基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒。本發(fā)明提供的基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒包括試紙條和卡殼：卡殼設(shè)置于試紙條的外圍，包圍試紙條；試紙條包括底襯以及設(shè)置于底襯上的包被膜，包被膜上依次設(shè)置有樣品墊、包被線區(qū)和吸水紙；包被線區(qū)依次設(shè)置為標(biāo)記線、質(zhì)控線、AFP檢測線和CEA檢測線。本發(fā)明提供的基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒通過AFP與CEA兩項(xiàng)聯(lián)檢，對于腫瘤發(fā)生的判斷起到協(xié)同互補(bǔ)作用，可以根據(jù)實(shí)際檢測結(jié)果，為腫瘤早期提供輔助判斷，縮短檢測周期，增加了檢測的靈敏度，方便了用戶使用。
【專利說明】
基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生命健康技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及基于生物標(biāo)志物的腫瘤早 期檢測試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲胎蛋白（a-fetoprotein AFP)是單一多聚體肽鍵糖蛋白，含590個(gè)氨基酸，分 子量約為70KD，與血清白蛋白、維生素結(jié)合蛋白屬同一基因家族。AFP于胎兒6周開始合成， 12-15周達(dá)到高峰。出生后1-2年降至成人水平。AFP是診斷肝癌靈敏度高和特異性好的 腫瘤標(biāo)志物，是臨床診斷原發(fā)性肝細(xì)胞癌的主要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，常用于原發(fā)性肝癌臨床檢查 及普查。癌胚抗原（carcino-embryonic antigen CEA)是一種分子量為180_200kDa的多 糖蛋白復(fù)合物。它存在2-6月齡的胎兒胃腸道組織和直、結(jié)腸癌細(xì)胞組織中，胃癌、胰腺癌、 卵巢癌、食道癌等組織中也有存在。通常CEA被認(rèn)為是一種廣譜的腫瘤標(biāo)志物。目前市場 上的廣譜的腫瘤的早期判斷僅僅單獨(dú)依靠單一的腫瘤標(biāo)志物的檢測，常常因?yàn)閱我坏臋z驗(yàn) 周期長，靈敏度低，從而無法確保腫瘤的診斷率以及甚至?xí)绊懩[瘤患者后續(xù)的治療和生 命健康。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒及其制 備方法，同時(shí)檢測AFP和CEA，對于腫瘤發(fā)生的判斷起到協(xié)同互補(bǔ)作用，可以根據(jù)實(shí)際檢測 結(jié)果，為腫瘤早期提供輔助判斷，縮短檢測周期，增加了檢測的靈敏度，方便了用戶使用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒。
[0005] 所述基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒包括試紙條和卡殼：
[0006] 所述卡殼設(shè)置于所述試紙條的外圍，包圍所述試紙條；
[0007] 所述試紙條包括底襯以及設(shè)置于所述底襯上的包被膜，所述包被膜上依次設(shè)置有 樣品墊、包被線區(qū)和吸水紙；
[0008] 所述包被線區(qū)依次設(shè)置有標(biāo)記線、質(zhì)控線、AFP檢測線和CEA檢測線。
[0009] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述AFP檢測線包括能與待檢測抗原AFP特異性結(jié)合的第 一 AFP單克隆抗體；所述CEA檢測線包括能與待檢測抗原CEA特異性結(jié)合的第一 CEA單克 隆抗體。
[0010] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述待檢測抗原AFP為人源AFP，所述待檢測抗原CEA為人 源 CEA〇
[0011] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述標(biāo)記線包括被熒光膠乳標(biāo)記的第二AFP單克隆抗體、 第二CEA單克隆抗體和兔IgG抗體。
[0012] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述質(zhì)控線包括羊抗兔IgG抗體。
[0013] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述卡殼包括加樣區(qū)和視窗區(qū)：
[0014] 所述加樣區(qū)設(shè)置于所述試紙條的樣品墊處，用于滴加樣品；
[0015] 所述視窗區(qū)設(shè)置于所述試紙條的包被線區(qū)，用于觀測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0016] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述標(biāo)記線和所述質(zhì)控線之間、所述質(zhì)控線和所述AFP檢 測線之間以及所述AFP檢測線和所述CEA檢測線之間的間隔設(shè)置為2mm-5mm。
[0017] 此外，為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑 盒的制備方法。
[0018] 所述基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒的制備方法包含以下步驟：
[0019] 將稀釋過的標(biāo)記有第二AFP單克隆抗體的熒光膠乳、標(biāo)記有第二CEA單克隆抗體 的熒光膠乳和標(biāo)記有兔IgG抗體的熒光膠乳，劃線包被于包被膜上的包被線區(qū)，形成標(biāo)記 線；
[0020] 稀釋羊抗兔IgG抗體，并將稀釋過的所述羊抗兔IgG抗體劃線包被于包被膜上的 包被線區(qū)，形成質(zhì)控線；
[0021] 稀釋能與待檢測抗原AFP特異結(jié)合的第一 AFP單克隆抗體，并將稀釋過的所述能 與待檢測抗原AFP特異結(jié)合的第一 AFP單克隆抗體劃線包被于包被膜上的包被線區(qū)，形成 AFP檢測線；
[0022] 稀釋能與待檢測抗原CEA特異結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體，并將稀釋過的所述能 與待檢測抗原CEA特異結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體劃線包被于包被膜上的包被線區(qū)，形成 CEA檢測線；
[0023] 將包被有所述標(biāo)記線、質(zhì)控線、AFP檢測線和CEA檢測線的包被膜置于烘箱中，進(jìn) 行干燥平衡；
[0024] 將樣品墊和吸水紙依次搭接并粘貼于干燥平衡后的所述包被膜上，所述樣品墊設(shè) 置于所述標(biāo)記線的一端，所述吸水紙?jiān)O(shè)置于所述CEA檢測線的一端；
[0025] 將所述包被膜粘貼于底襯上，形成試紙條；
[0026] 將卡殼設(shè)置于所述試紙條的外圍，包圍所述試紙條。
[0027] 優(yōu)選地，所述待檢測抗原AFP為人源AFP，所述待檢測抗原CEA為人源CEA。
[0028] 優(yōu)選地，所述標(biāo)記線和所述質(zhì)控線之間、所述質(zhì)控線和所述AFP檢測線之間以及 所述AFP檢測線和所述CEA檢測線之間的間隔設(shè)置為2_-5_。
[0029] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，帶來的技術(shù)效果為：本發(fā)明實(shí)施例提供的基于生物標(biāo) 志物的腫瘤早期檢測試劑盒，包括試紙條和卡殼，卡殼設(shè)置于試紙條的外圍，包圍試紙條； 試紙條包括底襯以及設(shè)置于底襯上的包被膜，包被膜上依次設(shè)置有樣品墊、包被線區(qū)和吸 水紙；包被線區(qū)依次設(shè)置為標(biāo)記線、質(zhì)控線、AFP檢測線和CEA檢測線；標(biāo)記線包括被熒光膠 乳標(biāo)記的第二AFP單克隆抗體、第二CEA單克隆抗體和兔IgG抗體，質(zhì)控線包括羊抗兔IgG 抗體；AFP檢測線和CEA檢測線分別包括能與待檢測抗原AFP特異性結(jié)合的第一 AFP單克 隆抗體和能與待檢測抗原CEA特異性結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體。本發(fā)明實(shí)施例提供的基 于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒通過AFP與CEA兩項(xiàng)聯(lián)檢，對于腫瘤發(fā)生的判斷起到 協(xié)同互補(bǔ)作用，可以根據(jù)實(shí)際檢測結(jié)果，為腫瘤早期提供輔助判斷，縮短檢測周期，增加了 檢測的靈敏度，方便了用戶使用。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒較佳實(shí)施例的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示 意圖；
[0031] 圖2為本發(fā)明基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒較佳實(shí)施例的包被線區(qū)的 示意圖；
[0032] 圖3為采用本發(fā)明基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒與德靈儀器針對相同 臨床樣本測量出的AFP的相關(guān)性圖；
[0033] 圖4為采用本發(fā)明基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒與德靈儀器針對相同 臨床樣本測量出的CEA的相關(guān)性圖。
[0034] 本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)、功能特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)將結(jié)合實(shí)施例，參照附圖做進(jìn)一步說明。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0036] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒及其制 備方法，同時(shí)檢測AFP和CEA，對于腫瘤發(fā)生的判斷起到協(xié)同互補(bǔ)作用，可以根據(jù)實(shí)際檢測 結(jié)果，為腫瘤早期提供輔助判斷，縮短檢測周期，增加了檢測的靈敏度，方便了用戶使用。
[0037] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒。
[0038] 圖1為本發(fā)明基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒較佳實(shí)施例的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示 意圖；圖2為本發(fā)明基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒較佳實(shí)施例的包被線區(qū)的示意 圖。參照圖1和圖2,在本實(shí)施例中，所述基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒包括試紙 條10和卡殼20 :
[0039] 所述卡殼20設(shè)置于所述試紙條10的外圍，包圍所述試紙條10 ;
[0040] 所述試紙條10包括底襯101以及設(shè)置于所述底襯101上的包被膜102,所述包被 膜102上依次設(shè)置有樣品墊1021、包被線區(qū)和吸水紙：
[0041] 所述包被線區(qū)1022依次設(shè)置有標(biāo)記線10221、質(zhì)控線10222、AFP檢測線10223和 CEA檢測線10224。
[0042] 在本實(shí)施例中，所述基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒包括試紙條10和卡 殼20,卡殼20設(shè)置于試紙條10的外圍，卡殼20的材質(zhì)可以是塑料的，卡殼20的形狀可以 是長方體的，也可以設(shè)計(jì)成別的形狀，但是以匹配試紙條10為前提，卡殼20包圍試紙條10， 起到保護(hù)的作用。作為優(yōu)選的實(shí)施例，卡殼20上有兩處開孔的地方，一處稱為加樣區(qū)：對應(yīng) 于試紙條10上的樣品墊1021處，為了方便使用者加樣，卡殼20的加樣區(qū)可以設(shè)置有"小雨 點(diǎn)"的加樣標(biāo)識，防止初次使用者混淆加樣區(qū)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)檢測失??；另一處稱為視窗區(qū)：對應(yīng) 設(shè)置于試紙條10上的包被線區(qū)1022,為了清晰直觀的觀測到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，設(shè)置卡殼20 方便了使用者的實(shí)驗(yàn)操作，減少了人為的誤差，提高了檢測結(jié)果的正確率。
[0043] 所述試紙條10包括底襯101及設(shè)在底襯101上的包被膜102,包被膜102上設(shè)有 樣品墊1021、包被線區(qū)1022和吸水紙1023。在檢測的過程中，吸水紙1023的主要成分是 纖維素，用于提供檢測所需的毛細(xì)作用力，吸水紙的材料可以是自由棉絨，也可以是玻璃纖 維，優(yōu)選自由棉絨的材料。由于纖維素是天然的大分子有機(jī)物，紙張中的纖維素交錯(cuò)呈網(wǎng) 狀，因此纖維素交錯(cuò)形成的網(wǎng)狀中有很多空隙，這些空隙可以含住吸水紙1023上的水分， 從而產(chǎn)生張力。此外水由于勢能，從濃度高的一側(cè)流向濃度低的一側(cè)，因此在實(shí)驗(yàn)操作的過 程中，如果從一側(cè)吸水，則有利于滴加的檢測樣品快速的擴(kuò)散從加樣處到硝酸纖維素膜上， 利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，簡稱NC膜），是免疫 反應(yīng)的發(fā)生處。當(dāng)通過樣品墊1021，在吸水紙1023的作用下把樣品從起始上樣點(diǎn)轉(zhuǎn)移至包 被線區(qū)，在檢測試紙條10下游控制著樣品沿著NC膜膜片流動。
[0044] 所述包被線區(qū)1022包括有從靠近所述樣品墊1021端至靠近所述吸水紙1023端 依次平行設(shè)置、且相互間隔的包被有第二AFP單克隆抗體、第二CEA單克隆抗體和兔IgG抗 體的標(biāo)記線10221、包被有羊抗兔IgG抗體的質(zhì)控線10222、包被有能與待檢測抗原AFP特 異性結(jié)合的第一 AFP單克隆抗體的AFP檢測線10223、以及包被有能與待檢測抗原CEA特異 性結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體的CEA檢測線10224。所述標(biāo)記線10221上熒光膠乳標(biāo)記的 抗體采用熒光稀釋液進(jìn)行稀釋，所述熒光稀釋液包括：1. 〇% -1. 5% BSA，2. 5% -5 %蔗糖， 0? 1% -0? 5% Tween-20,0. 08-0. 1% NaN3,余量為 0? 01-0. 02M、pH7. 2 的 PBS ;牛血清白蛋白 (BSA)，是牛血清中的一種白蛋白，能減輕有些抗體的變性，對于某些不利環(huán)境因素如加熱， 表面張力及化學(xué)因素引起的抗體的變性，起到穩(wěn)定、減輕的效果，減少外界因素對實(shí)驗(yàn)的干 擾。此外在本發(fā)明實(shí)施例中加入BSA，可增強(qiáng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。Tween-20為聚氧乙烯去水山梨 醇單月桂酸酯和一部分聚氧乙烯雙去水山梨醇單月桂酸酯的混合物，是一種表面活性劑， 在本發(fā)明實(shí)施例中促進(jìn)抗體與抗體的結(jié)合的作用，磷酸鹽緩沖液又稱PBS，是由磷酸二氫鈉 和磷酸氫二鈉組成的溶液，用于樣品的稀釋。疊氮鈉又稱NaN 3，在本發(fā)明實(shí)施例中起到防腐 的作用；所述質(zhì)控線10222、AFP檢測線10223和CEA檢測線10224上包被的抗體均采用包 被緩沖液進(jìn)行稀釋，所述包被緩沖液包括：〇. 08-0. 1% NaN3，余量為0. 01-0. 02M、pH7. 2的 PBS。所述包被膜102為硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜的爬速為95s~135s/4cm。所 述熒光膠乳標(biāo)記的第二AFP單克隆抗體和第二CEA單克隆抗體的濃度均為0. 25-1. Omg/ ml，在試紙條10上的用量均為0. 02-0. 1 yg/cm 2,按5%~30%的比例進(jìn)行稀釋；所述熒 光乳膠標(biāo)記的兔IgG抗體的濃度為0. 25-1. Omg/ml，按5 % -15 %的比例進(jìn)行稀釋，在試紙 條10上的用量為0. 001-0. 025 y g/cm2。所述質(zhì)控線10222上包被的兔IgG抗體的濃度為 0. 25-1. Omg/ml，用量為20 y l/27-35cm ;所述檢測線上包被的AFP單克隆抗體和CEA單克 隆抗體的濃度均為〇. 25-1. 0mg/ml，用量均為20 y l/27-35cm。
[0045] 所述待檢測抗原AFP為人的血液中的甲胎蛋白AFP，所述待檢測抗原CEA為人的 血液中的癌胚抗原CEA，其中，人的血液中可取全血、血清或血漿。所述標(biāo)記線10221和所 述質(zhì)控線10222之間、所述質(zhì)控線10222和所述AFP檢測線10223之間以及所述AFP檢測 線10223和所述CEA檢測線10224之間的間隔設(shè)置為2mm-5mm。此處，間隔間距的設(shè)置考慮 匹配熒光信號讀取儀器裝置在后續(xù)檢測中的使用，當(dāng)間隔間距過短時(shí)，儀器無法區(qū)分出AFP 檢測線和CEA檢測線二者發(fā)出的熒光信號強(qiáng)度，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)間隔間距過長時(shí)，儀器檢 測不到相應(yīng)的熒光信號，同樣也會對實(shí)驗(yàn)造成干擾?；诖耍槍Ρ景l(fā)明AFP檢測線10223 和所述CEA檢測線10224之間的間隔設(shè)置為為宜。匹配與后續(xù)所述熒光膠乳顆粒 的直徑為〇? 1 y m-1 y m，受激發(fā)后發(fā)射的波長為180nm-800nm。本實(shí)驗(yàn)中的第一 AFP單克隆 抗體與第二AFP單克隆抗體與待測AFP抗原結(jié)合時(shí)處于不同表位；同樣，第一 CEA單克隆抗 體與第二CEA單克隆抗體與待測CEA抗原結(jié)合時(shí)處于不同表位。
[0046] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，帶來的技術(shù)效果為：基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測 試劑盒，包括試紙條和卡殼，卡殼設(shè)置于試紙條的外圍，包圍試紙條；試紙條包括底襯以及 設(shè)置于底襯上的包被膜，包被膜上依次設(shè)置有樣品墊、包被線區(qū)和吸水紙；包被線區(qū)依次設(shè) 置為標(biāo)記線、質(zhì)控線、AFP檢測線和CEA檢測線；標(biāo)記線包括被熒光膠乳標(biāo)記的第二AFP單 克隆抗體、第二CEA單克隆抗體和兔IgG抗體，質(zhì)控線包括羊抗兔IgG抗體；AFP檢測線和 CEA檢測線分別包括能與待檢測抗原AFP特異性結(jié)合的第一 AFP單克隆抗體和能與待檢測 抗原CEA特異性結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體。通過AFP與CEA兩項(xiàng)聯(lián)檢，對于腫瘤發(fā)生的判 斷起到協(xié)同互補(bǔ)作用，可以根據(jù)實(shí)際檢測結(jié)果，為腫瘤早期提供輔助判斷，縮短檢測周期， 方便了用戶使用。
[0047] 此外，為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑 盒的制備方法。
[0048] 所述基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒的制備方法包含以下步驟：
[0049] 將稀釋過的標(biāo)記有第二AFP單克隆抗體的熒光膠乳、標(biāo)記有第二CEA單克隆抗體 的熒光膠乳和標(biāo)記有兔IgG抗體的熒光膠乳，劃線包被于包被膜上的包被線區(qū)，形成標(biāo)記 線；
[0050] 稀釋羊抗兔IgG抗體，并將稀釋過的所述兔IgG抗體劃線包被于包被膜上的包被 線區(qū)，形成質(zhì)控線；
[0051] 稀釋能與待檢測抗原AFP特異結(jié)合的第一 AFP單克隆抗體，并將稀釋過的所述能 與待檢測抗原AFP特異結(jié)合的第一 AFP單克隆抗體劃線包被于包被膜上的包被線區(qū)，形成 AFP檢測線；
[0052] 稀釋能與待檢測抗原CEA特異結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體，并將稀釋過的所述能 與待檢測抗原CEA特異結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體劃線包被于包被膜上的包被線區(qū)，形成 CEA檢測線；
[0053] 將包被有所述標(biāo)記線、質(zhì)控線、AFP檢測線和CEA檢測線的包被膜置于烘箱中，進(jìn) 行干燥平衡；
[0054] 將樣品墊和吸水紙依次搭接并粘貼于干燥平衡后的所述包被膜上，所述樣品墊設(shè) 置于所述標(biāo)記線的一端，所述吸水紙?jiān)O(shè)置于所述CEA檢測線的一端；
[0055] 將所述包被膜粘貼于底襯上，形成試紙條；
[0056] 將卡殼設(shè)置于所述試紙條的外圍，包圍所述試紙條。
[0057] 在本實(shí)施例中，參照圖1和圖2,在標(biāo)記線10221的制備過程中，用熒光稀釋液稀 釋標(biāo)記有第二AFP單克隆抗體的熒光膠乳、標(biāo)記有第二CEA單克隆抗體的熒光膠乳和標(biāo) 記有兔IgG抗體的熒光膠乳，劃線于包被膜上形成標(biāo)記線10221 ;其中熒光膠乳標(biāo)記的第 二AFP單克隆抗體和熒光膠乳標(biāo)記的第二CEA單克隆抗體的濃度均為0. 25-1. Omg/ml， 用量均為〇? 02-0. 1 y g/cm2;熒光膠乳標(biāo)記的兔IgG抗體的濃度為0? 25-1. Omg/ml，用 量為0.001-0. 025 yg/cm 2;所述熒光稀釋液中含有1.0% -1.5% BSA，2. 5% -5 %蔗糖， 0? 1% -0? 5% Tween-20,0. 08-0. 1% NaN3,余量為 0? 01-0. 02M、pH7. 2 的 PBS ;質(zhì)控線 10222 和檢測線的制備過程中，用包被緩沖液稀釋兔IgG抗體（購自Hytest公司）、能與待檢 測抗原AFP特異結(jié)合的檢測線上的第一 AFP單克隆抗體（購自杭州啟泰生物技術(shù)有限公 司）、以及能與待檢測抗原CEA特異結(jié)合的檢測線上的第一 CEA單克隆抗體（購自Hytest 公司），并將稀釋后的三種抗體分別依次平行地劃線于包被膜上形成質(zhì)控線10222、AFP 檢測線10223和CEA檢測線10224;其中，質(zhì)控線10222包被的羊抗兔IgG抗體的濃度為 0. 25-1. Omg/ml，用量為20 y l/27-35cm ;AFP檢測線10223包被的第一 AFP單克隆抗體的 濃度為0. 25-1. Omg/ml，用量為20 y l/27-35cm ;CEA檢測線10224包被的第一 CEA單克隆 抗體的濃度為0. 25-1. Omg/ml，用量為20 y l/27-35cm ;所述包被緩沖液中含有0. 08-0. 1 % NaN3，余量為0. 01-0. 02M、pH7. 2的PBS ;所述標(biāo)記線10221和所述質(zhì)控線10222之間、所述 質(zhì)控線10222和所述AFP檢測線之間以及所述AFP檢測線10223和所述CEA檢測線10224 之間的間隔設(shè)置為標(biāo)記線10221、質(zhì)控線10222、AFP檢測線10223、CEA檢測線 10224在包被膜的制備過程中，將包被好標(biāo)記線10221、質(zhì)控線10222、AFP檢測線10223、CEA 檢測線10224的包被膜置于濕度〈30%的烘箱，且烘箱的溫度設(shè)定在35-45°(：，干燥24-3611 后，于2°C -30°C密封干燥平衡7天以上。在試紙條的制備過程中，將樣品墊1021和吸水紙 1023依次搭接并粘貼于干燥平衡后的包被膜102上，在包被膜102靠近CEA檢測線10224 的一端搭接粘貼吸水紙1023,即可制成試紙條10。將得到的試紙條10與預(yù)制成的卡殼20 相匹配，即可得到試劑盒。
[0058] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光膠乳標(biāo)記抗體的制備步驟為：將常規(guī)方法共價(jià)活 化后的熒光膠乳超聲波200W-400W處理20-30秒后，按照50-200 y g標(biāo)記抗體/100 y 1熒 光膠乳的比例加入第二AFP單克隆抗體（購自杭州啟泰生物技術(shù)有限公司）、第二CEA單克 隆抗體（購自Hytest公司）和兔IgG抗體（購自Hytest公司），混勾后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h， 離心洗滌3次，每次10000-15000xg、離心10min，沉淀用PBS-TBN溶解并超聲波100W處理 30s，用PBS-TBN恢復(fù)離心前體積，4°C保存，備用。
[0059] 本發(fā)明所述基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒原理是雙抗夾心法；首先將直 徑范圍0. 01um-l. 5um的膠乳與AFP抗體以及各類不同的熒光素共價(jià)結(jié)合形成物質(zhì)A，然后 將直徑范圍0. 〇lum-l. 5um的膠乳與CEA抗體以及各類不同的熒光素共價(jià)結(jié)合形成物質(zhì)B， 由于膠乳本身具有羧基、氨基等基團(tuán)，當(dāng)物質(zhì)A再與相應(yīng)的AFP抗原結(jié)合，利用熒光素在激 發(fā)光下發(fā)射熒光；同樣，當(dāng)物質(zhì)B再與相應(yīng)的CEA抗原結(jié)合，利用熒光素在激發(fā)光下也可以 發(fā)射熒光。當(dāng)熒光膠乳標(biāo)記的第二AFP抗體與檢測樣品（例如：血液中的全血、血清或血 漿）中的足夠的AFP抗原結(jié)合形成復(fù)合物A1，該復(fù)合物A1在層析的作用下轉(zhuǎn)移至AFP檢測 線處，與第一 AFP抗體（該抗體會結(jié)合在AFP抗原的另一表位上）結(jié)合，從而形成雙抗體夾 心的復(fù)合物A2,該復(fù)合物A2聚集在此處后，受到光源激發(fā)釋放出相應(yīng)波長的發(fā)射光，將該 試紙條放于專門的熒光信號讀取儀器中，即可讀取熒光信號的大小，從而進(jìn)行定量測定。同 樣的當(dāng)熒光膠乳標(biāo)記的第二CEA抗體與檢測樣品（例如：血液中的全血、血清或血漿）中的 足夠的CEA抗原結(jié)合形成復(fù)合物B1，該復(fù)合物B1在層析的作用下轉(zhuǎn)移至CEA檢測線處，與 第一 CEA抗體（該抗體會結(jié)合在CEA抗原的另一表位上）結(jié)合，從而形成雙抗體夾心的復(fù) 合物B2,該復(fù)合物B2聚集在此處后，受到光源激發(fā)釋放出相應(yīng)波長的發(fā)射光，將該試紙條 放于專門的熒光信號讀取儀器中，即可讀取熒光信號的大小，從而進(jìn)行定量測定。
[0060] 熒光信號讀取儀器的主要工作原理是該儀器的熒光光源系統(tǒng)能夠發(fā)出單色激發(fā) 光，照射在待檢測的試紙條AFP檢測線和CEA檢測線處，此時(shí)檢測線AFP和CEA通過反應(yīng)凝 集的熒光乳膠在單色激發(fā)光的作用下，發(fā)出熒光信號，該熒光信號被該儀器的檢測系統(tǒng)捕 獲，檢測系統(tǒng)接收熒光信號后，由檢測系統(tǒng)中的光電倍增管實(shí)現(xiàn)光信號的放大，然后由該儀 器的固態(tài)檢測器進(jìn)行光電信號的轉(zhuǎn)化，由電信號讀出電路將電信號輸出，再有自動軟件分 析控制系統(tǒng)處理，在顯示屏處顯示結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)對樣品的精確定量。
[0061 ] 1、用德靈DN-100特種蛋白測定儀對134例臨床AFP和CEA樣本（例如：血液中的 全血、血清或血漿）作為檢測標(biāo)準(zhǔn)，表1采用本發(fā)明較佳實(shí)施例的試劑盒對10個(gè)樣本的AFP 定量測定結(jié)果；表2采用本發(fā)明較佳實(shí)施例的試劑盒對10個(gè)樣本的CEA定量測定結(jié)果。 [0062] 表1采用本發(fā)明較佳實(shí)施例的試劑盒對10個(gè)樣本的AFP定量測定結(jié)果
[0064] 表2采用本發(fā)明較佳實(shí)施例的試劑盒對10個(gè)樣本的CEA定量測定結(jié)果
[0066] 從表1和表2可知，采用較佳實(shí)施例的試劑盒對樣本進(jìn)行測定時(shí)，可以得到與檢測 標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，說明本發(fā)明的試劑盒可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量測量。
[0067] 2、對試劑盒進(jìn)行性能方面的測定一最低檢測限度
[0068] 圖3為采用本發(fā)明基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒與德靈儀器針對相同 臨床樣本測量出的AFP的相關(guān)性圖；圖4為采用本發(fā)明基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試 劑盒與德靈儀器針對相同臨床樣本測量出的CEA的相關(guān)性圖。參照圖3和圖4,在本實(shí)施例 中，AFP以德靈公司的特種蛋白分析儀測試60份臨床樣本（例如：血液中的全血、血清或血 漿），這兩種產(chǎn)品的結(jié)果相關(guān)系數(shù)為R2>0. 996,且Y = 0. 05+0. 984X ;CEA以德靈公司的特種 蛋白分析儀測試60份臨床樣本（例如：血液中的全血、血清或血漿），這兩種產(chǎn)品的結(jié)果相 關(guān)系數(shù)為R2>0. 994,，且Y = 0. 263+0. 983X ;因此，該實(shí)施例的試劑盒跟對照試劑的相關(guān)性 好，AFP的最低檢測限度為0. 05mg/l，CEA的最低檢測限度為0. lng/1。
[0069] 3、對試劑盒進(jìn)行性能方面的測定一精密度
[0070] 采用較佳實(shí)施例的試劑盒對含量分別是高值、低值和中值的樣本，連續(xù)至少檢測 10次，計(jì)算變異系數(shù)（CV)。
[0071] 對于AFP含量的較高值選擇為（115.01mg/l)、中值選擇為（16. 14mg/l)、低 值選擇為（〇.41mg/l)，將上述3個(gè)血液樣本分別測定10次，根據(jù)其測定數(shù)據(jù)，利用 SPSS軟件統(tǒng)計(jì)得出高值（115.54±9. 13mg/l)，CV 2.41% ;同樣的利用SPSS軟件統(tǒng)計(jì) 得出中值（16. 2±0.82mg/l)，CV 3.06% ;同樣的利用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)得出低值選擇為 (0.41±0.03mg/l)，CV 2. 1% ;;檢測結(jié)果 CV 值均小于 12%。
[0072] 對于CEA含量的較高值選擇為（42. 51mg/l)、中值選擇為（5.4mg/l)、低值選 擇為（0. 40mg/l)，將上述3個(gè)血液樣本分別測定10次，根據(jù)其測定數(shù)據(jù)，利用SPSS軟 件統(tǒng)計(jì)得出高值（42. 51 ±4. 74mg/l)，CV 3.21% ;同樣的利用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)得出中值 (5. 4±0. 51mg/l)，CV 3. 3% ;同樣的利用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)得出低值選擇為（0? 40±0. 05mg/ 1)，CV 2.40%;;檢測結(jié)果CV值均小于12%。以上結(jié)果說明較佳實(shí)施例的試劑盒的精密 度良好。
[0073] 本發(fā)明實(shí)施例基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒，包括試紙條和卡殼，卡殼 設(shè)置于試紙條的外圍，包圍試紙條；試紙條包括底襯以及設(shè)置于底襯上的包被膜，包被膜上 依次設(shè)置有樣品墊、包被線區(qū)和吸水紙；包被線區(qū)依次設(shè)置為標(biāo)記線、質(zhì)控線、AFP檢測線 和CEA檢測線；標(biāo)記線包括被熒光膠乳標(biāo)記的第二AFP單克隆抗體、第二CEA單克隆抗體和 兔IgG抗體，質(zhì)控線包括羊抗兔IgG抗體;AFP檢測線和CEA檢測線分別包括能與待檢測抗 原AFP特異性結(jié)合的第一 AFP單克隆抗體和能與待檢測抗原CEA特異性結(jié)合的第一 CEA單 克隆抗體。通過AFP與CEA兩項(xiàng)聯(lián)檢，對于腫瘤發(fā)生的判斷起到協(xié)同互補(bǔ)作用，可以根據(jù)實(shí) 際檢測結(jié)果，為腫瘤早期提供輔助判斷，縮短檢測周期，增加了檢測的靈敏度，方便了用戶 使用。
[0074] 以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā) 明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技 術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒，其特征在于，所述基于生物標(biāo)志物的 腫瘤早期檢測試劑盒包括試紙條和卡殼： 所述卡殼設(shè)置于所述試紙條的外圍，包圍所述試紙條； 所述試紙條包括底襯以及設(shè)置于所述底襯上的包被膜，所述包被膜上依次設(shè)置有樣品 墊、包被線區(qū)和吸水紙； 所述包被線區(qū)依次設(shè)置有標(biāo)記線、質(zhì)控線、AFP檢測線和CEA檢測線。2. 如權(quán)利要求1所述的基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒，其特征在于，所述AFP 檢測線包括能與待檢測抗原AFP特異性結(jié)合的第一 AFP單克隆抗體；所述CEA檢測線包括 能與待檢測抗原CEA特異性結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體。3. 如權(quán)利要求2所述的基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒，其特征在于，所述待 檢測抗原AFP為人源AFP，所述待檢測抗原CEA為人源CEA。4. 如權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒，其特征在 于，所述標(biāo)記線包括被熒光膠乳標(biāo)記的第二AFP單克隆抗體、第二CEA單克隆抗體和兔IgG 抗體。5. 如權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒，其特征在 于，所述質(zhì)控線包括羊抗兔IgG抗體。6. 如權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒，其特征在 于，所述卡殼包括加樣區(qū)和視窗區(qū)： 所述加樣區(qū)設(shè)置于所述試紙條的樣品墊處，用于滴加樣品； 所述視窗區(qū)設(shè)置于所述試紙條的包被線區(qū)，用于觀測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。7. 如權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒，其特征在 于，所述標(biāo)記線和所述質(zhì)控線之間、所述質(zhì)控線和所述AFP檢測線之間以及所述AFP檢測線 和所述CEA檢測線之間的間隔設(shè)置為2mm-5mm。8. -種基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，所述腫瘤早 期檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟： 將稀釋過的標(biāo)記有第二AFP單克隆抗體的熒光膠乳、標(biāo)記有第二CEA單克隆抗體的熒 光膠乳和標(biāo)記有兔IgG抗體的熒光膠乳，劃線包被于包被膜上的包被線區(qū)，形成標(biāo)記線； 稀釋羊抗兔IgG抗體，并將稀釋過的所述羊抗兔IgG抗體劃線包被于包被膜上的包被 線區(qū)，形成質(zhì)控線； 稀釋能與待檢測抗原AFP特異結(jié)合的第一 AFP單克隆抗體，并將稀釋過的所述能與待 檢測抗原AFP特異結(jié)合的第一 AFP單克隆抗體包被于包被膜上的包被線區(qū)，形成AFP檢測 線； 稀釋能與待檢測抗原CEA特異結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體，并將稀釋過的所述能與待 檢測抗原CEA特異結(jié)合的第一 CEA單克隆抗體劃線包被于包被膜上的包被線區(qū)，形成CEA 檢測線； 將包被有所述標(biāo)記線、質(zhì)控線、AFP檢測線和CEA檢測線的包被膜置于烘箱中，進(jìn)行干 燥平衡； 將樣品墊和吸水紙依次搭接并粘貼于干燥平衡后的所述包被膜上，所述樣品墊設(shè)置于 所述標(biāo)記線的一端，所述吸水紙?jiān)O(shè)置于所述CEA檢測線的一端； 將所述包被膜粘貼于底襯上，形成試紙條； 將卡殼設(shè)置于所述試紙條的外圍，包圍所述試紙條。9. 如權(quán)利要求8所述的基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述待檢測抗原AFP為人源AFP，所述待檢測抗原CEA為人源CEA。10. 如權(quán)利要求8或9所述的基于生物標(biāo)志物的腫瘤早期檢測試劑盒的制備方法，其 特征在于，所述標(biāo)記線和所述質(zhì)控線之間、所述質(zhì)控線和所述AFP檢測線之間以及所述AFP 檢測線和所述CEA檢測線之間的間隔設(shè)置為2_-5_。
【文檔編號】G01N33/574GK105891481SQ201510292617
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年5月30日
【發(fā)明人】張貫京, 陳興明, 葛新科, 克里斯基捏·普拉紐克, 艾琳娜·古列莎, 王海榮, 張少鵬, 方靜芳, 高偉明, 程金兢, 梁艷妮, 周榮, 李慧玲, 邢立立, 波達(dá)別特·伊萬, 徐之艷, 周亮, 梁昊原, 肖應(yīng)芬, 鄭慧華, 唐小浪, 李瀟云
【申請人】深圳市貝沃德克生物技術(shù)研究院有限公司