專利名稱：一種牛乳中過氧化物酶含量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析檢測乳中蛋白的方法，特別是一種檢測牛乳 中乳過氧化物酶含量的方法。屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，國內(nèi)沒有乳過氧化物酶含量的檢測方法的國家標準和行業(yè)標準。國內(nèi)相關(guān)標準有已作廢標準和GB/T15550-1995活化乳中乳過氧 化物酶體系保存生鮮牛乳實施規(guī)范。國外，相關(guān)標準有 DIN-10483-l-2002牛奶乳過氧化物酶活性測定.第l部分光度測量法 (參照法)、DIN-10483-2-2002牛奶乳過氧化物酶活性測定.第2部分 反射計法。常用乳過氧化物酶的檢測方法是酶標儀法。該方法雖步驟 簡單，但檢測到出結(jié)果時間較長，約2h。本專利發(fā)明了將使用毛細管 電泳儀快速檢測乳過氧化物酶含量的方法。毛細管電泳儀是一類包括電泳、色譜及其交叉內(nèi)容的液相微分離 技術(shù)。它能快速精確檢測出牛奶中的剩叚成分、抗生素、添加的功能 性因子、乳清蛋白、免疫球蛋白、酶、糖、添加劑和其他小分子的含 量。該方法操作簡便、準確，檢測到出結(jié)果時間僅為lh左右。目前，毛細管電泳儀的應(yīng)用前景非常廣泛。許多國際官方權(quán)威機構(gòu)，如FDA、 U. S.P、 CBER、 CDER等均已認可毛細管電泳方法。權(quán)威 機構(gòu)歐洲藥典中認可勒沃卡-貝斯庭鹽酸鹽中雜質(zhì)的CE測定；歐洲藥 典中還認可促紅細胞生成素(EP0)的毛細管電泳儀測定等。毛細管 電泳儀已成為化學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、生物工程、藥學(xué)等眾多領(lǐng)域的一個 常規(guī)科研工具。目前，國內(nèi)毛細管電泳儀檢測技術(shù)逐漸應(yīng)用到乳品領(lǐng)域里，如產(chǎn) 品開發(fā)和控制質(zhì)量問題等領(lǐng)域中。但毛細管電泳技術(shù)尚未開發(fā)檢測乳 過氧化物酶的方法。本發(fā)明成功彌補了乳品領(lǐng)域中的缺點，能準確測 定乳過氧化物酶的含量，從而有利于產(chǎn)品開發(fā)和質(zhì)量控制當中。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的 一種牛乳中乳過氧化物酶含量的才企測方法。 本發(fā)明的一種檢測乳過氧化物酶含量的檢測方法，其中，包括如 下步驟1)將乳過氧化物酶溶于樣品緩沖液，制備得到多個不同含 量乳過氧化物酶的標準溶液，并對多個溶液分別;f全測后得到乳過氧化 物酶含量與檢測結(jié)果之間的標準曲線；2)對樣品進行檢測，并得到 檢測結(jié)果；3)將所述的檢測結(jié)果與所述的標準曲線比對，得到樣品 中乳過氧化物酶的含量；其中，檢測樣品的設(shè)備是高壓毛細管電泳分 析儀。上述步驟l)中標準曲線的制定的方法如下配制乳過氧化物酶 標準溶液，在樣品緩沖液中溶解乳過氧化物酶標準物質(zhì)配制成分別為 lmg/ml 、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml,制備4尋到標準溶液，搖勻后使用高壓毛細管電泳分析，得到檢測結(jié)果，即得到乳過氧化物酶含量與平均校正因子的關(guān)系曲線；其中，所述的檢測結(jié) 果按照如下方法計算按峰面積計算出平均校正因子。上述的標準溶液或待檢測樣品的處理方法為把標準溶液或待檢 測樣品裝入離心管中，在2000-4000r/min離心條件下離心5-15min, 將樣品與緩沖液按照l: 4-10的比例加入凍存管，并搖勻，精確提取 40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機1 10min,使用 毛細管電泳4義測定。上述的樣品緩沖液為能夠使蛋白質(zhì)分散的緩沖液，優(yōu)選如下緩 沖液160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖液中加40 m mol/L 3-嗎啉代 丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，6 mol/L尿素，處理樣品時 添加5ul/ml的巰基乙醇,曱基羥乙基纖維素0. 5%, pH值為8. 5上述的搖勻步驟采用漩渦混合器。上述高壓毛細管電泳分析的使用4企測參數(shù)如下毛細管電泳檢測 檢測的溫度控制在30 4(TC之間，毛細管柱直徑50~75um、長度 20~ 600 mm, DAD (或紫外光)檢測器，壓力進樣(或電動進樣)，壓 力為0 lpsi，進樣時間為ls 20s,分離溫度為20~40°C,工作電 壓為15~30 kV。上述的毛細管柱為石英毛細管柱，包括涂層和未涂層。 上述的高壓毛細管電泳分析的檢測時電泳模式為區(qū)帶電泳，其電 泳緩沖液為pH3. 0~8. 0,主要成分為無機鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽、硼酸或檸檬酸。上述的檢測結(jié)果的處理方法如下檢測結(jié)果為樣品分離的圖譜， 運用毛細管電泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計算出試樣濃 度，再乘稀釋倍數(shù)，即得實際濃度。常乳里乳過氧化物酶的含量10mg ~ 30mg/L，質(zhì)量百分比為 0. 001%-0. 003%,其分子量為77500。毛細管電泳儀檢測最低濃度能達 到10-^10—8mol/L。所以毛細管電泳儀能檢測出其含量。使用毛細管 電泳儀開發(fā)檢測乳過氧化物酶含量的方法包括樣品性質(zhì)的了解、分離 模式、建立緩沖體系、優(yōu)化緩沖體系和換分離模式等步驟。開發(fā)出的 方法能應(yīng)用于產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量控制和分析4企測領(lǐng)域中。本發(fā)明主要使用毛細管電泳儀能準確測定乳過氧化物酶的含量， 從而應(yīng)用于產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量控制和分析檢測領(lǐng)域中。本發(fā)明在在傳統(tǒng)的電泳和色譜的原理的基礎(chǔ)上，使用高壓毛細管 電泳儀檢測乳過氧化物酶的含量，達到準確檢測出乳制品中乳過氧化 物酶的含量。通過試驗，最終確定檢測方法的最佳參數(shù)條件。具體如 下檢測乳過氧化物酶含量的檢測方法，包括樣品前處理、上樣檢 觀'J,還包括校準讀數(shù)等步驟。毛細管電泳檢測檢測的溫度控制在 20 40。C之間，毛細管柱直徑50~75um、長度50 600隱的石英 毛細管柱，DAD (或紫外光)檢測器，壓力進樣，壓力為0.5psi， 進樣時間為5s 10s，分離溫度為20~40°C,工作電壓為25 kV。校準曲線的制定配制乳過氧化物酶標準溶液濃度分別為2mg/ml、 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml。搖勻后使用 高壓毛細管電泳分析，按峰高計算出平均校正因子。 檢測步驟為把原料奶樣品裝入15ml的離心管中，在3000r/min離心條件下 離心10min。準確^是取樣品100ul置入凍存管。提取400ul樣品緩 沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用旋渦混合器混勻。精確提取 40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機3min，使用毛細 管電泳儀測定。樣品定量讀數(shù):根據(jù)樣品分離的圖譜，運用毛細管電泳儀所帶的 分析軟件，積分各峰高(或峰面積)，計算出試樣濃度，再乘稀釋倍 數(shù)，即得實際濃度。 有益效果本發(fā)明方法現(xiàn)行回歸方程相關(guān)系數(shù)〉0.98,其線性范圍在 0. Olmg/ml ~2mg/ml，最低檢出線為0. 15ng以上，最低4全出濃度為 0. 005mg/ml。精確度達90%以上，柱子回收率達到90%以上，樣品回 收率達70%以上。能有效檢測出樣品中的乳過氧化物酶的含量。
具體實施方式
實施例1 一種牛乳中乳過氧化物酶含量的^r測方法毛細管電泳溫度控制在40°C,使用直徑為50iim、長度為20 mm 的石英毛細管柱，DAD4企測器，進樣壓力為0. 5psi,進樣時間為10s， 工作電壓為25 kV。校準曲線的制定利用乳過氧化物酶標準品配制濃度分別為2mg/ml lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0-25mg/ral、 0. lmg/ml的才示準溶液。4吝 勻后使用高壓毛細管電泳分析，積分后的峰高分別為5782、 2741、 1451、 634、 220 ，利用軟件得出標準曲線，線性回歸相關(guān)系數(shù)為 0. 9992,最低4企出線為0. lug,最低檢出含量為0. 001mg/ml,標準 樣品回收率達91%。處理樣品緩沖液配置方法160 m mol/L三曱基氨基甲烷緩沖 液中加40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二 鈉，6mol/L尿素，處理樣品時添力。5ul/ml的3-巰基乙醇，曱基幾 乙基纖維素0. 5%, pH值為8. 5。電泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L檸檬酸，20 m mol/L檸檬 酸三鈉，7 mol/L尿素，羥丙基曱基纖維素0. 5%。檢測步驟為把奶樣品加入15ml的離心管中，在200r/min離 心條件下離心10min。準確提取樣品100ul置入凍存管(或其他容 器)。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用漩 渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲 波清洗機3min,之后使用毛細管電泳儀測定。樣品定量讀數(shù):根據(jù)樣品分離的圖語,運用毛細管電泳儀所帶的 分析軟件，積分乳過氧化物酶的峰高為7,利用分析軟件自動套入標 準曲線方程內(nèi)計算出試樣濃度為0. 0021mg/ml,再乘稀釋倍數(shù)5，即 得實際濃度為0. 0105mg/ml,所以該奶樣含有的乳過氧化物酶濃度 為0. 0105g/L。 實施例2 —種牛乳中乳過氧化物酶含量的檢測方法毛細管電泳溫度控制在25。C，使用直徑為75um、長度為600 mm 的石英毛細管柱，DAD檢測器，進樣壓力為0. 5psi,進樣時間為5s, 工作電壓為25 kV。校準曲線的制定利用乳過氧化物酶標準品配制濃度分別為 2mg/ml、 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml的標準溶液。 搖勻后使用高壓毛細管電泳分析，積分后的峰高分別為5982、 2790、 1370、 584、 268，利用軟件得出標準曲線，線性回歸相關(guān)系數(shù)為 0. 998，最低檢出線為0. 2ug,最低檢出含量為0. 001mg/ml，標準樣 品 回收率達90%。處理樣品緩沖液配置方法160 m mol/L三甲基氨基甲烷緩沖 液中加40 m mol/L 3-嗎啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6 mol/L尿素，處理樣品時添加5ul/ml的P-巰基乙醇，曱基羥乙基纖 維素0. 4%。使用0. 1M氫氧化鈉調(diào)至pH值為8. 5。電泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L檸檬酸，20 m mol/L檸檬 酸三鈉，6 mol/L尿素，鞋丙基曱基纖維素0. 4%。檢測步驟為把奶樣品加入15ml的離心管中，在4000r/min 離心條件下離心10min。準確提取樣品100ul置入凍存管(或其他 容器)。提取400ul樣品緩沖液加入凍存管(或其他容器)，并使用 漩渦混合器混勻。精確提取40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超 聲波清洗機3min，之后使用毛細管電泳儀測定。樣品定量讀數(shù):才艮據(jù)樣品分離的圖i普，運用毛細管電泳儀所帶的 分析軟件，積分乳過氧化物酶的峰高為11，利用分析軟件自動套入標準曲線方程內(nèi)計算出試樣濃度為0. 004mg/ml,再乘稀釋倍數(shù)5， 即得實際濃度為0. 02mg/ml，所以該奶樣含有的乳過氧化物酶濃度 為0. 02g/L。
權(quán)利要求
1.一種檢測乳過氧化物酶含量的檢測方法，其特征在于包括如下步驟1)將乳過氧化物酶溶于樣品緩沖液，制備得到多個不同含量乳過氧化物酶的標準溶液，并對多個溶液分別檢測后得到乳過氧化物酶含量與檢測結(jié)果之間的標準曲線；2)對樣品進行檢測，并得到檢測結(jié)果；3)將所述的檢測結(jié)果與所述的標準曲線比對，得到樣品中乳過氧化物酶的含量；其中，檢測樣品的設(shè)備是高壓毛細管電泳分析儀。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟l)中 標準曲線的制定的方法如下配制乳過氧化物酶標準溶液，在樣 品緩沖液中溶解乳過氧化物酶標準物質(zhì)配制成分別為lmg/ml 、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml，制備得到標準溶 液，搖勻后使用高壓毛細管電泳分析，得到檢測結(jié)果，即得到乳 過氧化物酶含量與平均校正因子的關(guān)系曲線；其中，所述的檢測 結(jié)果按照如下方法計算按峰面積計算出平均校正因子。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于所述的標準溶 液或待檢測樣品的處理方法為把標準溶液或待檢測樣品裝入離 心管中，在2000-4000r/min離心條件下離心5-15min，將樣品 與緩沖液按照1: 4-10的比例加入凍存管，并搖勻，精確提取 40ul處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機1 ~ 10min, 使用毛細管電泳yf義測定。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的檢測方法，其特征在于所述的樣品緩 沖液為能夠使蛋白質(zhì)分散的緩沖液，優(yōu)選如下緩沖液160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩沖液中加40 m mol/L 3-嗎啉代 丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，6mol/L尿素，處理樣 品時添加5ul/ml的3-巰基乙醇，曱基羥乙基纖維素0. 5%, pH 值為8.5。
5. 如權(quán)利要求2或3所述的檢測方法，其特征在于所述的搖勻步 驟釆用旋渦混合器。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于所述高壓毛細 管電泳分析的使用斥企測參數(shù)如下毛細管電泳4企測斥企測的溫度控 制在20 40。C之間，毛細管柱直徑50 75um、長度20 600 mm, DAD (或紫外光)檢測器，壓力進樣(或電動進樣)，壓力為0~ lpsi,進樣時間為ls 20s，分離溫度為20~40°C，工作電壓為 15-30 kV。
7. 如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于所述的毛細管柱為 石英毛細管柱，包括涂層和未涂層。
8. 如權(quán)利要求1或2所述的4全測方法，其特征在于所述的高壓毛 細管電泳分析的檢測時電泳模式為區(qū)帶電泳，其電泳緩沖液為 pH3. 0~8. 0，主要成分為無機鹽緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽、硼酸或 檸檬酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2中所述的檢測方法，其特征在于所述的檢測結(jié) 果的處理方法如下檢測結(jié)果為樣品分離的圖譜，運用毛細管電泳儀所帶的分析軟件，積分各峰的面積，計算出試樣濃度，再乘稀 釋倍數(shù)，即得實際濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測乳中成分的方法，特別是一種檢測乳過氧化物酶含量的檢測方法。屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明毛細管電泳儀檢測乳過氧化物酶含量的檢測方法，包括樣品前處理、上樣檢測，還包括校準讀數(shù)，編輯報告等步驟。本發(fā)明是樣品在毛細管電泳儀上跑電泳，從而毛細管色譜系統(tǒng)檢測出樣品的吸光值，以圖譜的形式表達出來，從而能準確檢測出乳過氧化物酶的含量，為產(chǎn)品研發(fā)、質(zhì)量控制和分析成分提供技術(shù)支持。
文檔編號C12Q1/28GK101256168SQ200810093699
公開日2008年9月3日 申請日期2008年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者劉衛(wèi)星, 孫國慶, 康小紅, 胡新宇 申請人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司