一種半定量檢測α-葡聚糖的膠體金試紙條及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設及一種半定量檢測a-葡聚糖的膠體金試紙條及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 日-葡聚糖(dextran)又稱右旋糖酢，是一類D-化喃葡萄糖的聚合物的總稱，通過a-1，6糖巧鍵形成主鏈，少量的支鏈部分則由a-1，2, Q-I，3和a-l，4糖巧鍵形成。分子 式為（C出10〇5) n，分子量一般由數(shù)萬到數(shù)百萬，從可溶性小分子到不可溶的高分子，呈膠粘 狀，粘度隨分子量和濃度的增加而增加。Q-葡聚糖呈白色粉末狀，無臭、無味，通?？扇苡?水、薦糖溶液、氯化鋼溶液中，溶解性隨分子量和濃度的增加而下降。不溶于乙醇，常溫穩(wěn) 定，加熱逐漸變色或分解。用稀酸水解后，得部分解聚產(chǎn)物;若長時間水解，可得葡萄糖。右 旋糖酢經(jīng)堿性降解反應，產(chǎn)物的粘度隨水解時間的長短而顯著不同。Q-葡聚糖是最早發(fā)現(xiàn) 的微生物多糖，是世界上第一個工業(yè)化生產(chǎn)的微生物多糖，也是美國FDA批準的第一種可 用于食品的微生物胞外多糖。
[0003] 在甘薦制糖生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的a-葡聚糖，俗稱"薦飯"。新鮮甘薦中a-葡聚糖的含 量很少，幾乎為零。但甘薦如受到刀傷或壓傷、病蟲害、火燒、霜凍或在收割后放置長時間， 就會受到腸膜明串珠菌化euconostoc mesnteroides)、鏈球菌屬（Sheptococcus)等微生 物的感染而形成葡聚糖。運些微生物在適宜的溫度和濕度下，能夠分泌葡聚糖薦糖酶 (dextransucrose)，催化薦糖生成葡萄糖并聚合而生成多糖體，從而產(chǎn)生a-葡聚糖。從薦汁 到精制產(chǎn)品，制糖工藝過程自始至終存在著Q-葡聚糖引起的不良影響。薦汁中Q-葡聚糖的 存在意味著糖分轉(zhuǎn)化損失，粘度增大，澄清、過濾、蒸發(fā)、煮糖(結(jié)晶）、分蜜受影響，收回降 低，成本增加，產(chǎn)品質(zhì)量下降，影響產(chǎn)品的適用性。因此，O-葡聚糖的監(jiān)測成為糖廠生產(chǎn)控制 的一個重要技術(shù)。
[0004] 制糖工業(yè)中a-葡聚糖的測定一般可用化ze^CUMSA法、Robed' S銅法、Potical Activity Ltd.DASA法、酶解法等，但運些方法都有較大的局限性，如準確度不高、操作繁 瑣、不適用所有糖品等缺點。其中測定Q-葡聚糖的兩個主流方法，HAZE法和Robeds方法，或 者基于運兩種原理的衍生方法，都屬于化學測定法。運兩種測試方法都要利用到O-葡聚糖 在酒精溶液中沉淀的特性。Q-葡聚糖的運些定量測定方法在長期W來的應用中存在可靠 性、精確性、特異性均不高，價格昂貴和操作繁瑣費時的缺點。而高效液相色譜法，則存在著 儀器設備要求高，測試時間長，樣本處理難的問題。
[0005] 膠體金免疫層析技術(shù)作為一種檢測技術(shù)，其特點是方便快捷，除少量試劑外無需 任何儀器設備，幾分鐘即可肉眼觀察結(jié)果。膠體金試紙條的樣品前處理簡單，抗干擾能力 強，能滿足分析要求，適用于大量樣品的定性和半定量初篩。本發(fā)明的半定量檢測O-葡聚糖 的膠體金試紙條具有化ISA方法的高靈敏度，大幅降低檢測成本。對于在制糖行業(yè)中便捷、 準確檢測原料、中間物料、產(chǎn)品及副產(chǎn)品中的O-葡聚糖是很有意義的。檢索結(jié)果表明，尚未 有半定量檢測O-葡聚糖濃度的方法，也沒有利用膠體金法對O-葡聚糖進行半定量檢測的報 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種半定量檢測a-葡 聚糖的膠體金試紙條及檢測方法。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種半定量檢測O-葡聚糖的膠體金試紙條，包括底板，底板上依次相連的樣品墊、金標 墊、反應膜W及吸樣墊，在金標墊上包被有膠體金標記的抗a-葡聚糖的單克隆抗體或抗a-葡聚糖的多克隆抗體;所述反應膜位于金標墊一端設有檢測區(qū)，遠離金標墊一端設有質(zhì)控 區(qū)，所述檢測區(qū)上設置了 1條或多條互相平行的檢測線，檢測線上包被有抗Q-葡聚糖的單克 隆抗體或抗O-葡聚糖的多克隆抗體。
[0008] 所述質(zhì)控區(qū)設置有質(zhì)控線，質(zhì)控線上包被有羊抗鼠抗體IgG。
[0009] 所述抗a-葡聚糖的單克隆抗體的制備方法為： 1) 將Q-葡聚糖與蛋白混合，用水溶解，冷凍干燥，研磨成粉； 2) 將粉末置于50~60°C的恒溫，反應至少3天，得到a-葡聚糖-蛋白交聯(lián)物； 3) 將a-葡聚糖-蛋白交聯(lián)物與佐劑混合，乳化，注射到動物體內(nèi)； 4) 選取血清效價高的動物體，取其脾細胞制成懸液，并與對數(shù)生長期的瘤細胞混合，介 導融合、篩選得到可W分泌O-葡聚糖特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株； 5) 使用雜交瘤細胞生產(chǎn)得到a-葡聚糖特異性單克隆抗體或使用腹水法生產(chǎn)得到a-葡 聚糖特異性單克隆抗體。
[0010] 作為優(yōu)選的，所述蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白中的一種。
[0011] 作為優(yōu)選的，所述a-葡聚糖的分子量在10~2000kDa。
[0012] 作為優(yōu)選的，所述抗a-葡聚糖的單克隆抗體由雜交瘤細胞株D9分泌得到，所述雜 交瘤細胞株D9已于2010年12月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號為CCTCC NO: C2010107。
[OOU] -種檢測a-葡聚糖的試劑盒，包括外盒體和盒內(nèi)支架，其特征在于:所述盒內(nèi)支架 上設置有試紙條凹槽可放置膠體金試紙條。
[0014] 作為優(yōu)選的，所述盒內(nèi)支架上還設置有若干試劑管孔，孔內(nèi)放置有試劑管，試劑管 中分別盛裝的試劑包括O-葡聚糖標準品溶液、樣品稀釋液。
[0015] 本發(fā)明半定量檢測a-葡聚糖的膠體金試紙條的原理是：用膠體金標記抗a-葡聚糖 的單克隆抗體，將該金標抗體包被于金標墊上。在檢測線上包被有一定量的抗Q-葡聚糖的 單克隆抗體。當將待檢樣品到達金標墊后，若樣品中含有O-葡聚糖，則與膠體金標記的抗體 結(jié)合，形成抗原抗體膠體金標記復合物。該復合物泳動到檢測線時會被檢測線的抗O-葡聚 糖的單克隆抗體所捕獲，形成雙抗體夾屯、復合物，聚集在檢測線上而顯色。若樣品中所含的 a-葡聚糖低于一定的量，則形成復合物后泳動到檢測線時形成的雙抗體夾屯、復合物過少， 不能夠在檢測線顯色。
[0016] 通過在試紙條上設置多條間隔的檢測線，可W實現(xiàn)a-葡聚糖的半定量檢測。制作 該試紙條時，通過限定各檢測線上包被的抗體量，使得每條檢測線能夠結(jié)合一定量的抗原 抗體膠體金標記復合物。距離膠體金墊由近到遠，檢測線顯色時所代表的a-葡聚糖含量依 次增加。根據(jù)檢測結(jié)果中出現(xiàn)檢測線的數(shù)量，判斷樣品中O-葡聚糖的濃度范圍。
[0017] 本發(fā)明的膠體金檢測試紙條特異性強、靈敏度高、操作簡便，能夠?qū)崿F(xiàn)對a-葡聚糖 快速檢測。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明膠體金試紙條結(jié)構(gòu)示意圖（1為樣品墊，2為金標墊，3為反應膜，4為檢 測線，5為質(zhì)控線，6為吸樣墊）； 圖2為檢測結(jié)果示意圖（a-葡聚糖濃度小于5ng/ml); 圖3為檢測結(jié)果示意圖（a-葡聚糖濃度為5-20ng/ml); 圖4為檢測結(jié)果示意圖（a-葡聚糖濃度為20-5化g/ml); 圖5為檢測結(jié)果示意圖（a-葡聚糖濃度大于50ng/ml)。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0020] 實施例1 : a-葡聚糖金標檢測試紙的制備方法 1.膠體金的制備： 采用巧樣酸S鋼還原法制備膠體金。取50ml O.lmg/ml的氯金酸溶液，100 r/min攬 拌，加熱至沸騰，加入2ml lOmg/ml巧樣酸鋼溶液，保持原有的反應溫度和攬拌速度，繼續(xù)沸 騰反應5min，至溶液顏色剛剛變?yōu)榍辶灵偌t色后停止反應。冷卻，并置于棟色瓶中4°C避光 保存。經(jīng)電鏡檢測，膠體金粒徑為10-15nm。
[0021] 2. a-葡聚糖-BSA交聯(lián)物的制備 將日-葡聚糖Dextran T-40與BSA按1:1比例混合，用水溶解調(diào)至6% (