性成分的抑制行為作出定性和定量的分析。
從Mazus和Buchowicz(Acta Biochimica Polonica(1968)，15(4)，317-325)的方法發(fā)展來的，迄今為止用于測定二氫乳清酸酶活性的酶測定方法，是基于在280nm下檢測二氫乳清酸-脫氫酶-耦合反應混合物中乳清酸的形成。這一檢驗方法不適于大量篩選，將這一方法修改為在340nm下檢測NADH的形成。做這個實驗，需要一種高活力的輔助酶，即二氫乳清酸脫氫酶。一種商品化的來自乳氰酸發(fā)酵桿菌的制備產(chǎn)品(Sigma)純度太差以至無法檢測到NADH的形成，為了能夠進行大量的篩選，特異性二氫乳清酸脫氫酶的活性必須至少比市售產(chǎn)品高十倍。這樣高的活性可以通過分離出植物二氫乳清酸脫氫酶并使之在酵母(釀酒酵母)中表達來獲得。這就是為什么測試系統(tǒng)是在耦合的植物二氫乳清酸酶和二氫乳清酸脫氫酶的基礎發(fā)展而來。為此，例如，分離出編碼鼠耳芥二氫乳清酸/脫氫酶的基因(參見Genebank Acc.No x62909，Minet等，Plant J.(1992)，2(3)，417-422；
本發(fā)明還涉及一種方法，用于鑒定具有除草活性的物質(zhì)，這種物質(zhì)能夠抑制植物的二氫乳清酸酶活性，方法包括以下步驟a)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的植物，植物組織或植物細胞，它們包含一段附加的DNA序列，這段序列編碼具有二氫乳清酸酶活性的酶并且能夠過表達有酶活力的二氫乳清酸酶；b)將一種物質(zhì)作用于轉(zhuǎn)基因的植物，植物細胞，植物組織或植物部分，以及作用于未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，植物細胞，植物組織或植物部分；c)確定轉(zhuǎn)基因的和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，植物細胞，植物組織或植物部分被應用了化學物質(zhì)后的生長和成活率；以及d)比較轉(zhuǎn)基因的和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，植物細胞，植物組織或植物部分被應用了化學物質(zhì)后的生長和成活率。
未轉(zhuǎn)化的植物，植物細胞，植物組織或植物部分的生長和成活率受抑制，而轉(zhuǎn)基因的植物，植物細胞，植物組織或植物部分的生長和成活率沒有受到抑制，這說明了b)中的物質(zhì)表現(xiàn)出除草的活性，抑制了植物的二氫乳清酸酶的活性。
本發(fā)明還涉及一種方法，用以去除不需要的植被，它包括用化合物處理植物，這種化合物能特異性與二氫乳清酸酶結(jié)合并且抑制它的功能，二氫乳清酸酶是由SEQ-ID NO1所示的DNA序列或與這段序列雜交的一段DNA序列編碼得到。
本發(fā)明還涉及具有除草活性的化合物，它們可以通過上文描述的檢測系統(tǒng)進行鑒定。
具有除草活性的二氫乳清酸酶抑制劑可以被用作脫葉劑，干燥劑，稻草殺劑，尤其是可用作雜草殺劑。雜草，從廣義上來講，是指生長在不被需要的地方的所有植物。根據(jù)本發(fā)明中的檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，活性成分是作為完全性的殺草劑還是作為選擇性的除草劑主要取決于所使用的數(shù)量。
例如，具有除草活性的二氫乳清酸酶抑制劑可以抗以下雜草雙子葉的雜草類白芥屬，獨行菜屬，豬殃殃屬，繁縷屬，母菊屬，春黃菊屬，牛膝菊屬，藜屬，蕁麻屬，千里光屬，莧屬，馬齒莧屬，蒼耳屬，旋花屬，番薯屬，琴屬，田菁屬，豚草屬，薊屬，飛廉屬，苦苣菜屬，茄屬，焊菜屬，節(jié)節(jié)菜屬，球梳霉屬，野芝麻屬，婆婆納屬，苘麻屬，Emex，曼陀羅屬，黃鼠狼花屬，罌粟屬，矢車菊屬，三葉草屬，毛莨屬，蒲公英屬。
單子葉的雜草類稗屬，狗尾草屬，黍?qū)?，馬唐屬，梯牧草屬，早熟禾屬，羊茅屬，蟋蟀草屬，臂刊草屬，黑麥草屬，雀麥屬，燕麥屬，莎草屬，蜀黍、高粱屬，冰草屬，絆根草屬，雨久花屬，飄拂草屬，慈茹屬，荸薺屬，莞草屬，雀稗屬，鴨嘴草屬，尖瓣花屬，龍爪茅屬，剪股穎屬，春麥娘屬，Apera。
本發(fā)明也涉及表達序列盒，它們的序列編碼一種多塊莖茄屬植物的二氫乳清酸酶或它的功能等同物。這段核酸序列可以是，如DNA或cDNA序列。
另外，本發(fā)明的表達序列盒中包含調(diào)節(jié)核酸序列，它們支配著宿主細胞的編碼序列的表達。根據(jù)優(yōu)選的實施方例，本發(fā)明的表達序列盒包括上游，即5′-端的編碼序列，一個啟動子和下游，即3′-端的聚腺苷酸化作用的信號，以及如果適當?shù)脑挘€包括位于它們之間的且與編碼序列如二氫乳清酸酶基因可操縱性地連接的其它調(diào)節(jié)元件，?？刹倏v性地連接的含義是指啟動子、編碼序列、終止子，以及如果適當?shù)脑?，其它的調(diào)節(jié)元件，按照一定的順序排列，以便在編碼序列進行表達時，每一個調(diào)節(jié)元件能夠各盡其能。
本發(fā)明的表達序列盒是通過適當?shù)膯幼优c適當?shù)亩淙榍逅崦窪NA序列和聚腺苷酸化作用的信號融合在一起得到的，采用的技術是常規(guī)的重組和克隆技術，例如見T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman and L.W.Enquist，基因融合實驗(Experiments with Gene Fusions)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)以及Ausubel，F(xiàn).M.等，分子生物學現(xiàn)行方法(Current Protocols in Molecular Biology)，GreenePublishing Assoc.And Wiley-Interscience(1987).
馬鈴薯與鼠耳芥兩種植物中二氫乳清酸酶的同源序列在蛋白質(zhì)水平上具有78％的同一性，該同源性利用程序BLASTP分析獲得(Altschul等，Nucleic Acids Res.(1997)25，3389-3402)，參見實施例2。
本發(fā)明也涉及功能等同的DNA序列，它編碼二氫乳清酸酶基因并且在整個基因的長度內(nèi)與SEQ-ID NO1所示序列顯示出40-100％的序列同一性。
本發(fā)明優(yōu)選的功能等同的DNA序列是編碼二氫乳清酸酶基因的，并在整個基因的長度內(nèi)與SEQ-ID NO1所示序列顯示出60-100％的序列同一性。
本發(fā)明更優(yōu)選的功能等同的DNA序列是編碼二氫乳清酸酶基因的，并在整個基因的長度內(nèi)與SEQ-ID NO1所示序列顯示出80-100％的同源性。
本發(fā)明中，雖然編碼二氫乳清酸酶基因的功能等同DNA序列的核苷酸序列發(fā)生了改變，但仍具有所需要的功能。因此功能等同序列包括了這里所述序列的自然發(fā)生的變異體，也包括合成的，如化學合成，根據(jù)植物中實際使用的特定密碼子進行改造得到的人造核苷酸序列。
功能等同序列也可以指，具體的來說，原始分離出的二氫乳清酸酶-編碼序列的自然或人工的突變體，它仍具有所需要的功能。突變作用包括取代、加入，刪除，交換或者插入一個或幾個核苷酸殘基。因此，舉例來說，本發(fā)明也包括對這個核苷酸序列修飾后得到的那些核苷酸序列。修飾的目的可以是如界定所包含的編碼序列，或者，插入更多的限制性酶切位點。
功能等同序列也可以是這樣的變異體，它們的功能比原始基因或基因片斷的功能更弱或更強。
另外，本發(fā)明的表達序列盒也可應用于轉(zhuǎn)化細菌，藍細菌，酵母，絲狀真菌和藻類，以生產(chǎn)出充足的二氫乳清酸酶。
本發(fā)明還涉及一種具有如SEQ-ID NO2所示的氨基酸序列的馬鈴薯蛋白質(zhì)，或者這個蛋白具有二氫乳清酸酶活性的衍生蛋白或部分蛋白。同鼠耳芥二氫乳清酸酶相比，在氨基酸水平上達到78％序列同一性。
本發(fā)明也涉及具有二氫乳清酸酶活性的植物蛋白質(zhì)，與馬鈴薯二氫乳清酸酶在氨基酸水平上達到20-100％序列同一性。
優(yōu)先的具有二氫乳清酸酶活性的植物蛋白，是那些與馬鈴薯二氫乳清酸酶在氨基酸水平上達到50-100％序列同一性的蛋白質(zhì)。
更優(yōu)選的具有二氫乳清酸酶活性的植物蛋白，是那些與馬鈴薯二氫乳清酸酶在氨基酸水平上達到80-100％序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個目的是在植物中過表達二氫乳清酸酶基因，以產(chǎn)生可以耐受二氫乳清酸酶抑制劑的植物。
在植物中過表達如SEQ-ID NO1所示的二氫乳清酸酶-編碼基因的序列可以導致對二氫乳清酸酶抑制劑的抗性增加。本發(fā)明也涉及由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
轉(zhuǎn)基因后被表達的二氫乳清酸酶基因的表達功效，可以通過芽分裂組織的繁殖或發(fā)芽試驗來測定。而且二氫乳清酸酶基因的表達類型和表達水平發(fā)生的變化，以及這一變化對二氫乳清酸酶抑制劑的抗性效應的影響，可以從溫室實驗中的實驗植物檢測出來。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物，它們是由本發(fā)明中具有SEQ-ID NO1序列的表達序列盒轉(zhuǎn)化得到，由于SEQ-ID NO1序列的附加的表達使得這些植物能夠耐受二氫乳清酸酶抑制劑的作用，本發(fā)明還涉及這種植物的轉(zhuǎn)基因的細胞，組織，部分以及繁殖材料。特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因作物有，如大麥，小麥，黑麥，玉米，大豆，水稻，棉花，甜菜，canola，向日葵，亞麻，大麻，馬鈴薯，煙草，西紅柿，油菜籽，紫花苜蓿，萵苣以及各種樹木，堅果，葡萄，豆類。
本發(fā)明還涉及這樣的植物，序列SEQ-ID NO1在植物中表達之后，顯示出UMP含量增加的植物。
為了本發(fā)明的目的增加尿嘧啶-5′-磷酸的含量，意味著通過與至少一代的非遺傳工程化的植物相比，植物的二氫乳清酸酶基因的功能性過表達所顯示出來的人為地獲得了的增加UMP生物合成的能力。
特別優(yōu)選的序列是那些能夠確保定向進入質(zhì)外體，質(zhì)體，液泡，線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的序列，或者那些，由于缺少適當?shù)牟倏v序列，能夠確保產(chǎn)物以隔離的形勢保留在胞液中的序列(Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)，285-423)。
例如，可以將植物的表達序列盒整合到煙草轉(zhuǎn)化載體pBinAR上(參見適用于本發(fā)明表達序列盒的啟動子，原則上，是任何能夠調(diào)控外源基因在植物中進行表達的啟動子。具體來說，優(yōu)先選用植物的啟動子或從植物病毒衍生的啟動子，特別優(yōu)選的是煙草花葉病毒CaMV 32S啟動子(Frank等，細胞21(1980)，285-294)。這個啟動子包含轉(zhuǎn)錄效應子的各種識別序列，轉(zhuǎn)錄效應子從整體上導致引入基因的永久表達和組成型表達(Benfey等，EMBO J.8(1989)，2195-2202)。
本發(fā)明的表達序列盒也可以包含一個化學誘導的啟動子，它能夠使得外源二氫乳清酸酶基因在植物中的表達被控制在一個特定的時間點。這樣的啟動子例如PRP1啟動子(Ward等，Plant.Mol.Biol.(1993)22，361-366)，水楊酸誘導的啟動子(WO 95/1919443)，苯磺酰胺誘導的啟動子(EP388186)，四環(huán)素誘導的啟動子(Gatz等，Plant J.(1992)2，397-404)，脫葉酸誘導的啟動子(EP 0335528)，乙醇或環(huán)己酮誘導的啟動子(WO93/21334)，在文獻中都有描述而且可以應用。
而且，特別優(yōu)選的啟動子，是那些能夠在進行嘌呤或其前體物生物合成的植物組織或部分，確保表達的啟動子，尤其是能夠確保葉片特異性表達的啟動子，如馬鈴薯胞液果糖二磷酸酶啟動子或馬鈴薯ST-LST啟動子(Stockhaus等，EMBO J.，(1989)8，2445-251[sic])。
利用種子特異性啟動子，外源蛋白可以在轉(zhuǎn)基因煙草的種子中穩(wěn)定的被表達，并且其含量占全部可溶性種子蛋白質(zhì)的0.67％(Fiedler and Conrad，Bio/Technology(1995)10，1090-1094)。因此本發(fā)明的表達序列盒可以包含一個種子特異性啟動子(優(yōu)選云扁豆蛋白啟動子，USP或LEB4啟動子)，LEB4信號肽，被表達的基因，以及一個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保持信號。
編碼二氫乳清酸酶的插入核苷酸序列可以通過合成產(chǎn)生，或者從天然獲得，或者由合成的或天然的DNA組分混合形成。通常，所生產(chǎn)的合成核苷酸序列含有植物中的優(yōu)勢密碼子，這類密碼子可以通過在大多數(shù)所研究的植物種類中具有最高表達頻率的蛋白質(zhì)所對應的密碼子來確定。
在準備表達序列盒時，為了獲得能夠以正確的方向方便閱讀并且配有一個正確的閱讀框的一段核苷酸序列，可以利用各種DNA片斷，為使DNA片斷彼此相連，可以將接合體或接頭接到片斷上。
其它適用的DNA序列可以是人工構建的DNA序列，如以上實例所描述的，只要它們能夠調(diào)節(jié)所需要的特性，即通過農(nóng)作物植物的二氫乳清酸酶基因的過表達來增加植物中UMP的含量。這樣的人工DNA序列，可以通過由分子模型構建的顯示二氫乳清酸酶活性的蛋白的反翻譯確定，或者通過體外篩選來確定。特別適用的序列是編碼DNA序列，它們是按實際使用的宿主-植物-特異性密碼子從多肽序列反翻譯得到的DNA序列。熟悉植物基因工程的技術人員可以很容易通過計算機評估其它的被轉(zhuǎn)化植物的已知基因，測定出實際使用的特定密碼子。
本發(fā)明的其它適用的等同核酸序列可以是編碼融合蛋白的序列，融合蛋白其中的一個組分是植物二氫乳清酸酶多肽，或者是二氫乳清酸酶多肽的一部分功能性等同體。融合蛋白的第二部分可以是其它具有酶活力的多肽，或是抗原多肽序列，借助它可以用來檢測二氫乳清酸酶的表達(如myc-tag或his-tag)。然而，它優(yōu)選為一個調(diào)節(jié)蛋白序列，如，信號肽或轉(zhuǎn)移肽，它們能夠?qū)⒍淙榍逅崦傅鞍滓龑е了枰淖饔梦稽c。
本發(fā)明的啟動子區(qū)和終止子區(qū)最好應該，沿著轉(zhuǎn)錄的方向，配備一個接頭或多接頭，接頭中包含一個或多個用于插入序列的限制性酶切位點。一般來說，接頭具有1-10，多數(shù)是1-8，最好是2-6個限制性位點。通常，調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)的接頭小于100bp，常見的是小于60bp，但是至少是5bp。本發(fā)明的啟動子可以是來自宿主，或與宿主同源的，也可以是外來的與宿主異源的啟動子。本發(fā)明的表達序列盒由，沿著5′-3′轉(zhuǎn)錄方向，本發(fā)明的啟動子，任一指示轉(zhuǎn)錄終止的序列和區(qū)域組成。各種終止區(qū)可以根據(jù)需要彼此進行交換。
可以通過操縱來提供適當?shù)南拗菩悦盖形稽c，或者除去多余的DNA或多余的限制性酶切位點。在適于進行插入、刪除、取代，包括轉(zhuǎn)換和顛換的情況下，也可以使用體外誘變，初始修復，限制性作用或連接作用。在使用如限制性作用、回嚼(chewing back)、或填補平末端的懸垂部分這些操縱作用時，可利用片斷的互補性末端來連接片斷。
優(yōu)選的聚腺苷酸化作用信號是植物聚腺苷酸化作用信號，尤其是那些實質(zhì)上與根癌土壤桿菌T-DNA聚腺苷酸化作用信號相一致的信號，具體包括Ti質(zhì)粒p TiACH5(Gielen等，EMBO J.3(1984)835 ff)中T-DNA(章魚肉堿合成酶)的基因3，或者它的功能等同基因。
為了以二氫乳清酸酶編碼DNA轉(zhuǎn)化宿主植物，本發(fā)明的表達序列盒采取如插入的方式整合到重組載體，載體DNA包含附加的功能調(diào)節(jié)信號，例如用來復制或整合的序列。適用的載體在“植物分子生物學和生物技術方法”(CRC Press)，Chapter 6/7，pp.71-119，一文中有描述。
將外來基因轉(zhuǎn)移到植物的基因組稱為轉(zhuǎn)化作用。利用上述的方法將用于暫時的或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化作用的植物組織和細胞進行轉(zhuǎn)化，并且再生出植株。適用的方法是通過聚乙二醇誘導的DNA吸收的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，，利用基因槍的生物彈射學法，電穿孔法，DNA溶液中的干胚胎誘導法，顯微注射法，以及土壤桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移法。以上方法的描述參見B.Jenes等，基因轉(zhuǎn)移技術(Techniques for Gene Transfer)in轉(zhuǎn)基因植物(TransgenicPlants)，Vol.1，工程和應用(Engineering and Utillization)，edited byS.D.Kung and R.Wu，Academic Press(1993)128-143，以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225).將被表達的構建體優(yōu)先克隆到適于轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌的載體，如pBin19中(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。
利用本發(fā)明表達序列盒轉(zhuǎn)化的土壤桿菌，同樣可以被用來去轉(zhuǎn)化植物，尤其是農(nóng)作物包括谷類，玉米，大豆，水稻，棉花，甜菜，canola，向日葵，亞麻，大麻，馬鈴薯，煙草，西紅柿，油菜籽，紫花苜蓿，萵苣，以及各種樹木，堅果，葡萄，豆類。轉(zhuǎn)化的方法是，如將受傷的葉片或葉片的一部分浸泡在土壤桿菌的懸浮液種，然后在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
嘧啶的合成部位一般是在葉片組織，所以二氫乳清酸酶的葉片-特異性表達很有用處。然而，很明顯嘧啶的生物合成不必被限制在葉片組織，而是以組織特異性的方式，可以在植物所有其它的部分發(fā)生，如在富含脂肪的種子里。
而且外源二氫乳清酸酶基因的組成型表達是有利的，另一方面，也需要誘導性表達。
利用上述的重組和克隆技術，本發(fā)明的表達序列盒可以被克隆到適當?shù)妮d體，并使它得到復制，如克隆到大腸桿菌。適用的克隆載體包括有pBR332，pUC系列，M13mp系列，和pACYC184。特別適用的載體是在大腸桿菌和土壤桿菌中都能夠進行復制的二元載體。
本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的表達序列盒來轉(zhuǎn)化植物，植物細胞，植物的組織或植物的一部分。本發(fā)明首選的目標是提高植物中的二氫乳清酸酶的含量。
根據(jù)啟動子的選擇不同，表達可以特異性發(fā)生在葉片，種子或植物的其它部位。這樣的轉(zhuǎn)基因植物，它們的繁殖材料以及它們的植物細胞、組織或部分也是本發(fā)明的研究主題。
利用下面實施例對本發(fā)明進行說明，但不限于此實施例應用實施例所依據(jù)的遺傳工程方法普通克隆方法克隆方法，舉例來說包括限制性酶切，瓊脂糖凝膠電泳，DNA片斷的純化，核酸轉(zhuǎn)移到硝化纖維和尼龍膜，連接DNA片斷，埃希氏大腸桿菌細胞的轉(zhuǎn)化，細菌培養(yǎng)，以及重組DNA的序列分析，這些方法可以按照Sambrook等的描述進行操作(Sambrook等(1994)Cold Spring Harbor LaboratoryPressISBN 0-87969-309-6)。
重組DNA的序列分析可以利用ABI激光熒光DNA序列分析儀按照Sanger等的方法對重組DNA分子進行測序(Sanger等，(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467)。由聚合酶鏈反應所得片斷要進行測序和校對，以避免在被表達的構建體中發(fā)生聚合酶錯誤。
實施例1編碼一種功能性的植物二氫乳清酸酶的cDNA的分離利用大腸桿菌突變體的功能互補作用，從馬鈴薯中獲得了編碼二氫乳清酸酶的一個克隆。所用的突變體是大腸桿菌遺傳保藏中心的突變株CGSC5152(CS101-2U5)，它在編碼二氫乳清酸酶的pyrC基因位點發(fā)生突變?；パa作用是通過用載體質(zhì)粒pBS SK-中的cDNA文庫對菌株CGSC5152的感受態(tài)細胞進行電轉(zhuǎn)化而實現(xiàn)。按照標準的程序，以間接的方式利用EcoRI/NotI接頭克隆出基本的lambda ZAPII文庫(Stratagene)，并從葉子(sink leave)中分離出cDNA的RNA模板(小1-cm-葉片來自生長于溫室中10周齡的馬鈴薯)。
將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞涂布在M9基本培養(yǎng)基中(Sambrook等，1989)，在培養(yǎng)基中補充了甲硫氨酸(20mg/l)，氨卞青霉素(100mg/l)，和異丙基硫代半乳糖苷IPTG(2.5mM)。總體上，在8批實驗中轉(zhuǎn)化了4μg的基因文庫，產(chǎn)生36個克隆，隨后利用限制性酶切進行檢測，證明這些克隆是一樣的。
實施例2編碼具有二氫乳清酸酶活性蛋白質(zhì)的cDNA克隆體的序列分析獲得的36個cDNA克隆體能夠編碼一種多肽，與其它生物的二氫乳清酸酶具有同源性，同源性分析利用程序BLASTP(Altschul等，Nucleic AcidsRes.(1997)25，3389-3402)進行。因此，此蛋白與鼠耳芥二氫乳清酸酶具有78％的同一性，與集胞藍細菌二氫乳清酸酶具有58％的同一性，與大腸桿菌和惡臭假單胞菌二氫乳清酸酶具有55％的同一性。其中最長的克隆體被命名為pyrCSt5，質(zhì)粒被命名為pBBSK-pyrCSt5。cDNA(參見SEQ-ID NO2)具有一個開放的閱讀框，它由1046個堿基對組成，一個終止密碼子位于1047-1049。氨基酸序列開始于閱讀框的第三個堿基，并能夠被翻譯成348氨基酸長度的多肽(參見SEQ-ID NO2)，這一長度與原核生物的二氫乳清酸酶-編碼序列的長度相符合。
由于本序列cDNA的閱讀框，不能確切的推斷cDNA是存在于質(zhì)體中，還是胞質(zhì)中。
實施例3植物表達序列盒的產(chǎn)生將一個35S CaMV啟動予以EcoRI-KpnI片斷的形式(對應于煙草花葉病毒核苷酸6909-7437(Franck等，Cell 21(1980)，285)插入到質(zhì)粒pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1980)，8711)。從Ti-質(zhì)粒pTiACH5(Gielen等，EMBOJ.3(1984)，838)分離出T-DNA的基因3的聚腺苷酸化作用信號成為PvuII-HindIII片斷，接上SphI接頭后，將其克隆到載體的位于SphI-HindIII酶切位點之間的PvuII酶切位點，這樣就得到質(zhì)粒pBinAR(Hofgen and Willmitzer，植物科學(Plant Science)66 19199010，221-230)。通過Asp718酶切位點(964bp的內(nèi)在酶切位點)和BamHI酶切位點(來自聚和接頭)將pyrCSt5構建體以反義方向克隆到pBinAR。
實施例4轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物的產(chǎn)生馬鈴薯植物(cv.solara)的轉(zhuǎn)化，是利用相應的構建體pBinAR-anti-pyrCSt5借助于根癌土壤桿菌進行的。先將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入根癌土壤桿菌C58C1pGV2260(Deblaere等，Nucl.Acids Res.13(1984)，4777-4788)。通過Pocha-Sosa等(EMBO J.，8(1998)，2-29)的方法轉(zhuǎn)化馬鈴薯，要使用1∶50在Murashige-Skong培養(yǎng)基(植物生理學，15(1962)，473)中過夜培養(yǎng)的陽性轉(zhuǎn)化的土壤桿菌克隆稀釋溶液。將無菌的植物小圓葉片(約1cm2)置于裝有1∶50的土壤桿菌的稀釋液培養(yǎng)皿中培養(yǎng)5-10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基，在黑暗中20℃培養(yǎng)2天之后，以16小時有光/8小時無光的光周期繼續(xù)培養(yǎng)。為了進行發(fā)芽誘導，每周一次將外植體轉(zhuǎn)換到補充有500mg/l claforan(頭孢噻肟-鈉)，50mg/l卡那霉素和植物激素(Rocha-Sosa等，EMBO J.，8，23-29，1989)，1.6g/l葡萄糖的MS培養(yǎng)基中。長出的發(fā)芽體轉(zhuǎn)換到補充有2％蔗糖，250mg/l claforan，細菌培養(yǎng)用瓊脂(Bacto-agar)的MS培養(yǎng)基中。
從補充卡那霉素和claforan的2MS培養(yǎng)基中得到生成的發(fā)芽體，生出根之后將其轉(zhuǎn)移到土壤中；在16小時有光/8小時無光的光周期，空氣濕度為50％的可調(diào)控的環(huán)境中培養(yǎng)2周后，對外源基因的表達，代謝物含量和表型生長特征的變化進行檢測。核苷酸含量的變化可以通過Stitt等方法來測定(FEBS Letters，145(1982)，217-222)。
實施例5植物組織全RNA的分析按照Logemann等，Anal.Biochem.163(1987)，21說明的方法分離植物組織的全RNA，為了進行分析，每次將20微克RNA在含有甲醛的1.5％的強化瓊脂凝膠中分離，再轉(zhuǎn)移到Duralon紫外膜上(Stratagene)。
為檢測特異性的轉(zhuǎn)錄，首先利用PCR技術按照操作說明制備用于雜交反應的digoxygenine-標記探針(DIG EasyHyb，Boehringer)；然后，將膜在60℃的洗滌緩沖液(2×SSC，0.1％SDS)中洗三次，每次20分鐘，利用以CDP-STAR為底物的Boehringer DIG檢測系統(tǒng)，通過暴露于Hyperfilm ECL(Amersham)上的膜的發(fā)光現(xiàn)象進行檢測。
附圖3顯示了測試的轉(zhuǎn)基因植物的RNA含量，其中包括ROSa系-34，-31，-10，-19，-9和-3。一條大小為1.6kb可識別的帶即是所要的二氫乳清酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而在ROSa-3，-9，31，-34中，具有大小為1.1kb的反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。尤其在ROSa-9中還發(fā)現(xiàn)RNA含量顯著減少。
實施例6塊莖和葉片組織中馬鈴薯二氫乳清酸酶的檢測為產(chǎn)生抗二氫乳清酸酶多肽的多克隆血清，需要從馬鈴薯二氫乳清酸酶氨基酸序列中篩選一個肽序列。將由商業(yè)公司(Eutogentec，Seraing，Belgium)合成的肽鏈LGTDSAPHDRRRKEC，通過C-末端的半胱氨酸與KLH(鎖眼帽貝蛋白)接合，用此共軛體免疫兔子就得到抗此肽鏈的抗血清，同樣由商業(yè)公司(Eutogentec)完成。在蛋白質(zhì)印跡實驗中，抗血清特異性地識別馬鈴薯多肽。為此，在變性條件下，將蛋白質(zhì)進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后利用免疫檢測方法按照操作說明(ECL-系統(tǒng)，Amersham)進行檢測。利用抗血清來鑒定ROSa系的轉(zhuǎn)基因植物，系-3，-9，-40的葉子中顯示出不同程度的蛋白質(zhì)減少，見附圖2。植株-40沒有形成塊莖，植株-30和-9的塊莖中也顯示出二氫乳清酸酶蛋白數(shù)量相應地大大減少。
實施例7轉(zhuǎn)基因植物的表型分析對攜帶一個二氫乳清酸酶反義構建體ROSa系植物的特征進行了詳細研究，表明植株都有不同程度的生長延遲。其中ROSa系-40受到較大影響以至沒有塊莖形成；這個系的植株在溫室中不能成活，必須在體外進行培植。可以發(fā)現(xiàn)生長延遲和二氫乳清酸酶蛋白數(shù)量減少之間具有相關性，這種明確的相關性無疑說明馬鈴薯二氫乳清酸酶可作為除草劑活性成分的新靶蛋白。
實施例8大腸桿菌的過表達載體的產(chǎn)生下列寡聚核苷酸序列是從已測定的序列衍生得到，它具有一個BamHI酶切位點和兩個懸垂的堿基。
5′-引物aaggatccGCAAAAATGGAGCTCTCA3′-引物aaggatccTCAGAGAGGAGCCGGCAACPCR反應混合物包含有8ng/μl pBSSk-pyrCSt5 DNA，0.5μM相應的寡聚核苷酸，200μM核苷酸(Pharmacia)，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3在25℃)，1.5mM MgCl2，和0.02U/μl Taq聚合酶(Perkin Elmer)。擴增條件如下變性溫度92℃，1分鐘解鏈溫度52℃，1分鐘延伸溫度72℃，2.5分鐘循環(huán)次數(shù)30PCR片斷通過BamHI酶切位點被克隆到過表達載體pQE9，經(jīng)IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導后，進行蛋白質(zhì)合成，IPTG誘導的方法為常規(guī)方法(參見HandbuchThe QiaExpressionist，Qiagen，Hilden)。
實施例9測定二氫乳清酸酶活性的檢測系統(tǒng)迄今用子測定二氫乳清酸酶活性的酶檢測方法，是從Mazus和Buchowicz(Acta Biochimica Polonica(1986)，15(4)，317-325)的方法發(fā)展而來，其根據(jù)是在280nm下，檢測二氫乳清酸-脫氫酶-耦聯(lián)反應混合物中乳清酸的形成。先決條件是具有一種高活性的輔助酶，即二氫乳清酸脫氫酶。商品化的來自于乳清酸發(fā)酵桿菌(Sigma)的此酶制備物已被證明含有較多的雜質(zhì)。
為了能夠進行大量的篩選，特異性的二氫乳清酸脫氫酶的活力必須比商品化的制備物的酶活力至少高10倍?？梢韵瓤寺≈参锏亩淙榍逅崦摎涿福怪诮湍?釀酒酵母)中進行表達，然后從肥厚脈胞菌(R.W.Miller，酶學方法LI，1978，63-69)中制備二氫乳清酸脫氫酶可以獲得這樣高的酶活力。對測試系統(tǒng)的進一步修正是在340nm下進行測定。
首先，分離鼠耳芥的二氫乳清酸脫氫酶(參見Genebank Acc No.X62909，Minet等，Plant J.(1992)，2(3)，417-422)。
下列寡聚核苷酸序列是從數(shù)據(jù)庫中記錄的二氫乳清酸脫氫酶序列衍生得到5′-引物aaggatccatggccggaagggctg3′-引物aaggatccttagtggtggtggtggtggtgtttgtgggatggggcPCR反應混合物包含10ng的質(zhì)粒DNA(得自載體pFL61(ATCC 77600)中的鼠耳芥cDNA)，，0.5microM[sic]相應的寡聚核苷酸，200μM核苷酸(Pharmacia)，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.3 在25℃)，1.5mM MgCl2，和0.02U/μl Taq聚合酶(Perkin Elmer)。擴增條件如下變性溫度92℃，0.5分鐘解鏈溫度60℃，0.5分鐘延伸溫度72℃，1.5分鐘循環(huán)次數(shù)35將獲得的PCR片斷首先經(jīng)BamHI酶切位點克隆到酵母表達載體pYES2(Invitrogen)，所產(chǎn)生的構建體命名為pYES2-pyrDAt。
實施例10從煙草中克隆植物二氫乳清酸脫氫酶如實施例9說明的PCR片斷被用于煙草噬菌體cDNA文庫的異源基因的篩選，用于產(chǎn)生煙草噬菌體cDNA文庫的cDNA來自于懸浮培養(yǎng)的煙草細胞的RNA，按照操作說明(Stratagene)制備此cDNA文庫。將具有煙草cDNA文庫的3.0×105個lambda噬菌體涂布于瓊脂平板上，瓊脂平板上的細菌菌株是大腸桿菌XLI-Blue。
根據(jù)標準方法(Sambrook等，(1989)，Cold Spring Harbor LaboratoryPressISBN 0＝87969-309-6)，將噬菌體DNA轉(zhuǎn)移并固定到尼龍濾膜(Duralon UV，Stratagene)上。所用的雜交探針是上述的PCR片斷，按照操作說明利用標記檢測系統(tǒng)(Boehringer，Mannheim)對它進行了DIG標記。在DIG EasyHyb(Boehringer)，42℃，膜的雜交反應進行16小時，然后在60℃用2×SSC，0.1％SDS洗滌濾膜三次，每次20分鐘。利用以CDP-Star為底物的Boehringer DIG檢測系統(tǒng)觀察發(fā)光現(xiàn)象，表明發(fā)生正雜交的噬菌體位于Hyoerfilm ECL(Amersham)上，利用標準技術對正雜交的噬菌體進行純化和分離。
對所得到的相同的克隆株，即克隆pyrDT10進行完全地測序(SEQ-IDNO3)。經(jīng)過EcoRI消化，得到一段1962個堿基對的EcoRI片斷，此片斷具有一個由458個氨基酸組成的開放閱讀框，起始密碼子位于305-307堿基，終止密碼子位于1679-1681堿基。從煙草二氫乳清酸脫氫酶推導出的氨基酸序列(SEQ-ID NO4)與鼠耳芥的氨基酸序列顯示出72％同一性，與大鼠的氨基酸序列顯示出51％同一性，與酵母的氨基酸序列顯示出43％同一性，與大腸桿菌的氨基酸序列顯示出37％同一性，采用程序BLASTP(Altschul等，Nucleic Acids Res.(1997)25，3389-3402)對同一性進行分析。
下列寡聚核苷酸序列是從已測定的序列衍生得到，它具有一個KpnI酶切位點和兩個懸垂的堿基5′-引物ggggtaccatgagacaaagggttggatt3′-引物ggggtaccttagtggtggtggtggtggtggagaggagccggcaaccaPCR反應混合物包含有5ng/μl pBSSk-pyrDT10 DNA，0.5μM相應的寡聚核苷酸，200μM核苷酸(Pharmacia)，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.3在25℃)，1.5mM MgCl2，和0.02U/μl Taq聚合酶(Perkin Elmer)。擴增條件如下變性溫度92℃，1分鐘解鏈溫度52℃，1分鐘延伸溫度72℃，2.5分鐘循環(huán)次數(shù)30將煙草二氫乳清酸脫氫酶的PCR片斷經(jīng)KpnI酶切位點克隆到酵母表達載體pYES2(Invitrogen)，再將此構建體(pYES-pyrDY10)和鼠耳芥二氫乳清酸脫氫酶的構建體pYES2-pyrDAt互補地插入到ural酵母變種(Miner等，Gene(1992)，121(2)，393-6)中。將所得到的酵母克隆體接種到含有半乳糖的液體完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
實施例11
植物二氫乳清酸酶和二氫乳清酸脫氫酶的分離及二氫乳清酸酶的活性測定利用French Press的壓力破碎法在20ml的加壓容器，最大壓力下，或借助玻璃球磨碎機(IMA Desintegrator)，對二氫乳清酸酶大腸桿菌表達培養(yǎng)物，以及含有煙草(或擬南芥屬)二氫乳清酸脫氫酶的酵母表達培養(yǎng)物分別進行破碎。每1g的細胞球，使用10ml的緩沖液(0.1M KH2PO4，；pH 7.5；0.4M蔗糖；0.1mM DTT)。在細胞球中加入2.5倍體積的玻璃珠(d＝0.5mm)，然后放置于玻璃球磨碎機里，4℃，2500rpm，20分鐘，使細胞球破碎；在4℃下，100,000g離心20分鐘；利用光度計(Uvikon 933，Kontron)在340nm下進行光度分析來測定酶活力。篩選過表達載體，可以使二氫乳清酸酶和二氫乳清酸脫氫酶得到純化，在自然條件下如果細胞破碎緩沖液中不含DTT(cf.Also HandbuchThe Qiaexpressionist，Qigen，Hilden)，利用組氨酸錨蛋白按照標準方法一步就可以完成。將洗出液透析到成分發(fā)生改換的緩沖液20mM的磷酸鉀緩沖液pH6.1；5mM MgCl2；1mMDTT；10mM半胱氨酸；10μM ZnCl2；20μM NAD。每次將所得到的10-100μl的酶片斷用緩沖液補加到700μl并進行測定，與之相對比的對照細胞包含700μl的反應緩沖液和100μl的未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)勻漿。加入7mM的氨甲酰天冬氨酸啟動反應。使用相同數(shù)量的總蛋白來測定未轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化大腸桿菌的抽提物。除了應用在酵母中被表達的植物二氫乳清酸脫氫酶活力之外，還可以應用從肥厚脈胞霉制備的二氫乳清酸脫氫酶活力，見R.W.Miller，二氫乳清酸脫氫酶活性，(in酶學方法(Methods inEnzymology)51(1978)，63-69)。
或者，可以利用Prescott和Jones的方法(Anal.Biochem.(1969)32，408-419)，通過敏感度較差的比色實驗來測定二氫乳清酸酶，不需要耦聯(lián)二氫乳清酸脫氫酶。為此，將二氫乳清酸酶在50mMTris-HCl，1mM二氫乳清酸中于37℃下進行反應，通過檢測氨甲酰天冬氨酸的形成測定二氫乳清酸酶的活性。先決條件是制備的蛋白質(zhì)具有較高的酶活力，這一點已經(jīng)在本通過所描述的測試系統(tǒng)測定的馬鈴薯二氫乳清酸酶的酶活力，可以使用已知的二氫乳清酸酶抑制子使之減少，如6-L硫代二氫乳清酸鹽，2-氧代-1，2，3，6-四氫嘧啶-4，6-二羧酸鹽(Christopherson等，生物化學社會學報(Biochemical Society Transactions)23888-893，1995)。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>植物二氫乳清酸酶<130>NAE953-99<140><141><160>4<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>1271<212>DNA<213>馬鈴薯<220><221>CDS<222>(9)..(1046)<400>1ttgcaaaa atg gag ctc tca atc aca caa cct gat gat tgg cat ctt cat 50Met Glu Leu Ser Ile Thr Gln Pro Asp Asp Trp His Leu His15 10ctc cgt gat ggt gat gtt ctt aag gca gtt gtc tct cac agt gca cat 98Leu Arg Asp Gly Asp Val Leu Lys Ala Val Val Ser His Ser Ala His15 20 25 30cac ttt ggg agg gca ata gtc atg cca aat ttg aag cct cct atc act 146His Phe Gly Arg Ala Ile Val Met Pro Asn Leu Lys Pro Pro Ile Thr35 4045acc act gct gct gct gta gca tac cgg gag gcg ata ttg aaa tct tta 194Thr Thr Ala Ala Ala Val Ala Tyr Arg Glu Ala Ile Leu Lys Ser Leu50 55 60cct gtt gat agt gat ttc aac cct ctt atg aca ctt tat ttg aca gat 242Pro Val Asp Ser Asp Phe Asn Pro Leu Met Thr Leu Tyr Leu Thr Asp65 70 75aca acc agt cct atg gaa atc aaa cta gca aga gag agc cag gtc gta 290Thr Thr Ser Pro Met Glu Ile Lys Leu Ala Arg Glu Ser Gln Val Val80 85 90ttt ggg gtg aag ttg tac cct gct ggt 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445Ile Ser Glu Ala Val Gly Ala Asp Cys Arg450 45權利要求
1.包含植物二氫乳清酸酶編碼區(qū)的一段DNA序列，其中這段DNA序列的核苷酸序列如SEQ-ID NO1所示。
2.一段DNA序列，它是與如權利要求1所述的DNA序列SEQ-ID NO1進行雜交的序列，或者是此序列的一部分，或者是通過插入、刪除和取代作用從此序列衍生得到的衍生體，而且編碼具有二氫乳清酸酶生物活性的蛋白。
3.具有二氫乳清酸酶活性的蛋白質(zhì)，它包含的氨基酸序列至少具有100個氨基酸且構成SEQ-ID NO2亞序列。
4.如權利要求3所述的蛋白質(zhì)，它包含的氨基酸序列是如SEQ-ID NO2所示序列的50-300亞序列。
5.如權利要求4所述的蛋白質(zhì)，它包含的氨基酸序列是如SEQ-ID NO2所示序列。
6.如權利要求1和2所述的DNA序列的應用，可將它們引入原核或真核細胞，這個序列可選擇性與調(diào)節(jié)元件連接以確保細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯得以進行，并且這個序列可以引起可轉(zhuǎn)錄mRNA的表達，進而合成二氫乳清酸酶。
7.如權利要求1和2所述的DNA序列的應用，產(chǎn)生一個測試系統(tǒng)用以鑒定除草活性的二氫乳清酸酶的抑制劑。
8.編碼二氫乳清酸酶的DNA序列SEQ-ID NO1和編碼二氫乳清酸脫氫酶的DNA序列SEQ-ID NO3的應用，產(chǎn)生一個測試系統(tǒng)用以鑒定除草活性的二氫乳清酸酶的抑制劑。
9.一種用于尋找抑制植物二氫乳清酸酶活性的物質(zhì)的方法，它包括第一步利用如權利要求1和2所述的DNA序列產(chǎn)生二氫乳清酸酶；第二步在檢測物質(zhì)存在時測定植物二氫乳清酸酶活性。
10.一種如權利要求9所述的方法，其中以高產(chǎn)量篩選(HTS)的方式進行植物二氫乳清酸酶的測定。
11.鑒定除草活性物質(zhì)的方法，這種物質(zhì)能夠抑制植物的二氫乳清酸酶活性，包括以下步驟a)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的植物，植物組織或植物細胞，它們包含一段附加的DNA序列，這段序列編碼具有二氫乳清酸酶活性的酶并且能夠過表達有酶活力的二氫乳清酸酶；b)將一種物質(zhì)作用于轉(zhuǎn)基因的植物，植物細胞，植物組織或植物部分，以及作用于未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，植物細胞，植物組織或植物部分；c)確定轉(zhuǎn)基因的和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，植物細胞，植物組織或植物部分被應用了該化學物質(zhì)后的生長和成活率；以及d)比較轉(zhuǎn)基因的和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物，植物細胞，植物組織或植物部分被應用了化學物質(zhì)后的生長和成活率。未轉(zhuǎn)化的植物，植物細胞，植物組織或植物部分的生長和成活率受抑制，而轉(zhuǎn)基因的植物，植物細胞，植物組織或植物部分的生長和成活率沒有受到顯著抑制，這說明了b)中的物質(zhì)表現(xiàn)出除草的活性，抑制了植物的二氫乳清酸酶的活性。
12.一種測試系統(tǒng)，它依據(jù)如權利要求1或2所述的DNA序列SEQ-IDNO1的表達，用于鑒定除草活性的二氫乳清酸酶的抑制劑。
13.一種測試系統(tǒng)，它依據(jù)DNA序列SEQ-ID NO1和DNA序列SEQ-IDNO3的表達，用于鑒定除草活性的二氫乳清酸酶的抑制劑。
14.如權利要求12和13所述的一種測試系統(tǒng)用于鑒定植物二氫乳清酸酶的抑制劑，它包括將酶與所研究的檢測物質(zhì)進行反應，經(jīng)過適當?shù)姆磻獣r間之后，測定此酶的酶活性，并且同未受抑制的酶的活性進行比較。
15.一種植物二氫乳清酸酶抑制劑。
16.一種植物二氫乳清酸抑制劑，利用如權利要求12，13和14所述的任一種測試系統(tǒng)進行鑒定。
17.如權利要求15或16所述的被鑒定的抑制劑，它可用作除草劑。
18.一種清除不需要的植被的方法，它包括用一種化合物處理要被清除的植物，此化合物特異性地與二氫乳氫酸酶結(jié)合并且抑制它的功能，其中二氫乳氫酸酶是由如權利要求1或2所述的DNA序列編碼。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠編碼具有二氫乳氫酸酶(EC 3.5.2.3)活性的多肽的DNA,而且,本發(fā)明涉及利用此核酸產(chǎn)生一個測試系統(tǒng)。
文檔編號C12N15/09GK1372596SQ00812547
公開日2002年10月2日 申請日期2000年9月2日 優(yōu)先權日1999年9月7日
發(fā)明者T·埃爾哈德特, J·萊爾希爾, M·施蒂特奈杰爾, R·瑞恩爾, M·施羅德 申請人:巴斯福股份公司