蛋白酶在中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)中的底物性質(zhì)的制作方法
【專利說明】蛋白酶在中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)中的底物性質(zhì)
[0001] 優(yōu)先權(quán)聲明
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請序列號No. 61/799, 658的優(yōu)先 權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用并入本申請。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本申請涉及中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)，也稱為NET。
[0004] 背景
[0005]中性粒細胞是血漿中豐度最高的白細胞。其是針對病原體侵襲產(chǎn)生的應答首先募 集至損傷部位的細胞，并且其是先天性免疫防御的第一道防線。傳統(tǒng)上將中性粒細胞認為 是炎性應答和急性免疫的效應細胞，其通過胞內(nèi)吞噬作用發(fā)揮功能，并且使用裂解蛋白酶、 活性氧（R0S)和殺微生物蛋白用于攻擊感染劑。最近的研究表明，中性粒細胞還能夠通過 表達用于與其他免疫細胞，如樹突狀細胞、B細胞和T細胞傳遞信號的細胞因子、趨化因子、 Fc受體和補體成分具有免疫調(diào)節(jié)能力（Mantovani,Cassatella等，2011)。
[0006] 蛋白酶是中性粒細胞重要的效應器。其不僅具有直接的殺微生物活性，還在趨化 因子、細胞因子和受體的蛋白水解過程中發(fā)揮作用（Pham2006 ;Meyer_Hoffert和Wiedow2010)。這種調(diào)節(jié)活性由IL-1β和IL-18經(jīng)由NE、PR3和CG不依賴于半胱天冬酶的活化 (Robertson,Young等，2006 ;Guma，Ronacher等，2009 ;Joosten，Netea等，2009)或抗炎性 顆粒蛋白前體經(jīng)由NE和PR3轉(zhuǎn)化為促炎性顆粒體蛋白（Kenssenbrock，2008)所示例。而 且，已發(fā)現(xiàn)NE在中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（NET)中通過裂解組織因子通路抑制劑將中性粒細 胞介導的炎癥與凝血通路偶聯(lián)。
[0007]NET由在稱為NETosis的特定形式的細胞死亡中受到刺激的中性粒細釋放。據(jù)推 測NETosis代表了針對病原體侵襲產(chǎn)生的應答由中性粒細胞介導的先天性免疫的一種新 機制。（Brinkmann，Reichard等，2004 ;Remijsen，Kuijpers等，2011)。其特征為形成NET， 一種由解聚的染色質(zhì)、抗微生物蛋白和肽形成的網(wǎng)絡。NETosis的作用是先天性免疫防御的 第一道防線，其代表了在多個方面與凋亡和壞死截然不同的一種新的細胞死亡模式。未觀 察到核碎裂或膜出泡，并且其活化不依賴于半胱天冬酶的活化，但是其需要NADPH氧化酶 和MAPK激酶通路。NETosis還參與NE、髓過氧化物酶和肽基精氨酸脫亞胺基酶4 ( 一種負責 組蛋白瓜氨酸化和染色質(zhì)解聚的酶）的活性（胃3即，1^等，2009;?3口3}^1111(^〇111〇8，]^七216『 等，2010)。據(jù)推測NET的主要功能是誘捕和殺滅病原體。此外，其還提供了用于隨后進行 的先天性和適應性免疫應答的具有較高的局部效應器和介質(zhì)濃度的基質(zhì)。此前進行的NET 成分的蛋白質(zhì)組學研究鑒定出了三種主要的蛋白酶，分別將其稱為中性粒細胞NE、CG和 PR3 (Urban,Ermert等，2009)。
[0008] 為了以無偏見的方式表征與NET相關(guān)的蛋白水解活性，使NET中誘捕的蛋白釋 放并通過利用質(zhì)譜測定其多重底物性質(zhì)（MSP-MS)的方法對其進行測定（0'Donoghue等， 2012)。這種方法在使用串聯(lián)的液相色譜-質(zhì)譜的多重檢測中利用具有124個高多樣性肽 的文庫對裂解位點進行檢測。使用MSP-MS測定，通過將底物特異性性質(zhì)與純化的人中性粒 細胞蛋白酶進行比較闡明在復雜NETosis樣品中各種酶的作用。此外，使用四肽熒光底物 文庫研究NE、CG、PR3和NSP4非優(yōu)勢方的底物特異性。據(jù)申請人所知，本申請報道了在相同 條件下平行地比較NE、PR3、CG和NSP4的擴展的底物特異性的首次完整的研究。通過對來 自三個獨立的健康供體的NET相關(guān)蛋白酶的分析顯示，可以將其主要活性歸功于NE。NE活 性的免疫耗竭顯示了PR3和較低程度的CG貢獻的活性，以及微弱的NSP4活性。對底物特 異性以及各種NET相關(guān)蛋白酶對總的NET相關(guān)活性貢獻的鑒定能夠?qū)е略诩毙院吐悦庖?疾病中針對病理性NETosis的改進的治療性干預的發(fā)展。
[0009] 附圖簡述
[0010] 下述附圖構(gòu)成了本申請說明書的一部分并且包括其以便進一步顯示本發(fā)明的某 些方面。通過參考這些附圖中的一個或多個以及結(jié)合本申請?zhí)囟▽嵤┓绞降脑敿毭枋隹梢?更好地理解本發(fā)明。
[0011] 圖1描述了顯示對中性粒細胞絲氨酸蛋白酶非優(yōu)勢方的特異性進行比較的圖 (上面一行：組織蛋白酶G(100nM)、中間一行：蛋白酶3(50nM)、下面一行：彈性蛋白酶 (50nM))〇
[0012] 圖2顯示了對中性粒細胞絲氨酸蛋白酶擴展的底物特異性的比較。
[0013]圖3顯示了對同時監(jiān)測彈性蛋白酶（ELA)、蛋白酶3(PR3)和組織蛋白酶G(CG)裂 解的熒光底物的鑒定并使用該底物確定供體中性粒細胞中的總蛋白酶。
[0014] 圖4是對NET蛋白水解性質(zhì)的比較和主要活性的免疫耗竭。
[0015] 圖5顯示了彈性蛋白酶的裂解位點以及組織蛋白酶G和蛋白酶3共享這些位點。
[0016] 圖6顯示了蛋白酶3的裂解位點以及彈性蛋白酶和組織蛋白酶G共享這些位點。
[0017] 圖7顯示了組織蛋白酶G的裂解位點以及彈性蛋白酶和蛋白酶3共享這些位點。
[0018] 圖8顯示了來自NETosis供體的蛋白酶裂解位點。
[0019] 圖9顯示了彈性蛋白酶、蛋白酶3、組織蛋白酶G、中性粒細胞分泌的蛋白4以及來 自NETosis供體的蛋白酶裂解物。
[0020] 發(fā)明概述
[0021] 本申請?zhí)峁┝擞糜贜ETosis相關(guān)疾病的蛋白生物標記物。在一些實施方式中，此 類生物標記物是蛋白酶，包括例如中性粒細胞彈性蛋白酶（NE)、組織蛋白酶G(CG)、蛋白酶 3(PR3)和中性粒細胞分泌的蛋白4(NSP4)。
[0022] 本申請還提供了用于中性粒細胞彈性蛋白酶（NE)、組織蛋白酶G(CG)、蛋白酶 3 (PR3)和中性粒細胞分泌的蛋白4 (NSP4)的識別和/或裂解的底物序列。
[0023] 在一些實施方式中，所述底物序列能夠用于開發(fā)此類蛋白酶的探針或抑制劑。而 且，此類底物能夠用于研發(fā)在多肽中的裂解位點，其中裂解在NETosis相關(guān)疾病中是所需 的。
[0024] 因此，本申請?zhí)峁┝艘环N用于鑒定具有NETosis相關(guān)的炎性狀況的受試者的方 法，其中NETosis是中性粒細胞死亡形成的胞外誘捕網(wǎng)，所述方法包括：（a)從來自受試者 的樣品獲得與NET相關(guān)的蛋白酶含量信息；(b)將與NET相關(guān)的蛋白酶含量水平與來自健 康受試者的可比較的樣品進行比較，和（c)當所述樣品的NET相關(guān)蛋白酶含量高于來自健 康受試者的可比較的樣品時，則鑒定所述受試者具有NETosis相關(guān)的炎性狀況。
[0025] 所述樣品可以是血液樣品。所述蛋白酶可以選自：中性粒細胞彈性蛋白酶（NE)、 組織蛋白酶G(CG)、蛋白酶3(PR3)和中性粒細胞分泌的蛋白4(NSP4)。所述方法還可以包 括治療NETosis相關(guān)的炎性狀況，如感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎、囊性纖維化、 深部靜脈血栓、先兆子癇、牙周炎、闌尾炎、結(jié)核病和克羅恩氏病。治療可以包括向所述受試 者施用蛋白酶抑制劑。所述蛋白酶抑制劑可以抑制包含如圖4-9所示序列的肽底物的裂 解。治療還可以包括向所述受試者施用留體或非留體抗炎藥物，或抗生素。所述對象可以 是人或非人哺乳動物。
[0026] 所述方法還可以包括獲得信息，其包括從所述受試者獲得樣品，如通過在所述樣 品上進行蛋白酶含量評估。所述評估可以通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)、質(zhì)譜法、色譜法、 電泳、放射性免疫測定、流式細胞術(shù)、熒光活化細胞分選（FACS)或western印跡進行。所述 樣品與可比較的樣品之間蛋白酶含量的差異為+10 %、+20 %、+25 %、+30 %、+40 %、+50 %、 +75%或 +100%。
[0027] 相對于本申請所述的任意其他方法或組合物可以實施本申請所述的任意方法或 組合物是能夠預期的。當結(jié)合下述說明書和附圖考慮時將可以更好地體會和理解本發(fā)明的 這些和其他實施方式。然而，應理解下述說明書盡管顯示了本發(fā)明的不同實施方式及其多 個特定的細節(jié)，但是給出其僅用于說明而非限制。在不脫離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)可以進行 多種替代、修訂、增加和/或重排，并且本發(fā)明包括所有的這些替代、修訂、增加和/或重排。
[0028] 發(fā)明詳述
[0029] 應理解本發(fā)明不限于所描述的特定方法、方案、細胞系、動物種屬、構(gòu)建體和試劑 并且其是可以改變的。還應理解本申請使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方式的目的，并且 其并非旨在限制本發(fā)明的范圍，其范圍將僅由所附的權(quán)利要求限定。
[0030] 必須注意的是，如在本申請和所附的權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式的"一個"、 "一種"和"所述"包括其復數(shù)形式，除非上下文另有明示。因此，例如提及"蛋白酶"時，指 一種或多種蛋白酶并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其等效形式等等。
[0031] 在本申請中使用的術(shù)語"約"指所提供的單位值的+/-10%。在本申請中使用的術(shù) 語"基本上"指顯示出所關(guān)注特征或性質(zhì)的總體或大致程度的定性條件。生物領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員將理解生物和化學現(xiàn)象很少（如果有的話）達到或避免絕對結(jié)果，因為多種變量 影響生物和化學組分和材料的檢測、生產(chǎn)和貯存，并且因為在檢測、生產(chǎn)和貯存生物和化 學組分和材料中使用的儀器和設備存在固有誤差。因此在本申請中使用術(shù)語基本上以捕捉 在