一種檢測(cè)鉛的生物傳感器及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)鉛的生物傳感器及檢測(cè)方法，屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]鉛是一種最為常見的重金屬元素之一，具有較強(qiáng)毒性，對(duì)環(huán)境與人類造成的危害已引起全球的廣泛關(guān)注。環(huán)境中的鉛具有持久性和高度的生物富集性，對(duì)其產(chǎn)生經(jīng)久不衰的污染。進(jìn)入人體中的鉛，對(duì)人類健康產(chǎn)生極大的危害。當(dāng)人體內(nèi)鉛含量超過一定水平時(shí)，會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害，特別是嬰幼兒。嬰幼兒體內(nèi)鉛含量超標(biāo)時(shí)，影響其智力與生長(zhǎng)發(fā)育，并損傷其認(rèn)知能力、神經(jīng)行為和學(xué)習(xí)記憶等腦功能，嚴(yán)重者造成癡呆。因此，建立高靈敏度、高選擇性的鉛離子檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]傳統(tǒng)的鉛檢測(cè)方法:原子吸收光譜、雙硫腙比色、原子發(fā)射光譜、電感耦合等離子體質(zhì)譜、原子熒光光譜和氣相色譜法等，這些方法雖準(zhǔn)確可靠，但在實(shí)際應(yīng)用中需要昂貴復(fù)雜的儀器設(shè)備以及專業(yè)技術(shù)人員，費(fèi)力費(fèi)時(shí)，難以滿足大規(guī)模應(yīng)用及實(shí)時(shí)原位檢測(cè)的需要。所以研究出一種快速、簡(jiǎn)便、低成本、高靈敏度的鉛離子檢測(cè)手段具有十分重要的意義。
[0004]現(xiàn)今，新型的鉛離子檢測(cè)技術(shù)有化學(xué)傳感器和生物傳感器技術(shù)，其中功能核酸類生物傳感器具有選擇性好、信號(hào)轉(zhuǎn)換容易等特點(diǎn)而漸成焦點(diǎn)。用于檢測(cè)鉛的一類功能核酸為富含鳥嘌呤(G)的單鏈寡核苷酸，鉛離子可以促進(jìn)寡核苷酸形成G-四聯(lián)體機(jī)構(gòu)，結(jié)合G-四聯(lián)體的相關(guān)特性選擇合適的信號(hào)輸出方法，可達(dá)到檢測(cè)鉛的目的。寡核苷酸具有合成成本低，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，因而成為研究的熱點(diǎn)。
[0005]石英晶體微天平(QCM)具有靈敏度高，體積小、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)費(fèi)用低、能實(shí)時(shí)在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，若QCM直接用于鉛離子檢測(cè)，由于金屬鉛分子量比較小，檢測(cè)靈敏度不高。利用功能核酸形成G-四聯(lián)體與QCM技術(shù)相結(jié)合檢測(cè)鉛離子的方法尚沒有報(bào)道。因此，結(jié)合功能核酸形成G-四聯(lián)體，利用QCM的高靈敏度實(shí)現(xiàn)鉛離子的檢測(cè)研究非常必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高的用于檢測(cè)鉛的生物傳感器及檢測(cè)方法。
[0007]參見圖1，本發(fā)明的檢測(cè)原理為:以石英晶體微天平(QCM)金電極為測(cè)定電極，通過QCM金電極表面自組裝巰基修飾的功能核酸1與帶巰基的寡核苷酸修飾的納米金3構(gòu)建鉛離子的檢測(cè)體系。金電極的表面可以用6-巰基己醇2對(duì)其空位進(jìn)行封閉。當(dāng)檢測(cè)體系中沒有鉛離子4時(shí)，納米金3上的寡核苷酸與功能核酸1互補(bǔ)配對(duì)，電極表面質(zhì)量發(fā)生明顯變化，使其頻率變?。划?dāng)檢測(cè)體系加入鉛離子4后，鉛離子4促使電極表面的功能核酸1形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)5，使得這部分功能核酸1不能與寡核苷酸互補(bǔ)配對(duì)，電極表面質(zhì)量變化不明顯，頻率變化不顯著，基于QCM電極的頻率信號(hào)與鉛離子濃度成反比，則通過確定電極的頻率信號(hào)實(shí)現(xiàn)鉛離子的定量檢測(cè)。
[0008]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測(cè)鉛的生物傳感器，包括測(cè)定電極和測(cè)定溶液兩部分。
[0009]其中，測(cè)定電極的制備過程如下:
[0010]將鍍金石英晶振片用piranha溶液(濃H2S0# 30 % Η 202按照3:1 (V/V)的比例混合均勻)清洗，干燥后，將經(jīng)三-(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)還原的功能核酸溶液滴在晶振片上反應(yīng)完成自組裝，為封閉晶振片的空位，再滴加6-巰基己醇反應(yīng)，清洗干燥后，冷減備用。
[0011]其中，測(cè)定溶液的制備過程如下:
[0012]將四氯金酸加熱至沸騰，加入檸檬酸二鈉溶液，加熱反應(yīng)后，冷卻至室溫，制得納米金溶液，加入經(jīng)巰基修飾的寡核苷酸，反應(yīng)后，加入Tris-HCl緩沖液老化，使寡核苷酸在納米金表面呈線性排列；最后離心沉淀，并使用HEPES緩沖液清洗，再經(jīng)離心后將沉淀物分散于HEPES緩沖溶液中，冷藏備用。
[0013]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的功能核酸序列為:5’ -SH-TTTTTTACCCAGGGTGGGTGGGTGGGT-3’(QPB1)，所述的寡核苷酸序列為:5’ -SH-TTTTTTACCCACCCA-3’(QPB2)。
[0014]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所制得的納米金溶液中金粒子的平均粒徑為12±3nm。該粒徑的金粒子在溶液中具有很好的分散性和懸浮性，易與寡核苷酸進(jìn)行結(jié)合。
[0015]在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，其中測(cè)定溶液中納米金與寡核苷酸的摩爾比為1:50?100。在該比例范圍內(nèi)，能確保測(cè)定溶液中的納米金粒子充分與寡核苷酸結(jié)合。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種利用上述的生物傳感器檢測(cè)鉛離子的檢測(cè)方法，包括步驟:
[0017](1)將所述測(cè)定電極在QCM上檢測(cè)其頻率，記做F。；
[0018](2)在所述測(cè)定電極上滴加預(yù)先配置好的已知濃度的鉛離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，反應(yīng)后，鉛離子使得晶振片上的功能核酸形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，經(jīng)清洗干燥后，再滴加所述測(cè)定溶液，反應(yīng)后，納米金上的寡核苷酸與晶振片上未結(jié)合鉛離子的功能核酸互補(bǔ)配對(duì)，將納米金牢固吸附于晶振片表面，清洗干燥后，利用QCM檢測(cè)其頻率，記做F1;重復(fù)上述步驟，獲得一系列不同濃度的鉛離子標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的晶振片的頻率變化Λ F，計(jì)算Λ F =匕-Fi，并以不同濃度的鉛離子與對(duì)應(yīng)的頻率變化作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0019](3)將待測(cè)溶液按步驟(2)所述的步驟測(cè)試其AF ;比照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測(cè)溶液中的鉛離子濃度。
[0020]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:AF = -0.0708CPb+17.035，其中:Λ F為頻率變化，單位為Hz，CPb鉛離子濃度，單位為nM。
[0021]本發(fā)明的生物傳感器用來測(cè)定水體鉛離子的濃度范圍為0_200nM，最低檢測(cè)限為
0.5nM0
[0022]本發(fā)明提供的生物傳感器及檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單、成本低廉、檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)鉛離子的高效檢測(cè)。
【附圖說明】
[0023]圖1為根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)原理示意圖，其中1:功能核酸，2:6_巰基己醇，3:修飾的納米金，4:鉛離子，5:G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)；
[0024]圖2為不同濃度的鉛離子引起的頻率變化標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0025]圖3為干擾離子引起的頻率變化與空白頻率變化的差值；
[0026]圖4a為晶振片與鉛反應(yīng)前的SEM電鏡圖；
[0027]圖4b為晶振片與鉛反應(yīng)后的SEM電鏡圖。
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