白及中六種成分在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了白及中六種成分在Caco?2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方法，包括以下步驟：制備白及提取物溶液、作為對照品的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液；建立人源結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco?2細(xì)胞模型；通過Caco?2細(xì)胞模型制備出細(xì)胞懸液；通過UPLC?MS/MS測定6種成分的含量；按考馬斯亮藍(lán)染液蛋白測定試劑盒方法測定總蛋白含量，并計(jì)算細(xì)胞攝取量X=待測物總蛋白。本發(fā)明采用UPLC?MS/MS建立白及提取物中6個(gè)成分的分析方法，測定白及提取物在時(shí)間、濃度、溫度、pH和P?gh抑制劑條件下對Caco?2細(xì)胞的吸收攝取影響，初步評價(jià)白及提取物的體內(nèi)吸收特性。為白及提取物的口服制劑研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
【專利說明】
白及中六種成分在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于中藥檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是設(shè)及白及中六種成分在化CO-2細(xì)胞模型中 吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在口服藥物吸收特性的體外研究中，人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系(化CO-2細(xì)胞系）已成為經(jīng) 典的細(xì)胞模型。化CO-2單層細(xì)胞模型在體外培養(yǎng)一段時(shí)間后，能分化出與腸上皮細(xì)胞相似 功能的微絨毛結(jié)構(gòu)，含有小腸上皮細(xì)胞刷狀緣相關(guān)酶系?？勺园l(fā)形成分化的上皮和緊密連 接組織，其細(xì)胞形態(tài)，特異性的標(biāo)記酶和滲透特性都與小腸上皮細(xì)胞類似，并且重現(xiàn)性好， 與藥物體內(nèi)吸收具有良好的相關(guān)性，因此化CO-2細(xì)胞模型已廣泛用于體外快速評價(jià)口服藥 物的腸吸收特性
[0003] 白及為蘭科植物白及[公striata 巧化]的干燥塊莖，又 名甘根、白根、白巧、地螺絲等，主產(chǎn)于西南地區(qū)。白及最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其正品收 載于2010年版《中國藥典》，具收斂、止血、清熱利濕、消腫生肌之功效，用于治療咳血、吐血、 外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚薇裂、潰瘍出血等癥。國內(nèi)外大量研究表明，白及屬植物化學(xué)成分 具有多種類型，包括聯(lián)節(jié)類、二氨菲類、菲類、聯(lián)菲類、釀?lì)愌苌锏?。其提取物中成分包?曰-異下基蘋果酸（a-Isobutylmalic acid)、4-(葡糖糖氧基）-肉桂酸葡萄糖氧基節(jié)醋 (BlestrosideKl ,4-二[4-(葡萄糖氧)芐基]-2-異下基蘋果酸醋(Militarine)、4-(葡萄糖 氧)芐基-2-異下基蘋果酸醋(Gy皿oside)、二氨菲1 (Dihy化ophenanthrenel)和1,4-二[4- (葡萄糖氧）芐基]-2-異下基蘋果酸醋-2-[4-0-肉桂酷基-6-0-乙酷基]葡萄糖巧 (Gymnoside K)，便于區(qū)分，本實(shí)驗(yàn)將各成分分別依次命名為Bl、82、83、84、85和86。
[0004] 目前，關(guān)于白及提取物吸收特性尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS/MS建立白及提 取物中6個(gè)成分的分析方法，測定白及提取物在時(shí)間、濃度、溫度、pH和P-曲抑制劑條件下對 Caco-2細(xì)胞的吸收攝取影響，初步評價(jià)白及提取物的體內(nèi)吸收特性。為白及提取物的口服 制劑研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種白及中六種成分在化CO-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測 定方法，測定白及提取物在時(shí)間、濃度、溫度、pH和P-曲抑制劑條件下對化CO-2細(xì)胞的吸收 攝取影響，初步評價(jià)白及提取物的體內(nèi)吸收特性。為白及提取物的口服制劑研發(fā)提供科學(xué) 依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)該目的： 本發(fā)明的白及中六種成分在化CO-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方法包括W下步驟： 步驟1:制備白及提取物溶液； 步驟2:用a-Isobuty Imal ic acid (BI)、Blestroside (B2)、Mi Ii tar ine(B3)、Gymnoside (B4)、Dihyhwhenant虹ene 1(B5) W及Gymnoside K(B6)制備作為對照品的標(biāo)準(zhǔn)溶液； 步驟3: W葛根素配制內(nèi)標(biāo)溶液； 步驟4:建立人源結(jié)腸腺癌細(xì)胞系化C0-2細(xì)胞模型； 步驟5:將步驟1得到的白及提取物溶液加入化C0-2細(xì)胞模型在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取出培 養(yǎng)板吸走細(xì)胞表層的提取物W終止反應(yīng)，用PBS溶液清洗兩遍，加入細(xì)胞裂解液反復(fù)凍融W 裂解細(xì)胞，超聲處理后分別得到含有白及提取物溶液的細(xì)胞懸液； 步驟6:取步驟5得到的含有白及提取物溶液的細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液加入內(nèi)標(biāo)溶液，用乙 臘沉淀蛋白，滿混，離屯、處理，通過UPLC-MS/MS測定上清液中6種成分的含量； 步驟7:取步驟5得到的含有白及提取物溶液的細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液按考馬斯亮藍(lán)染液蛋 白測定試劑盒方法測定總蛋白含量，并計(jì)算細(xì)胞攝取量X=待測物總蛋白。
[0007] 步驟1中白及提取物溶液的制備方法如下：精密稱取白及提取物200mg加入PBS緩 沖鹽溶液定容至IOml,得20mg/ml的儲備液，4°C下儲存，臨用前用PBS緩沖溶液稀釋至所需 濃度。
[0008] 步驟2中作為對照品的標(biāo)準(zhǔn)溶液和步驟3中的內(nèi)標(biāo)溶液的制備方法如下:精密稱取 白及提取物中各待測成分81、82、83、84、85和86^及葛根素（15)各1〇111邑，分別用甲醇定容至 IOml，作為儲備液，于4°C下儲存。
[0009] 步驟4建立人源結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞模型中Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)方法如下： 化CO-2細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后，用10%-DMEM培養(yǎng)液接種于T-25培養(yǎng)瓶中，置于37 °C、5%0)2和相對 濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液W洗去死細(xì)胞，之后隔一天更換一次培 養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)4~5天后于倒置顯微鏡下觀察待細(xì)胞融合率約80%左右，吸去細(xì)胞表面的培 養(yǎng)液，用37°C預(yù)熱的0.25%膜蛋白酶消化液進(jìn)行消化，Wl :3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。其中， 10%-DMEM培養(yǎng)液中包括10%胎牛血清、1%雙抗含青霉素 IOOU ? mL-i和鏈霉素 IOOiig ? mL-i、 89〇/〇1640培養(yǎng)基。
[0010] 步驟6中UPLC-MS/MS現(xiàn)憶時(shí)的液相條件如下：色譜柱:Waters B邸Cis (2.1 mmX 50 mm, 1.7 ym)柱；保護(hù)柱：Waters Van Guard 邸H Ci8 (2.1 mmX5 mm, 1.7 ym);流 速:0.35血-111111-1;柱溫:45°(：;流動(dòng)相:0.1%甲酸乙臘(4)-0.1%甲酸水溶液(8);檢巧化種 成分的梯度條件 0 ~3.0 min 5 %~65 % A, 3.0 ~3.5 min 65 % ~90 % A, 3.5 ~4.5 min 10 % A;進(jìn)樣體積2 yL。
[0011] 步驟6中UPLC-MS/MS測定時(shí)的質(zhì)譜條件如下：電噴霧電離源化SI);毛細(xì)管電壓：3 kV;離子源溫度：120 °C;去溶劑氣溫度：350°C;去溶劑氣:化，流速650 L ? IrS反吹氣:化， 流速:50 L ? h-i;碰撞氣:Ar，流速:0.16 mL ? min-i;質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站；掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)。其中，白及提取物中成分Bl、B2、B3、 84、85、86^及葛根素（15)的離子對條件分別為111八169，129;5932,431.3;725.3,457.2; 457.2，285.1; ：347.1，332.1; 1059.3，791.3 和417，267。
[0012] 本發(fā)明利用化CO-2細(xì)胞單層細(xì)胞模型研究白及提取物的吸收攝取特性，方法是采 用UPLC-MS/MS考察白及提取物在不同提取物濃度、時(shí)間、溫度、抑和P-糖蛋白抑制劑條件下 對化CO-2細(xì)胞的吸收影響。本發(fā)明的方法結(jié)果表明白及提取物在化CO-2細(xì)胞中的吸收具有 濃度和時(shí)間依賴性，其中Bl和B5在攝取60min后趨于飽和;B6在25°C條件下吸收最好，其他 成分均在37°C條件下吸收最好;酸性環(huán)境下有利于白及提取物的吸收;加入P-糖蛋白抑制 劑維拉帕米和環(huán)抱菌素 A后發(fā)現(xiàn)，B5的攝取量顯著性增加?？芍准疤崛∥镌诨疌O-2細(xì)胞中 的吸收機(jī)制可能為被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，酸性環(huán)境有利于各成分的吸收，且P-糖蛋白可能參與了 B5的 攝取過程。
[0013] 本發(fā)明采用UPLC-MS/MS建立白及提取物中6個(gè)成分的分析方法，測定白及提取物 在時(shí)間、濃度、溫度、pH和P-曲抑制劑條件下對化CO-2細(xì)胞的吸收攝取影響，初步評價(jià)白及 提取物的體內(nèi)吸收特性。為白及提取物的口服制劑研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[00巧]實(shí)施例1: 1實(shí)驗(yàn)儀材 1.1儀器超高液相色譜-S重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）；C〇2培養(yǎng)箱 (I'hermo sci-entif ic);超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備總廠）；功能酶標(biāo)儀（ThermoSOOl VARI0SKAN FLA甜）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus)。
[0016] 1.2 試劑與試藥 a-Isobutylmalic acid(Bl)、Blest;roside(B2)、Milita;rine (B3)、Gymnoside(B4)、Dihy化ophenanthrene I (B5) W及Gymnoside K(B6)皆為實(shí)驗(yàn)室前 期分離(批號20150305) ;PSS緩沖溶液(Solarbio);胎牛血清(G化CO) ;DMEM培養(yǎng)基(高糖， Gibco);膜蛋白酶(Gibco);雙抗化yclone);考馬斯亮藍(lán)染液(南京建成生物工程研究所）； DMSO、甲醇、乙臘均為色譜純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水;其他試劑均為分析純。
[0017] 1.3細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞株化海中科院），細(xì)胞傳代數(shù)在50代W內(nèi)。
[001引 2方法與結(jié)果 2.1提取物溶液的配制 精密稱取白及提取物200mg加入PBS緩沖鹽溶液(pH7.4，0.1M)定容至IOml，得20mg/ml 的儲備液，4°C下儲存，臨用前用PBS緩沖溶液稀釋至所需濃度。
[0019] 2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取白及提取物中各待測成分81、82、83、84、85和86^及葛根素（15)各1〇111邑，分別 用甲醇定容至10ml，作為儲備液，于4°C下儲存。 2.3細(xì)胞的培養(yǎng) Caco-2細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后，用10%-DMEM培養(yǎng)液（10%胎牛血清、1%雙抗含青霉素 IOOU ? mL-哺鏈霉素 IOOiig ? mL-i、89%1640培養(yǎng)基)接種于T-25培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%CO沸相對濕 度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后(大約化)更換培養(yǎng)液W洗去死細(xì)胞，之后隔一天更換 一次培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)4~5天后于倒置顯微鏡下觀察待細(xì)胞融合率約80%左右，吸去細(xì)胞表 面的培養(yǎng)液，用37°C預(yù)熱的0.25%膜蛋白酶消化液進(jìn)行消化，Wl :3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0020] 2.4白及提取物安全濃度范圍考察 選取傳代數(shù)在50代W內(nèi)且處于對數(shù)生長期的化CO-2細(xì)胞，W密度為1.5~2 X IOMVmL 種植于96孔培養(yǎng)板中，每孔10化L，置于37 °C、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2地。次日吸去培養(yǎng)液，實(shí) 驗(yàn)組分別加入10化L不同濃度的白及提取物溶液（用PBS緩沖鹽溶液分別稀釋至0.1、0.5、 2.5、5、15 mg ? m[i)，空白組加入10化L PBS緩沖鹽溶液，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別作用 化CO-2細(xì)胞4 h后每孔加入100 iiL MTT溶液(用PBS緩沖鹽溶液配制成0.25 mg-mL-i)，繼續(xù) 培養(yǎng)4 h，吸去上清液，每孔加入100化DMSO溶解結(jié)晶，于490nm波長處檢測每孔吸光度OD 值。計(jì)算細(xì)胞存活率(藥物組OD值/對照組OD值* 100 )，與空白組比較并分析白及提取物的安 全濃度范圍。結(jié)果如圖1所示：當(dāng)白及提取物>2.5 mg ? mL-i，對化CO-2細(xì)胞的毒性作用逐漸 增大，因此，選擇2.0 mg ? m[i的白及提取物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)考察。
[0021] 2.5化CO-2細(xì)胞的吸收特性方法 選取傳代數(shù)在50代W內(nèi)且處于對數(shù)生長期的化CO-2細(xì)胞，W密度為7 X IO5個(gè)/mL種植 于6孔培養(yǎng)板中，每孔500化，置于37°C、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21天，前3天隔一天更換一次培 養(yǎng)液，之后每天更換一次。于第22天，吸去細(xì)胞表層的培養(yǎng)液，用37°C預(yù)熱的PBS緩沖鹽溶液 在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)30 min后，吸去緩沖鹽溶液，W洗去單層細(xì)胞表面的雜質(zhì)，然后加入用37 °(：的口85溶液配制的白及提取物，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間后，取出培養(yǎng)板吸走細(xì)胞表層的 提取物W終止反應(yīng)，用4°C的PBS溶液清洗兩遍，加入50化L 0.1% TritonX-IOO細(xì)胞裂解液， 反復(fù)凍融W裂解細(xì)胞，超聲IOmin得細(xì)胞懸液，一部分取25化L細(xì)胞懸液加入50化內(nèi)標(biāo)溶液 (葛根素2 yg .HiL-I),用400化乙臘沉淀蛋白，滿混，15000巧m離屯、lOmin，通過UPLC-MS/MS 測定上清液中6種成分的含量(mg)。另一部分取IOiiL細(xì)胞懸液按考馬斯亮藍(lán)染液蛋白測定 試劑盒方法測定總蛋白含量(g)，并計(jì)算細(xì)胞攝取量X=待測物(mg)/總蛋白（g)。
[0022] 2.6 UPLC-MS/MS分析條件 2.6.1 液相條件：色譜柱:Waters 肥H Cis (2.1 mm X 50 mm, 1.7 ym)柱;保護(hù)柱： Waters Van Guard 肥H Cis (2.1 mmX 5 mm, 1.7 ym);流速：0.35 mL .IIiin-I;柱溫：45 °C;流動(dòng)相:0.1 %甲酸乙臘(A)-0.1 %甲酸水溶液(B);檢測6種成分的梯度條件0~3.0 min 5 %~65 % A，3.0~3.5 min 65 % ~90 % A，3.5~4.5 min 10 % A;進(jìn)樣體積 2 化。
[0023] 2.6.2質(zhì)譜條件：電噴霧電離源巧SI);毛細(xì)管電壓:3 kV;離子源溫度:120 °C;去 溶劑氣溫度:350°C;去溶劑氣:化，流速650 L ? h-i;反吹氣:化，流速:50 L ? h-i;碰撞氣:Ar， 流速:0.16血-min-i;質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為MassLynx V4.1工作站;掃描方式為多反 應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)。白及提取物中成分81、82、83、84、85、86^及葛根素（15)的離子對條 件分別為 m/zl69,129; 5932,431.3; 725.3,457.2; 457.2,285.1; 347.1,332.1; 1059.3， 791.3和417,267。
[0024] 2.7方法學(xué)考察 2.7.1專屬性將空白細(xì)胞混懸液A、混合對照品溶液B和細(xì)胞樣品C在建立的色譜條件 下進(jìn)樣分析，對比圖A、B和C分析專屬性。結(jié)果如圖2所示:各成分的分離度良好，B1、B2、B3、 B4、B5、B6 W及葛根素(IS)保留時(shí)間分別為：1.55,1.49,1.81,1.70,2.98,3.11和 1.30。且細(xì) 胞懸液基質(zhì)背景對成分的測定無干擾。
[0025] 2.7.2線性和檢測線取25化L空白細(xì)胞混懸液，分別加入50化已配制成一系列不同濃 度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，W及50化內(nèi)標(biāo)溶液，滿混均勻后，用400化乙臘沉淀蛋白，其余操作按 "2.5"項(xiàng)下處理并進(jìn)樣分析。W待測物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A/Ai)為縱坐標(biāo)Y，各物 質(zhì)濃度(C)為橫坐標(biāo)X擬合線性方程，結(jié)果如表1所示:成分81、82、83、84、85和86的線性關(guān)系 良好;檢測線可滿足白及提取物后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對細(xì)胞樣品的檢測要求。
[00%] 2.7.3準(zhǔn)確度與精密度按"2.7.2"項(xiàng)下分別配制低、中、高3個(gè)濃度的細(xì)胞懸液質(zhì) 控(QC)樣品，每個(gè)濃度平行操作5次，連續(xù)測定3天，代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線中分別計(jì)算各物質(zhì)的 濃度，結(jié)果表明該分析方法的準(zhǔn)確度為89.73%~102.68%，日間RSD%為0.86%~9.39%，日內(nèi) RSD% 為 1.02% ~4.51〇/〇。
[0027] 2.7.4回收率按"2.7.2"項(xiàng)下分別配制低、中、高3個(gè)濃度的細(xì)胞懸液質(zhì)控(QC)樣 品，W及用初始流動(dòng)相配制成對應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別重復(fù)進(jìn)樣3次，代入隨行標(biāo)準(zhǔn) 曲線中分別計(jì)算各物質(zhì)的濃度，W細(xì)胞樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的比值計(jì)算各成分的提取回收率， 結(jié)果顯示成分的提取回收率均大于81%。
[00%] 2.7.5穩(wěn)定性用空白細(xì)胞混懸液按"2.7.2"下配制成中濃度的細(xì)胞懸液質(zhì)控 (QC)樣品，室溫放置，分別在1、3、5 d進(jìn)樣分析，代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線中分別計(jì)算各物質(zhì)的濃 度，其日間RSD% 分別為0.47%、0.59%、0.73%、0.66%、0.82% 和0.43〇/〇。
[00巧]2.9化CO-2細(xì)胞吸收特性考察內(nèi)容： 2.9.1時(shí)間依賴性試驗(yàn) 將白及提取物(2.0 mg ?血-1)于Caco-2細(xì)胞中分別培養(yǎng)15、30、60、90、120、180111111，其 余同"2.5"項(xiàng)下操作，測定細(xì)胞懸液中各成分含量，計(jì)算細(xì)胞攝取量并采用GraphPad v5.0 軟件作圖，考察不同培養(yǎng)時(shí)間對Caco-2細(xì)胞吸收的影響。結(jié)果如圖3所示:選擇60min作為最 適解育時(shí)間較為合理。
[0030] 2.9.2濃度依賴性試驗(yàn) 用PBS溶液將白及提取物稀釋至不同濃度(0.1、0.5、l、2.0、2.5mg?血-l)于化co-2細(xì) 胞中培養(yǎng)60min，其余同"2.5"項(xiàng)下操作，考察不同濃度的提取物對化CO-2細(xì)胞吸收攝取的 影響。結(jié)果如圖4所示:提取物濃度在0. ^2.5 mg ? ml/i范圍內(nèi)，各成分在化CO-2細(xì)胞的攝取 量隨濃度的增加呈線性增加，其回歸相關(guān)系數(shù)R2均大于0.900,說明W上6種成分在化CO-2 細(xì)胞中的吸收攝取特性均表現(xiàn)出濃度依賴性，結(jié)合安全濃度范圍，選擇2.0 mg ? ml/i作為后 續(xù)試驗(yàn)中提取物濃度。
[0031] 2.7.3 pH依賴性試驗(yàn) 將白及提取物(2.0 mg-ml/i)溶于不同pH環(huán)境的PBS緩沖溶液(pH 4.0、6.0、7.4)中， 分別于化CO-2細(xì)胞中培養(yǎng)60min，其余同"2.5"項(xiàng)下操作，考察不同pH介質(zhì)對細(xì)胞吸收攝取 的影響。結(jié)果如圖5所示:Bl在抑6.0環(huán)境中吸收較好，其余成分在抑4.0環(huán)境中吸收較好，綜 合考慮選擇PH6.0的培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0032] 2.7.4溫度依賴性試驗(yàn) 將白及提取物(2.0 mg ? mL-i，p冊.0)于化CO-2細(xì)胞中分別在不同溫度(4、25、37°C)下 培養(yǎng)60min，其余同"2.5"項(xiàng)下操作，考察不同溫度對細(xì)胞吸收攝取的影響。結(jié)果如圖6所示： B6在25°C條件下攝取量最高，其余成分的攝取量隨溫度升高而增加，綜合考慮選擇培養(yǎng)溫 度為37°C進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0033] 2.7.5 P-曲抑制劑對化CO-2細(xì)胞吸收攝取的影響 基于W上考察，用PH6.0的PBS緩沖溶液分別配制對照組白及提取物（2.0 mg ? ml/i)， 實(shí)驗(yàn)組含維拉帕米巧0 yg-ml/i)的同濃度白及提取物溶液、含環(huán)抱菌素 A(l〇 的 同濃度白及提取物溶液，于37°C、5%(X)2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)60 min后測定有無抑制劑對 化CO-2細(xì)胞吸收攝取的影響。結(jié)果見表2所示：實(shí)驗(yàn)組B5的攝取量較對照組有顯著性差異 (戶<口.口5)，其余成分的細(xì)胞攝取量較對照組無顯著性差異(AO.05)，說明白及提取物中B5 在化CO-2細(xì)胞中的吸收受P-甜的影響。
[0034] 3小結(jié)與討論 本實(shí)驗(yàn)采用化CO-2單層細(xì)胞模型，通過UPLC-MS/MS測定白及提取物中6個(gè)成分在不同 時(shí)間、濃度、pH、溫度和P-gp抑制劑條件下對化CO-2細(xì)胞的吸收攝取影響，初步評價(jià)白及提 取物的吸收攝取特性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：白及提取物在0.1~2.5 mg ? ml/1范圍內(nèi)吸收攝取受時(shí) 間、濃度、pH的影響，Caco-2細(xì)胞的攝取量與藥物濃度呈良好的線性關(guān)系，由于在各自相應(yīng) 濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞攝取表現(xiàn)出一級速率過程的特征，因此說明白及提取物的吸收機(jī)制可能 為被動(dòng)擴(kuò)散。酸性環(huán)境有利于白及提取物的吸收，運(yùn)可能由于Bl為有機(jī)酸類，B2、B3、B4和B6 為糖巧類，W及B5是含有=個(gè)酪徑基的菲類化合物，各成分都偏酸性，在酸性條件下W非解 離形式被攝取，而在中性偏堿性條件下水解成鹽導(dǎo)致膜通透性降低，攝取量相對減少。隨溫 度的增加，攝取越接近生理環(huán)境(37°C)細(xì)胞攝取量也隨之增加(B23除外），而B23在常溫(25 °C)條件下吸收較好，通過考察白及提取物中6種成分的吸收攝取是否受P-糖蛋白抑制劑的 影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)維拉帕米和環(huán)抱菌素 A能明顯促進(jìn)B5的細(xì)胞攝取(代化口巧，說明B5可能是P- 即的底物，B5為二氨菲類化合物，疏水性較強(qiáng)，其腸道吸收易受P-糖蛋白的影響。因此需通 過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(腸灌流、腸外翻)進(jìn)一步研究白及提取物的口服吸收機(jī)制，W期為白及提取物 口服制劑的開發(fā)研究提供依據(jù)。
[0035]當(dāng)然，W上只是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，本發(fā)明還有其他的實(shí)施方式，凡采用等同 替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 白及中六種成分在CaC〇-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方法，其特征在于包括以下 步驟： 步驟1:制備白及提取物溶液； 步驟2:用α-Isobutylmalic acid(Bl)、Blestroside(B2)、Militarine(B3)、Gymnoside (B4)、Dihydrophenanthrene I (B5)以及Gymnoside IX(B6)制備作為對照品的標(biāo)準(zhǔn)溶液； 步驟3:以葛根素配制內(nèi)標(biāo)溶液； 步驟4:建立人源結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞模型； 步驟5:將步驟1得到的白及提取物溶液加入Caco-2細(xì)胞模型在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取出培 養(yǎng)板吸走細(xì)胞表層的提取物以終止反應(yīng)，用PBS溶液清洗兩遍，加入細(xì)胞裂解液反復(fù)凍融以 裂解細(xì)胞，超聲處理后分別得到含有白及提取物溶液和系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的細(xì)胞懸液； 步驟6:取步驟5得到的含有白及提取物溶液的細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液加入內(nèi)標(biāo)溶液，用乙 腈沉淀蛋白，渦混，離心處理，通過UPLC-MS/MS測定上清液中6種成分的含量； 步驟7:取步驟5得到的含有白及提取物溶液的細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液按考馬斯亮藍(lán)染液蛋 白測定試劑盒方法測定總蛋白含量，并計(jì)算細(xì)胞攝取量X=待測物總蛋白。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白及中六種成分在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方 法，其特征在于步驟1中白及提取物溶液的制備方法如下：精密稱取白及提取物200mg加入 PBS緩沖鹽溶液定容至IOml，得20mg/ml的儲備液，4°C下儲存，臨用前用PBS緩沖溶液稀釋至 所需濃度。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白及中六種成分在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方 法，其特征在于步驟2中作為對照品的標(biāo)準(zhǔn)溶液和步驟3中的內(nèi)標(biāo)溶液的制備方法如下:精 密稱取白及提取物中各待測成分81、82、83、84、85和86以及葛根素（15)各1〇!^，分別用甲醇 定容至IOml，作為儲備液，于4°C下儲存。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白及中六種成分在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方 法，其特征在于步驟4建立人源結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞模型中Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)方法如 下：Caco-2細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后，用10%-DMEM培養(yǎng)液接種于T-25培養(yǎng)瓶中，置于37 °C、5%C02和 相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液以洗去死細(xì)胞，之后隔一天更換一 次培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)4~5天后于倒置顯微鏡下觀察待細(xì)胞融合率約80%左右，吸去細(xì)胞表面 的培養(yǎng)液，用37°C預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化，以1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的白及中六種成分在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方 法，其特征在于:所述I〇%-DMEM培養(yǎng)液中包括10%胎牛血清、1%雙抗含青霉素 IOOU · ml/1和鏈 霉素 IOOyg · mL-\89%1640培養(yǎng)基。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白及中六種成分在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方 法，其特征在于:步驟6中UPLC-MS/MS測定時(shí)的液相條件如下：色譜柱:Waters BEH C18 (2.1 mmX50 mm，1 ·7 μπι)柱；保護(hù)柱：Waters Van Guard BEH Ci8 (2.1 mmXf5 mm，1.7 μπι); 流速:0.35 mL IirT1;柱溫:45°C;流動(dòng)相:0.1 %甲酸乙腈(A)-O.I %甲酸水溶液(B);檢測6 種成分的梯度條件 〇 ~3.0 min 5 %~65 % A，3·0~3·5 min 65 % ~90 % A，3·5~4.5 min 10 % A;進(jìn)樣體積2 μL。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的白及中六種成分在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方 法，其特征在于:步驟6中UPLC-MS/MS測定時(shí)的質(zhì)譜條件如下：電噴霧電離源(ESI);毛細(xì)管 電壓:3 kV;離子源溫度：120 °C;去溶劑氣溫度:350°C;去溶劑氣:N2，流速650 L .IT1;反吹 氣：N2，流速：50 L .IT1;碰撞氣:Ar，流速:0.16 mL· HiirT1;質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為 MassLynx V4.1工作站;掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式(MRM)。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的白及中六種成分在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量的測定方 法，其特征在于：白及提取物中成分8132、83、84、85、86以及葛根素（15)的離子對條件分別 為m/zl69，129;5932,431.3 ;725.3,457.2;457.2,285.1;347·1,332.1;1059.3,791.3和 417,267。
【文檔編號】G01N30/02GK105954411SQ201610298953
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月9日
【發(fā)明人】黃勇, 李勇軍, 鄭林, 陸苑, 蘭燕宇, 王愛民, 孫佳, 鞏仔鵬, 李月婷, 陳思穎, 楊暢
【申請人】貴州醫(yī)科大學(xué)