一種猴頭菌片的質(zhì)量檢測方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種猴頭菌片的質(zhì)量檢測方法，該方法包括(1)制備混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、(2)制備供試品溶液、(3)色譜條件、(4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸計算、(5)測定供試品溶液。還提供了根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法所檢測得到的猴頭菌片劑。本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法可以有效地全面監(jiān)控猴頭菌片的質(zhì)量，監(jiān)控生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，從而保障產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定、均勻、可控，還可用于鑒定偽造產(chǎn)品，以保證該品種藥物的正常生產(chǎn)和流通秩序。
【專利說明】
-種猴頭菌片的質(zhì)量檢測方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種藥物的檢測方法，具體設(shè)及一種猴頭菌片的質(zhì)量檢測方法及其產(chǎn) 品。
【背景技術(shù)】
[0002] 猴頭菌片是猴頭菌菌絲體水提物制成的片劑，其具有益氣補(bǔ)血、扶正培本、養(yǎng)胃護(hù) 胃的作用，臨床上常用于治療胃潰瘍、十二指腸潰瘍及慢性胃炎等，對多種消化道疾病均有 較好的療效。猴頭菌片含多糖、多膚類、核巧酸類、氨基酸等成分，具有免疫調(diào)節(jié)，保護(hù)胃腸 道等作用。
[0003] 猴頭菌片的現(xiàn)有質(zhì)量控制方法有分光光度法測定蛋白多糖含量、高效液相色譜法 測定腺巧含量，而沒有一種能全面表征猴頭菌片質(zhì)量的方法。還有一些文獻(xiàn)提及了使用 HPLC對猴頭菌片劑中的腺巧含量進(jìn)行檢測的方法，或者對猴頭菌本身的某些成分進(jìn)行鑒定 和檢測的方法等等，但是運些方法也未能全面準(zhǔn)確地表征猴頭菌藥物的質(zhì)量，其中的一些 方法甚至不能檢測到猴頭菌通常含有的有效成分，反而不利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
[0004] 因此，為了規(guī)范猴頭菌片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，解決猴頭菌片質(zhì)量參差不齊的問題，對猴頭 菌片的質(zhì)量控制方法有待于進(jìn)一步研究和改善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，提供了一種利用猴頭菌片的指紋 圖譜從宏觀上、整體上較為全面地檢測猴頭菌片的質(zhì)量的方法，還提供了該質(zhì)量檢測方法 的應(yīng)用。
[0006] 猴頭菌片的現(xiàn)有質(zhì)量控制方法為分光光度法測定蛋白多糖的含量和高效液相色 譜法測定腺巧的含量。然而，猴頭菌片是W整體為活性物質(zhì)，因此單靠測定一種或幾種有效 成分考查猴頭菌片的穩(wěn)定性是不夠的，不能解決其成分復(fù)雜、產(chǎn)品批次間質(zhì)量差異的問題， 而本發(fā)明建立的猴頭菌片的HPlX指紋圖譜的質(zhì)量控制方法則解決了運些不足。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種猴頭菌片的質(zhì)量檢測方法，該方法的特點在 于采用了高效液相色譜法，其具體包括W下步驟：
[000引（1)制備混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：
[0009] 精密稱取適量胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧和鳥巧對照品，加水配制成每ImL含胞巧1 ~20yg、腺嚷嶺1~20yg、尿巧20~40yg、腺巧20~40yg、鳥巧1~20yg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。可 W優(yōu)選為每1血含胞巧5~化g、腺嚷嶺3~化g、尿巧25~35蛇、腺巧25~35蛇、鳥巧2~化邑的 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0010] (2)制備供試品溶液：
[0011] 取猴頭菌片，去包衣，研細(xì)，精密稱取，置于具塞錐形瓶中，加水，密塞，稱定重量， 超聲提取，放冷，再稱重量，用水補(bǔ)足減失的重量，離屯、，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。 [001^ (3)色譜條件：
[001 ；3] WCi8色譜柱，W甲醇-體積百分比0.08~0.30 % (下文中W % VOI %表示)憐酸水溶 液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫：21~30°C，紫外檢測波長：220~280nm，流速：0.40~ 1.20mL ? min-i，洗脫時間：50~lOOmin。
[0014] (4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸計算：
[0015] 取所述的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣2、5、10、15、20、2扣L，注入高效液相色譜儀， 按照步驟(3)的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定3次，記錄色譜峰，W進(jìn)樣量X(iig)為橫坐標(biāo)，峰面積 平均值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計算，分別得到胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧和鳥 巧的線性關(guān)系。
[0016] (5)測定供試品溶液：
[0017] 精密吸取所述供試品溶液注入高效液相色譜儀，按照步驟(3)的色譜條件得到指 紋圖譜，記錄峰面積，并按照步驟(4)得到的各線性關(guān)系計算胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧和鳥 巧的平均含量。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法，其中，所述方法還包括：
[0019] (6)按照與步驟（1)~（5)相同的方法測定10批猴頭菌片的指紋圖譜，然后使用相 似度評價系統(tǒng)對所得10批猴頭菌片的指紋圖譜進(jìn)行分析，得到猴頭菌片的共有模式圖譜， W及運10批猴頭菌片的指紋圖譜與共有模式圖譜的相似度。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法，其中，所述方法還包括：
[0021] (7)按照與步驟（1)~(5)相同的方法測定任意批次的猴頭菌片的胞巧、腺嚷嶺、尿 巧、腺巧和鳥巧的含量;和/或
[0022] (8)按照與步驟（1)~（5)相同的方法測定任意批次的猴頭菌片的指紋圖譜，并使 用相似度評價系統(tǒng)計算其與步驟(6)的共有模式圖譜的相似度。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法，其中，在步驟（1)中，精密稱取適量胞巧、腺嚷嶺、尿 巧、腺巧和鳥巧對照品，分別加水配制為每ImL含168 .SOiig胞巧、57.50yg腺嚷嶺、199.2化g 尿巧、198.0化g腺巧、51.60]ig鳥巧的五份溶液，然后從運五份溶液中分別取適量并混合，加 水配制為每1血含胞巧6.75蛇、腺嚷嶺4.60蛇、尿巧31.8化g、腺巧31.6祉g、鳥巧4.13iig的混 合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法，其中，所述步驟(2)可W優(yōu)選為:取猴頭菌片10片，去 包衣，研細(xì)，精密稱取0.25~1.50g，置于具塞錐形瓶中，精密加入20mL水，密塞，稱定重量， 超聲提取20~60min，放冷，再稱重量，用水補(bǔ)足減失的重量，離屯、，濾過，取續(xù)濾液，即得供 試品溶液。優(yōu)選地，精密稱取0.5g，超聲提取30min。更優(yōu)選地，400化? mirfi離屯、，0.22WI1濾 膜濾過。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法，其中，所述步驟(3)可W優(yōu)選為：WCis色譜柱，W甲 醇-0.1%vol%憐酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫:26°C，紫外檢測波長:260nm，流 速:0.5mL ? min-i，洗脫時間：60min。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法，其中，步驟(3)中的梯度洗脫條件為:0分鐘時，流動 相A為占流動相總體積0 %的甲醇、流動相B為占流動相總體積100 %的0.1 % VOl %憐酸水溶 液;25分鐘時，流動相A為占流動相總體積0.2 %的甲醇、流動相B為占流動相總體積99.8% 的0.1 % VOl %憐酸水溶液;30分鐘時，流動相A為占流動相總體積0.5%的甲醇、流動相B為 占流動相總體積99.5 %的0.1 % VOl %憐酸水溶液;35分鐘時，流動相A為占流動相總體積 3.5 %的甲醇、流動相B為占流動相總體積96.5 %的O. I % VOl %憐酸水溶液;45分鐘時，流動 相A為占流動相總體積3.8%的甲醇、流動相B為占流動相總體積96.2%的0.1 % VOl %憐酸 水溶液;60分鐘時，流動相A為占流動相總體積4.2 %的甲醇、流動相B為占流動相總體積 95.8%的0.1% VO1%憐酸水溶液。
[0027]梯度洗脫條件具體如下表所示：
[009?1
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法，其中，步驟(4)中的回歸計算的結(jié)果為:胞巧的回歸 方程為Y = 3621.9X+0.6092，r為0.9999，線性范圍為0.0 l~0.17iig;腺嚷嶺的回歸方程為Y =11776X-2.3814，r為0.9999，線性范圍為0.0 l~0.1;尿巧的回歸方程為Y = 5862.9x+ 5.3668，r為0.9999，線性范圍為0.06~0.80yg;腺巧的回歸方程為Y = 6191. lx+6.2911，r為 0.9999，線性范圍為0.06~0. SOiig;鳥巧的回歸方程為Y = 4327.6x+0.7886，r為0.9999，線 性范圍為0.01~O.lOyg。
[0030] 該回歸計算的結(jié)果具體如下表所示：
[0031]
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法，其中，所述共有模式圖譜中有16個特征共有峰，其中 2號峰為胞巧、8號峰為腺嚷嶺、9號峰為尿巧、12號峰為腺巧、13號峰為鳥巧;優(yōu)選地，其中9 號峰為參照峰，也是最強(qiáng)色譜峰;更優(yōu)選地，所述共有模式圖譜的總長度為60min，其中單峰 面積超過總峰面積1 %的峰有10個，它們是1~16號峰，單峰面積超過總峰面積5 %的峰有6 個，它們是5號峰、7號峰、8號峰、9號峰、12號峰、15號峰，單峰面積超過總峰面積15 %的有2 個，它們是9號峰和12號峰，單峰面積超過總峰面積25%的有1個，它是9號峰;進(jìn)一步優(yōu)選 地，所述16個特征共有峰具體如下，
[0033] 1號峰的平均保留時間RT為10.46min，RSD為0.33 %，峰面積為125.982, RSD為 35.38%;
[0034] 2號峰的平均保留時間RT為12.04min，RSD為0.38 %，峰面積為198.013, RSD為 41.68%;
[0035] 3號峰的平均保留時間RT為12.09min，RSD為0.24 %，峰面積為88.825, RSD為 70.37%;
[0036] 4號峰的平均保留時間RT為12.62min，RSD為0.15%，峰面積為257.720，RSD為 59.50%;
[0037] 5號峰的平均保留時間RT為13.09min，RSD為0.34 %，峰面積為625.366, RSD為 42.44% ；
[003引 6號峰的平均保留時間RT為15.51min，RSD為0.32 %，峰面積為102.070, RSD為 51.89%;
[0039] 7號峰的平均保留時間RT為17.19min，RSD為0.31 %，峰面積為353.710，RSD為 60.76%;
[0040] 8號峰的平均保留時間RT為18.31min，RSD為0.61 %，峰面積為675.391，RSD為 27.70%;
[0041 ] 9號峰的平均保留時間RT為23.26min，RSD為0.39 %，峰面積為1959.539, RSD為 46.88%;
[0042] 10號峰的平均保留時間RT為24.96min，RSD為0.49 %，峰面積為178.417, RSD為 25.76%;
[0043] 11號峰的平均保留時間RT為27.29min，RSD為0.26%，峰面積為141.349，RSD為 27.14%;
[0044] 12號峰的平均保留時間RT為34.36min，RSD為0.50%，峰面積為1170.988，RSD為 26.76%;
[0045] 13號峰的平均保留時間RT為43.95min，RSD為0.37 %，峰面積為282.908，RSD為 87.40%;
[0046] 14號峰的平均保留時間RT為45.09min，RSD為0.40 %，峰面積為194.799, RSD為 64.99%;
[0047] 15號峰的平均保留時間RT為46.49min，RSD為0.41%，峰面積為501.655，RSD為 33.:34%;
[004引 16號峰的平均保留時間RT為48.19min，RSD為0.44%，峰面積為237.035，RSD為 36.89%。
[0049] 本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法所檢測得到的猴頭菌片劑。
[0050] 需說明的是，在本發(fā)明構(gòu)思的前提下對色譜條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化或改進(jìn)的技術(shù)方 案均屬于本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容。
[0051] 本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法相對于現(xiàn)有技術(shù)可W獲得如下有益效果：
[0052] 1、本發(fā)明的檢測方法不僅構(gòu)建了猴頭菌片的指紋圖譜技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及共有模式圖譜， 還能檢測猴頭菌片中胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧和鳥巧等有效成分的含量，可W有效地全面 監(jiān)控猴頭菌片的質(zhì)量，監(jiān)控生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，從而保障產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定、均勻、可控。另 夕h該質(zhì)量檢測方法可用于鑒定偽造產(chǎn)品，W保證該品種藥物的正常生產(chǎn)和流通秩序。
[0053] 2、在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可W開展指紋圖譜、有效成分與功效活性的相關(guān)性研究，從 而有助于闡明內(nèi)在化學(xué)成分的功效作用。
[0054] 3、本發(fā)明的方法還具有良好的可行性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。
【附圖說明】
[0055] W下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中：
[0056] 圖1為本發(fā)明實施例1得到的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(A)和供試品溶液(B)的色譜圖；
[0057] 圖2為本發(fā)明實施例2得到的10批猴頭菌片的HPLC圖譜和共有模式圖譜。其中R為 共有模式圖譜。
【具體實施方式】
[0058] 下面通過具體的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，運些實施例僅僅是 用于更詳細(xì)具體地說明之用，而不應(yīng)理解為用于W任何形式限制本發(fā)明。
[0059] 本部分對本發(fā)明試驗中所使用到的材料W及試驗方法進(jìn)行一般性的描述。雖然為 實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡 可能詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在上下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料和操 作方法是本領(lǐng)域公知的。
[0060] W下實施例中設(shè)及的儀器與試劑為：
[0061 ] 儀器:Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司）、色譜柱為ZORBAX SB-Aq (5皿,4.6X250mm)柱、CP225D十萬分之一電子天平（Sartoiyus公司）、BT214D萬分之一電子 天平（Sarto巧US公司KSB25-12DTD超聲波清洗器(寧波新芝生物科技有限公司）及錐形瓶、 漏斗、濾紙等。
[0062]試劑：甲醇(色譜純，美國Tedia公司），水為高純水，其余試劑均為分析純。胞巧(批 號100914316,美國SIGMA公司）、腺嚷嶺(批號110886-200001，中國藥品生物制品檢定所）、 尿巧(批號1001157075,中國藥品生物制品檢定所）、腺巧(批號110879-201202,中國藥品生 物制品檢定所）、鳥巧(批號106K1848,美國SIGMA公司）。猴頭菌片(長春迪瑞制藥有限公司， 批號：140401，141001;上海華源安徽仁濟(jì)制藥有限公司，批號：140701，140528;上海雷允上 藥業(yè)有限公司，140213;湖北襄陽隆中藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：140501，140325;廣州白云 山和記黃捕中藥有限公司，批號：140325，140408，140522，140528，150322)。
[006；3] 實施例1
[0064] 本實施例用于說明本發(fā)明提供的猴頭菌片的質(zhì)量檢測方法。
[0065] 采用本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法對1批猴頭菌片的進(jìn)行如下步驟的檢測，可W得到該 批猴頭菌片的指紋圖譜及其胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧和鳥巧的含量。
[0066] (1)制備混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：
[0067] 精密稱取適量胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧和鳥巧對照品，分別加水配制為每ImL含 168. SOiig胞巧、57.50yg腺嚷嶺、199.20yg尿巧、198. OOiig腺巧、51.60yg鳥巧的五份溶液，然 后從運五份溶液中分別取適量并混合，W得到每ImL含胞巧6.75yg、腺嚷嶺4.60yg、尿巧 31.8化g、腺巧31.6祉g、鳥巧4.13iig的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0068] 基于本發(fā)明提供的技術(shù)方案，混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧和鳥 巧的濃度可W分別在一定范圍內(nèi)選擇。合適的范圍可W為每ImL含胞巧1~20iig、腺嚷嶺1~ 2化g、尿巧20~40]ig、腺巧20~40]ig、鳥巧1~20]ig;可W優(yōu)選為每1血含胞巧5~化g、腺嚷嶺 3~化g、尿巧25~35iig、腺巧25~35iig、鳥巧2~化g。本實施例所采用的濃度僅為優(yōu)選的實 施方式。
[0069] (2)制備供試品溶液：
[0070] 取猴頭菌片（批號：140325,廣州白云山和記黃捕中藥有限公司HO片，去包衣，研 細(xì)，精密稱取0.5g，置于50mL具塞錐形瓶中，精密加入20mL水，密塞，稱定重量，超聲提取 30min，放冷，再稱重量，用水補(bǔ)足減失的重量，400化? mirTi離屯、，0.22]im濾膜濾過，取續(xù)濾 液，得到供試品溶液。
[0071] 基于本發(fā)明提供的技術(shù)方案，合適的精密稱取的質(zhì)量范圍可W是0.25~1.50g，超 聲提取的時間范圍可W是20~60min。本實施例所采用的條件僅為優(yōu)選的實施方式。
[0072] (3)色譜條件：
[0073] 采用的Cis色譜柱為ZORBAX SB-Aq柱(4.6 X 250mm，5皿），W 甲醇-0.1 % VOl % 的憐 酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫:26°C，紫外檢測波長:260nm，流速:0.5mL ? mirTi，洗 脫時間：60min，具體梯度洗脫的條件如下表1:
[0074] 表1梯度洗脫條件
[0076] 梯度洗脫條件也可W表述為：
[0077] 0分鐘時，流動相A為流動相總體積0 %的甲醇、流動相B為流動相總體積100 %的 0.1 % VOl %憐酸水溶液；
[0078] 25分鐘時，流動相A為流動相總體積0.2 %的甲醇、流動相B為流動相總體積99.8 % 的0.1 % VOl %憐酸水溶液；
[0079] 30分鐘時，流動相A為流動相總體積0.5 %的甲醇、流動相B為流動相總體積99.5 % 的0.1 % VOl %憐酸水溶液；
[0080] 35分鐘時，流動相A為流動相總體積3.5 %的甲醇、流動相B為流動相總體積96.5 % 的0.1 % VOl %憐酸水溶液；
[0081 ] 45分鐘時，流動相A為流動相總體積3.8 %的甲醇、流動相B為流動相總體積96.2 % 的0.1 % VOl %憐酸水溶液；
[0082] 60分鐘時，流動相A為流動相總體積4.2 %的甲醇、流動相B為流動相總體積95.8% 的0.1 % VOl %憐酸水溶液。
[0083] 基于本發(fā)明提供的技術(shù)方案，憐酸水溶液的濃度可W為0.08~0.30%vol%，柱溫 可W為21~30°C，紫外檢測波長可W為220~280皿，流速可W為0.40~1.20mL ? min-i，洗脫 時間可W為50~lOOmin。本實施例所采用的條件僅為優(yōu)選的實施方式。
[0084] (4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸計算：
[00化]取步驟（1)的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣2、5、10、15、20、2化L注入高效液相色譜 儀，按照步驟(3)的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定3次，記錄色譜峰(見圖1，其中A為混合標(biāo)準(zhǔn)品溶 液的色譜圖），W進(jìn)樣量X(iig)為橫坐標(biāo)，峰面積平均值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回 歸計算，從而分別得到胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧和鳥巧的線性關(guān)系。計算結(jié)果如下表2: [0086]表2胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧、鳥巧五種成分的線性關(guān)系
[0OR71
[0088] (5)測定供試品溶液：
[0089] 精密吸取步驟(2)的供試品溶液注入高效液相色譜儀，按照步驟(3)的色譜條件得 到指紋圖譜(見圖1，其中B為供試品溶液的色譜圖），記錄峰面積，并按照步驟(4)得到的各 線性關(guān)系計算胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧和鳥巧的平均含量。
[0090] 其中的2號峰為胞巧、8號峰為腺嚷嶺、9號峰為尿巧、12號峰為腺巧、13號峰為鳥 巧。經(jīng)測定，作為供試品的每片猴頭菌片中胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧、鳥巧的平均含量分別 為 27.2f5]ig、28.78]ig、166.6 化g、94.06]ig、32.60]ig。
[0091] 實施例2
[0092] 本實施例用于說明本發(fā)明提供的猴頭菌片的質(zhì)量檢測方法。
[0093] 本實施例在實施例1的基礎(chǔ)上進(jìn)一步說明通過本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法可W測定猴 頭菌片的指紋圖譜與共有模式圖譜的相似度。
[0094] (6)按照與實施例1的步驟（1)~巧)相同的方法測定10批猴頭菌片的指紋圖譜，然 后使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對得到的10批猴頭菌片的指紋圖譜進(jìn)行分析，得 到猴頭菌片的共有模式圖譜(請見圖2,其中R為共有模式圖譜，Sl至SlO分別為10批猴頭菌 片的指紋圖譜），W及運10批猴頭菌片的指紋圖譜與共有模式圖譜的相似度(結(jié)果見表3)， 相似度均大于0.90。
[0095] 表3猴頭菌片HPlX指紋圖譜相似度評價
[0096]
[0097] 注:Sl批號140401，S2批號141001，為長春迪瑞制藥有限公司的猴頭菌片；
[0098] S3批號140701，S4批號140528,為上海華源安徽仁濟(jì)制藥有限公司的猴頭菌片；
[0099] S5批號140213,為上海雷允上藥業(yè)有限公司的猴頭菌片；
[0100] S6批號140501，S7批號140325,為湖北襄陽隆中藥業(yè)集團(tuán)有限公司；
[0101] S8批號140408，S9批號140522, SlO批號140528,為廣州白云山和記黃捕中藥有限 公司的猴頭菌片。
[0102] 步驟(6)的共有模式圖譜中有16個特征共有峰，其中2號峰為胞巧、8號峰為腺嚷 嶺、9號峰為尿巧、12號峰為腺巧、13號峰為鳥巧，其中的9號峰為參照峰，也是最強(qiáng)色譜峰。
[0103] 共有模式圖譜的總長度為60min，其中單峰面積超過總峰面積1%的峰有10個，它 們是1~16號峰，單峰面積超過總峰面積5%的峰有6個，它們是5號峰、7號峰、8號峰、9號峰、 12號峰、15號峰，單峰面積超過總峰面積15 %的有2個，它們是9號峰和12號峰，單峰面積超 過總峰面積25 %的有1個，它是9號峰。
[0104] 上述16個特征共有峰具體如下，
[0105] 1號峰的平均保留時間RT為10.46min，RSD為0.33 %，峰面積為125.982, RSD為 35.38%;
[0106] 2號峰的平均保留時間RT為12.04min，RSD為0.38 %，峰面積為198.013, RSD為 41.68%;
[0107] 3號峰的平均保留時間RT為12.09min，RSD為0.24 %，峰面積為88.825, RSD為 70.37%;
[010引 4號峰的平均保留時間RT為12.62min，RSD為0.15%，峰面積為257.720，RSD為 59.50%;
[0109] 5號峰的平均保留時間RT為13.09min，RSD為0.34%，峰面積為625.366，RSD為 42.44%；
[0110] 6號峰的平均保留時間RT為15.51min，RSD為0.32 %，峰面積為102.070, RSD為 51.89%;
[0111] 7號峰的平均保留時間RT為17.19min，RSD為0.31 %，峰面積為353.710，RSD為 60.76%;
[0112] 8號峰的平均保留時間RT為18.31min，RSD為0.61 %，峰面積為675.391，RSD為 27.70%;
[0113] 9號峰的平均保留時間RT為23.26min，RSD為0.39 %，峰面積為1959.539, RSD為 46.88%;
[0114] 10號峰的平均保留時間RT為24.96min，RSD為0.49 %，峰面積為178.417, RSD為 25.76%;
[0115] 11號峰的平均保留時間RT為27.29min，RSD為0.26%，峰面積為141.349，RSD為 27.14%;
[0116] 12號峰的平均保留時間RT為34.36min，RSD為0.50%，峰面積為1170.988，RSD為 26.76%;
[0117] 13號峰的平均保留時間RT為43.95min，RSD為0.37 %，峰面積為282.908, RSD為 87.40%;
[0118] 14號峰的平均保留時間RT為45.09min，RSD為0.40 %，峰面積為194.799, RSD為 64.99%;
[0119] 15號峰的平均保留時間RT為46.49min，RSD為0.41%，峰面積為501.655，RSD為 33.:34%;
[0120] 16號峰的平均保留時間RT為48.19min，RSD為0.44%，峰面積為237.035，RSD為 36.89%。
[0。1] 實施例3
[0122] 本實施例用于說明本發(fā)明提供的猴頭菌片的質(zhì)量檢測方法。
[0123] 在實施例1和2的基礎(chǔ)上，本實施例通過采用本發(fā)明的質(zhì)量檢測方法，測定了其他1 批猴頭菌片的胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧和鳥巧的含量，W及其與共有模式圖譜的相似度。具 體步驟如下；
[0124] 取猴頭菌片（批號：150322,廣州白云山和記黃捕中藥有限公司），按照實施例1的 步驟（1)~（5)相同的方法，測定該猴頭菌片的胞巧、腺嚷嶺、尿巧、腺巧和鳥巧的含量分別 為 26.9 祉g、29.0化邑、167.1 Iug、94.45]ig、32.88]ig。
[0125] 取該批猴頭菌片，按照實施例1的步驟(1)~巧)相同的方法測定其指紋圖譜，并使 用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算其與實施例2中的步驟(6)的共有模式圖譜的相 似度，其相似度為0.92。
[0126] 盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的 條件下，可進(jìn)行各個條件的適當(dāng)變化?？蒞理解，本發(fā)明不限于所述實施方案，而歸于權(quán)利 要求的范圍，其包括所述每個因素的等同替換。
【主權(quán)項】
1. 一種猴頭菌片的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： (1) 制備混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液： 精密稱取適量胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鳥苷對照品，加水配制成每ImL含胞苷1~20μ g、腺噪呤1~20yg、尿苷20~40yg、腺苷20~40yg、鳥苷1~20yg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，優(yōu)選為 每ImL含胞苷5~9yg、腺噪呤3~7yg、尿苷25~35yg、腺苷25~35yg、鳥苷2~6yg的混合標(biāo)準(zhǔn) 品溶液； (2) 制備供試品溶液： 取猴頭菌片，去包衣，研細(xì)，精密稱取，置于具塞錐形瓶中，加水，密塞，稱定重量，超聲 提取，放冷，再稱重量，用水補(bǔ)足減失的重量，離心，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液； (3) 色譜條件： 以C18色譜柱，以甲醇-0.08~0.30 % vol %磷酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫:21 ~30°C，紫外檢測波長：220~280nm，流速:0 · 40~1 · 20mL · min-1，洗脫時間：50~IOOmin; (4) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸計算： 取所述混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣2、5、10、15、20、25yL注入高效液相色譜儀，按照步驟 (3)的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定3次，記錄色譜峰，以yg計的進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積平均值Y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計算，分別得到胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鳥苷的線性 關(guān)系； (5) 測定供試品溶液： 精密吸取所述供試品溶液注入高效液相色譜儀，按照步驟(3)的色譜條件得到指紋圖 譜，記錄峰面積，并按照步驟(4)得到的各線性關(guān)系計算胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鳥苷的 平均含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述方法還包括： (6) 按照與步驟（1)~（5)相同的方法測定10批猴頭菌片的指紋圖譜，然后使用指紋圖 譜相似度評價系統(tǒng)對所得10批猴頭菌片的指紋圖譜進(jìn)行分析，得到猴頭菌片的共有模式圖 譜，以及這10批猴頭菌片的指紋圖譜與共有模式圖譜的相似度。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述方法還包括： (7) 按照與步驟（1)~（5)相同的方法測定任意批次的猴頭菌片的胞苷、腺嘌呤、尿苷、 腺苷和鳥苷的含量;和/或 (8) 按照與步驟（1)~（5)相同的方法測定任意批次的猴頭菌片的指紋圖譜，并使用相 似度評價系統(tǒng)計算其與步驟(6)的共有模式圖譜的相似度。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，在步驟（1)中，精密 稱取適量胞苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷和鳥苷對照品，分別加水配制為每ImL含168.80yg胞苷、 57.50yg腺嘌呤、199.20yg尿苷、198. OOyg腺苷、51.60yg鳥苷的五份溶液，然后從這五份溶 液中分別取適量并混合，加水配制為每ImL含胞苷6.75yg、腺嘌呤4.60yg、尿苷31.87yg、腺 苷31.68yg、鳥苷4.13yg的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)為： 取猴頭菌片，去包衣，研細(xì)，精密稱取0.25~1.50g，置于具塞錐形瓶中，精密加入20mL 水，密塞，稱定重量，超聲提取20~60min，放冷，再稱重量，用水補(bǔ)足減失的重量，離心，濾 過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液;優(yōu)選地，精密稱取〇. 5g，超聲提取30min;更優(yōu)選地，4000r · min-1離心，0.22μηι濾膜濾過。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)為： 以C18色譜柱，以甲醇-0.1 % vol %磷酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫:26°C，紫外 檢測波長:260nm，流速:0 · 5mL · min-1，洗脫時間：60min 〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，步驟(3)中梯度洗脫 的條件為： 0分鐘時，流動相A為占流動相總體積0 %的甲醇、流動相B為占流動相總體積100 %的 0.1 % vol %磷酸水溶液； 25分鐘時，流動相A為占流動相總體積0.2 %的甲醇、流動相B為占流動相總體積99.8 % 的0.1 % vol %磷酸水溶液； 30分鐘時，流動相A為占流動相總體積0.5 %的甲醇、流動相B為占流動相總體積99.5 % 的0.1 % vol %磷酸水溶液； 35分鐘時，流動相A為占流動相總體積3.5 %的甲醇、流動相B為占流動相總體積96.5 % 的0.1 % vol %磷酸水溶液； 45分鐘時，流動相A為占流動相總體積3.8 %的甲醇、流動相B為占流動相總體積96.2 % 的0.1 % vol %磷酸水溶液； 60分鐘時，流動相A為占流動相總體積4.2 %的甲醇、流動相B為占流動相總體積95.8 % 的0.1 % vol %磷酸水溶液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，步驟(4)中的回歸計 算的結(jié)果為:胞苷的回歸方程為￥ = 3621.9乂+0.6092^為0.9999，線性范圍為0.01~0.174 區(qū)；腺嘌呤的回歸方程為￥=117761-2.3814 4為0.9999，線性范圍為0.01~0.12以8;尿苷的 回歸方程為Y = 5862.9x+5.3668，r為0.9999，線性范圍為0.06~0.80yg;腺苷的回歸方程為 ￥ = 6191.11+6.29114為0.9999，線性范圍為0.06~0.8(^8;鳥苷的回歸方程為￥ = 4327.6叉 +0 · 7886，r 為0 · 9999，線性范圍為0 · 01 ~0 · 10yg。9. 根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項所述的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，所述共有模式圖譜 中有16個特征共有峰，其中2號峰為胞苷、8號峰為腺嘌呤、9號峰為尿苷、12號峰為腺苷、13 號峰為鳥苷;優(yōu)選地，其中9號峰為參照峰，也是最強(qiáng)色譜峰;更優(yōu)選地，所述共有模式圖譜 的總長度為60min，其中單峰面積超過總峰面積1 %的峰有10個，它們是1~16號峰，單峰面 積超過總峰面積5 %的峰有6個，它們是5號峰、7號峰、8號峰、9號峰、12號峰、15號峰，單峰面 積超過總峰面積15%的有2個，它們是9號峰和12號峰，單峰面積超過總峰面積25%的有一 個，它是9號峰;進(jìn)一步優(yōu)選地，所述16個特征共有峰具體如下， 1號峰的平均保留時間RT為10.46min，RSD為0.33%，峰面積為125.982，RSD為35.38% ; 2號峰的平均保留時間訂為12.0411^11，1?0為0.38%，峰面積為198.013，1?0為41.68%; 3號峰的平均保留時間RT為12.09min，RSD為0.24%，峰面積為88.825，RSD為70.37% ; 4號峰的平均保留時間訂為12.6211^11，1?0為0.15%，峰面積為257.720，1?0為59.50%; 5號峰的平均保留時間訂為13.0911^11，1?0為0.34%，峰面積為625.366，1?0為42.44%; 6號峰的平均保留時間RT為15.51min，RSD為0.32%，峰面積為102.070，RSD為51.89% ; 7號峰的平均保留時間RT為17.19min，RSD為0.31 %，峰面積為353.710，RSD為60.76 % ; 8號峰的平均保留時間RT為18.31min，RSD為0.61 %，峰面積為675.391，RSD為27.70 % ; 9號峰的平均保留時間RT為23.26min，RSD為0.39 %，峰面積為1959.539, RSD為 46.88% ； 10號峰的平均保留時間RT為24.96min，RSD為0.49 %，峰面積為178.417，RSD為 25.76% ； 11號峰的平均保留時間RT為27.29min，RSD為0.26 %，峰面積為141.349, RSD為 27.14% ； 12號峰的平均保留時間RT為34.36min，RSD為0.50 %，峰面積為1170.988, RSD為 26.76% ； 13號峰的平均保留時間RT為43.95min，RSD為0.37 %，峰面積為282.908, RSD為 87.40% ； 14號峰的平均保留時間RT為45.09min，RSD為0.40 %，峰面積為194.799, RSD為 64.99% ； 15號峰的平均保留時間RT為46.49min，RSD為0.41 %，峰面積為501.655, RSD為 33.34% ； 16號峰的平均保留時間RT為48.19min，RSD為0.44 %，峰面積為237.035, RSD為 36.89%。10.根據(jù)權(quán)利要求1~9中任一項所述的質(zhì)量檢測方法所檢測得到的猴頭菌片劑。
【文檔編號】G01N30/06GK105954417SQ201610323819
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】張慧曄, 唐海明, 王德勤, 李楚源
【申請人】廣州白云山和記黃埔中藥（亳州）有限公司, 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司