一種納米粒子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物治療技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種納米粒子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤作為威脅人類生命的頑疾之一，它的準(zhǔn)確檢測(cè)和有效治療一直是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng) 域的研究重點(diǎn)。盡管近年來(lái)已經(jīng)付出了巨大的努力去尋找有效的癌癥診斷方法和治療方 法，但目前為止，癌癥仍然是全球公共衛(wèi)生的一個(gè)重要的挑戰(zhàn)。治療腫瘤的關(guān)鍵在于早期診 斷，早期腫瘤絕大多數(shù)治愈率在90%以上。早期診斷困難和缺乏有效的治療和預(yù)防方法導(dǎo) 致了腫瘤的高死亡率。在臨床上，目前腫瘤的診斷方法主要有病理診斷、X線、B超、CT和 NMRI等方法。其中，病理診斷較準(zhǔn)確，但其準(zhǔn)確性受醫(yī)務(wù)工作者的經(jīng)驗(yàn)影響，因此容易誤診、 漏診；X線、B超和NMRI等方法受分辨率的影響，早期腫瘤很難檢測(cè)出來(lái)，并且MRI很昂貴， 因此很難用于癌癥的廣泛篩查；CT和MRI等方法所用的造影劑會(huì)殘留在體內(nèi)，從而對(duì)人體 產(chǎn)生危害；免疫熒光分析通常用于高危人群的癌癥篩查，但是由于個(gè)體變異、陽(yáng)性率低、耗 時(shí)和缺少標(biāo)準(zhǔn)的方法等缺陷使得該方法不能被廣泛應(yīng)用。最近，對(duì)于癌癥生物標(biāo)記物的檢 測(cè)在癌癥的早期診斷中起到了很大的作用。在臨床上，一般認(rèn)為病理的免疫組織化學(xué)方法 是確診癌癥的最準(zhǔn)確的方法，但是這種方法比較耗時(shí)，并且需要做浸入性手術(shù)取病理組織， 這對(duì)病人來(lái)說(shuō)也是一種損傷。因此尋找一種普遍的早期診斷腫瘤的方法尤為重要，是廣大 醫(yī)務(wù)工作者研究的熱門課題之一。
[0003] 貴金屬納米材料由于具有獨(dú)特的尺寸、形貌、組成和等離子基元光學(xué)性質(zhì)，在諸多 領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，比如超靈敏（生物）檢測(cè)、納米醫(yī)學(xué)、納米電子學(xué)以及太陽(yáng)能電池 等。設(shè)計(jì)精細(xì)的plasmonic納米結(jié)構(gòu)，可以使貴金屬納米材料在上述領(lǐng)域的應(yīng)用前景更為 突出。近年來(lái)，在合成及設(shè)計(jì)具有plasmonic性質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)的眾多方法中，酶生化反應(yīng)與 納米粒子雜化體系由于其在生物傳感及生物電子學(xué)等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用而備受關(guān)注。通過(guò)納 米粒子與生物體系（如蛋白質(zhì)、DNA、細(xì)胞等）之間的相互作用，構(gòu)建的一系列納米-生物界 面，為實(shí)際生物學(xué)應(yīng)用提供了重要的基礎(chǔ)平臺(tái)。因此，原位表征固-液界面的性質(zhì)，對(duì)于研 究納米/生物界面來(lái)說(shuō)意義重大，且充滿挑戰(zhàn)。
[0004] 日益成熟的納米技術(shù)與臨床醫(yī)學(xué)的結(jié)合提供了一些相應(yīng)的檢測(cè)手段，但由于價(jià)格 等諸多因素很難作為常規(guī)手段應(yīng)用于臨床。近年來(lái)，納米材料和具有不同形狀和成分的多 功能納米平臺(tái)被廣泛應(yīng)用于癌癥診斷、藥物傳送和癌癥治療。尤其金納米粒子由于其具有 獨(dú)特的等離激元光學(xué)、光熱特性以及很好的生物相容性已被廣泛的關(guān)注。雙金屬納米粒子， 尤其是貴金屬核-殼納米結(jié)構(gòu)，由于其納米尺度的結(jié)構(gòu)及局域電場(chǎng)更易于調(diào)整，故比對(duì)應(yīng) 的單組分納米結(jié)構(gòu)有更為突出的物理化學(xué)性質(zhì)，這也使得雙金屬納米粒子在超靈敏檢測(cè)及 生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用更為廣泛。
[0005] 具有plasmonic性質(zhì)的貴金屬納米材料，尤其是Ag和Au納米粒子，由于其局域表 面等離子體共振（LSPR)導(dǎo)致的獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，目前已被廣泛應(yīng)用于超靈敏（生物）傳感 分析、納米醫(yī)學(xué)、光電子學(xué)、太陽(yáng)能電池等諸多領(lǐng)域。更為值得注意的是，這些納米粒子基于 其可精細(xì)調(diào)整的plasmonic性質(zhì)，使得它們?cè)谏鲜鲅芯款I(lǐng)域的進(jìn)展中起著革命性的作用。LSPR的頻率（亦即波長(zhǎng)）在很大程度上依賴于納米粒子的形貌、粒子間的間距以及納米粒 子周圍的介電環(huán)境，這也是納米粒子用于超靈敏檢測(cè)及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)酶活性的重要依據(jù)。由具 有LSPR性質(zhì)的Ag、Au雙組分構(gòu)成的雙金屬納米粒子的光學(xué)（plasmonic)及化學(xué)性質(zhì)比單 組分納米粒子更為突出，因此Ag/Au雙金屬納米結(jié)構(gòu)被更多的應(yīng)用于超靈敏檢測(cè)及生物傳 感等領(lǐng)域。將雜化納米粒子的組成及結(jié)構(gòu)變化有機(jī)地融入納米plasmonic傳感技術(shù)中，可 以有效地?cái)U(kuò)展新型超靈敏光學(xué)檢測(cè)平臺(tái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種納米粒子，本申請(qǐng)?zhí)峁┑募{米粒子能夠用于 葡萄糖的檢測(cè)，最終實(shí)現(xiàn)在制備癌癥早期診斷和/或治療制劑中的應(yīng)用。
[0007] 有鑒于此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N納米粒子的制備方法，包括：
[0008] 將Ag/Au雙金屬納米粒子、緩沖溶液、帶正電荷的聚合物與葡萄糖氧化酶溶液混 合，靜置，得到納米粒子。
[0009] 優(yōu)選的，所述混合的過(guò)程具體為：
[0010] 將Ag/Au雙金屬納米粒子分散于緩沖溶液中，調(diào)節(jié)溶液的pH至6~7,再將帶正電 荷的聚合物加入到得到的溶液中，靜置后再加入葡萄糖氧化酶溶液。
[0011] 優(yōu)選的，所述緩沖溶液為磷酸鹽。
[0012] 優(yōu)選的，所述帶正電荷的聚合物為聚-L-組氨酸。
[0013] 優(yōu)選的，所述靜置之后還包括：
[0014] 將靜置后的納米粒子分散于緩沖溶液中。
[0015] 本申請(qǐng)還提供了上述方案所制備的納米粒子用于葡萄糖的檢測(cè)。
[0016] 本申請(qǐng)還提供了上述方案所制備的所述的納米粒子在制備癌癥早期診斷和/或 治療制劑中的應(yīng)用。
[0017] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N納米粒子的制備方法，包括：將Ag/Au雙金屬納米粒子、緩沖溶 液、帶正電荷的聚合物與葡萄糖氧化酶溶液混合，靜置，得到納米粒子。在上述過(guò)程中，帶正 電荷的聚合物通過(guò)靜電作用吸附于Ag/Au雙金屬納米粒子表面，并為帶負(fù)電荷的葡萄糖氧 化酶提供吸附位點(diǎn)，使帶負(fù)電的葡萄糖氧化酶通過(guò)靜電吸附作用吸附到帶正電荷的聚合物 上，從而使葡萄糖氧化酶固定于Ag/Au雙金屬納米粒子上，得到葡萄糖氧化酶和Ag/Au雙金 屬納米粒子等離子激元雜化的納米粒子。
[0018] 本申請(qǐng)制備的納米粒子即固定于Ag/Au雙金屬納米粒子表面的葡萄糖氧化酶的 納米粒子，在有氧氣存在的條件下，納米粒子催化葡萄糖氧化并原位生成過(guò)氧化氫，H202將 Ag/Au雙金屬納米粒子中的Ag組分溶解而使Ag/Au中空納米球殼表面出現(xiàn)納米孔，從而使 納米粒子的LSPR吸收峰的位置發(fā)生明顯紅移，實(shí)現(xiàn)葡萄糖的檢測(cè)。由于癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)需要 吸收葡萄糖量大于正常細(xì)胞，基于本申請(qǐng)制備的納米粒子對(duì)葡萄糖的敏感反應(yīng)，使納米粒 子探針能夠有效區(qū)分正常細(xì)胞與癌癥細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為本發(fā)明制備的納米粒子用于葡萄糖檢測(cè)的機(jī)理示意圖；
[0020] 圖2為不同量的0. 1 %HAuC14水溶液合成的3種不同Ag/AuNSs樣本的LSPR吸 收譜以及經(jīng)H202蝕刻前后TEM圖像；
[0021] 圖3為經(jīng)H202蝕刻后三個(gè)樣品的LSPR峰紅移位置的曲線圖；
[0022] 圖4為Ag/Au雙金屬納米粒子和納米粒子的TEM圖像以及Ag/AuNSs和納米粒子 歸一化的UV-Vis光譜圖；
[0023] 圖5為本申請(qǐng)制備的納米粒子分別與非腫瘤細(xì)胞L929和腫瘤細(xì)胞A549共同孵育 后顯微鏡暗場(chǎng)圖像；
[0024] 圖6為正常細(xì)胞與癌細(xì)胞分別與Ag/Au-GOxNSs孵育、激光照射后的MTT細(xì)胞活 力分析柱狀圖；
[0025] 圖7為Ag/Au-GOxNSs與濃度為2mM的葡萄糖反應(yīng)30min前后歸一化的UV-Vis 光譜圖；
[0026] 圖8為Ag/AuNSs與濃度為2mM的葡萄糖反應(yīng)12小時(shí)前后歸一化的UV-Vis光譜 圖；
[0027] 圖9為納米粒子經(jīng)H202刻蝕前后與Ag/Au雙金屬納米粒子進(jìn)行激光照射后溶液溫 度變化曲線圖；
[0028] 圖10為納米粒子與對(duì)照細(xì)胞、癌細(xì)胞分別共同孵育前后分別用激光器照射后的 顯微鏡圖像；
[0029] 圖11為納米粒子清除癌細(xì)胞的效果對(duì)比圖像。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，但是 應(yīng)當(dāng)理解，這些描述只是為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，而不是對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的 限制。
[0031] 本發(fā)明實(shí)施例公開了一種納米粒子的制備方法，包括：
[0032] 將Ag/Au雙金屬納米粒子、緩沖溶液、帶正電荷的聚合物與葡萄糖氧化酶溶液混 合，靜置，得到納米粒子。
[0033] 本發(fā)明選用中空的Ag/Au雙金屬納米粒子（Ag/AuNSs)作為基底材料用于固定葡 萄糖氧化酶（GOx)，將酶催化反應(yīng)與Ag/Au雙金屬納米結(jié)構(gòu)的plasmonic加工成功相結(jié)合。
[0034] 本申請(qǐng)的納米粒子即酶雜化的Ag/Au-GOxNSs的制備過(guò)程具體為：
[0035] 將Ag/Au雙金屬納米粒子（Ag/AuNSs)分散于緩沖溶液中，并調(diào)節(jié)溶液的pH值為 6~7,再加入帶正電荷的聚合物，靜置后加入葡萄糖氧化酶，靜置，得到Ag/Au-GOxNSs。
[0036] 在上述過(guò)程中，首先加入帶正電荷的聚合物，是使其通過(guò)靜電作用吸附于Ag/Au NSs表面，然后再加入葡萄糖氧化酶，