技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及具有對(duì)人類α-突觸核蛋白(α-synuclein)原細(xì)纖維(protofibrils)高的親和力和α-突觸核蛋白單體低的結(jié)合的抗體或其片段，其中抗體或片段具有特定的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列。本發(fā)明也涉及包含這樣的抗體或片段的組合物，并涉及利用這樣的抗體或片段檢測(cè)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的方法。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通過(guò)給予這樣的抗體或片段預(yù)防、推遲具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病(neurodegenerative disorder)的發(fā)作或治療所述疾病的方法，并涉及在制備治療具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的藥物組合物中應(yīng)用這樣的抗體或片段。本發(fā)明也涉及在診斷或監(jiān)測(cè)具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)展中應(yīng)用這樣的抗體或片段，并涉及通過(guò)這樣的抗體或片段的給予減少或抑制α-突觸核蛋白聚集的方法。

背景技術(shù)：

帕金森氏癥(PD)和路易體癡呆(dementia with Lewy bodies)(DLB)是具有α-突觸核蛋白腦病理的神經(jīng)退化性疾病的兩個(gè)最普遍的實(shí)例。PD是最普遍的運(yùn)動(dòng)紊亂，且PD的特點(diǎn)是僵化、運(yùn)動(dòng)功能減退、顫動(dòng)和姿勢(shì)不穩(wěn)定(postural instability)。認(rèn)為大約四到六百萬(wàn)的世界人口患PD。DLB代表所有癡呆的5-15％。除了健忘和經(jīng)常波動(dòng)的其他瘋狂的癥狀之外，DLB病人一般遭受反復(fù)出現(xiàn)的跌傷和視幻覺(jué)。

α-突觸核蛋白的神經(jīng)元內(nèi)(Intraneuronal)積聚導(dǎo)致路易體的形成，球形的嗜曙紅玻璃質(zhì)10-20μm大的內(nèi)含物，或路易神經(jīng)突的形成，拉長(zhǎng)的線狀的畸形的軸突和樹突。在PD腦中，路易體和路易神經(jīng)突的沉積物通常限于連接紋狀體和黑質(zhì)(substantia nigra)的神經(jīng)細(xì)胞。這些細(xì)胞對(duì)于運(yùn)動(dòng)和姿勢(shì)功能的完成、說(shuō)明PD癥狀的本性來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的。在DLB腦中，在中腦和皮質(zhì)區(qū)域中都發(fā)現(xiàn)路易體和路易神經(jīng)突的廣泛分布的沉積物。

α-突觸核蛋白是主要地發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)內(nèi)的蛋白質(zhì)。在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，α-突觸核蛋白主要地位于突觸前(presynaptically)，且因此推測(cè)它在突觸的活性的調(diào)節(jié)中扮演的作用。識(shí)別了α-突觸核蛋白的三個(gè)主要的亞型，它的最長(zhǎng)的和最普通的形式包含140個(gè)氨基酸。這種亞型已被應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的抗體的α-突觸核蛋白(α-突觸核蛋白)有關(guān)的特征涉及α-突觸核蛋白的這種亞型。

除了α-突觸核蛋白之外，路易體由多種分子組成，其中一個(gè)分子是4-羥基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal)(HNE)、α,β-不飽和的羥基烯烴(hydroxyalkenal)(Qin等人，2007)。在體外已經(jīng)顯示HNE能修飾α-突觸核蛋白，且因此促進(jìn)α-突觸核蛋白的寡聚化(oligomerization)。特別地是，已經(jīng)顯示HNE增加和固定原細(xì)纖維的形成，例如，α-突觸核蛋白的可溶解的較大的寡聚形式(Qin等人，2007；WO 2009/133521，包括在此以供參考)。

在許多由錯(cuò)誤折疊的α-突觸核蛋白的病理的積聚表征的神經(jīng)退化性疾病中已經(jīng)暗示了氧化應(yīng)激(Oxidative stress)。各種活性氧組分能誘導(dǎo)脂質(zhì)的過(guò)氧化，如細(xì)胞膜或脂蛋白，且也導(dǎo)致來(lái)自多不飽和脂肪酸的高度地活性醛的產(chǎn)生(yoritaka等人，1996)。

在具有DLB大約50％病例中可看到阿爾茨海默氏病(AD)的腦病理指征，例如，淀粉樣斑塊(amyloid plaques)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles)。不清楚的是，平行的病理的存在是否暗示兩種不同的疾病或者僅僅代表每一個(gè)各自紊亂的變體。有時(shí)將共病理的病例描述為具有AD的路易體變體(Hansen等人，1990)。

近來(lái)的研究暗示了在AD和唐氏綜合征(Down's syndrome)中α-突觸核蛋白的作用，如已經(jīng)證明了α-突觸核蛋白蛋白質(zhì)在這些紊亂中的邊緣區(qū)中的積聚(Crews等人，2009)。

HNE對(duì)半光氨酸、組氨酸和賴氨酸的側(cè)鏈起反應(yīng)并修飾所述側(cè)鏈，充分地改變這些側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)和物理性能。因此，HNE能與C-3碳或與醛基或其組合起反應(yīng)。因此，HNE能作用于分子間地或作用于分子內(nèi)共價(jià)地修飾蛋白質(zhì)。

帕金森氏癥和路易體癡呆的遺傳學(xué)

能通過(guò)α-突觸核蛋白基因的點(diǎn)突變或重復(fù)形成PD和DLB的稀有的主要地遺傳的形式。已經(jīng)描述了引起家族PD的致病突變A30P和A53T(Kruger等人，1998)(polymeropoulos等人，1998)和基因的重復(fù)(chartier-Harlin等人，2004)，然而已經(jīng)報(bào)道了引起PD或DLB的一個(gè)其他的α-突觸核蛋白突變，E46K(Zarranz等人，2004)和α-突觸核蛋白基因的三倍體(triplication)(Singleton等人，2003)。

僅部分地了解α-突觸核蛋白突變種的致病的結(jié)果。然而，體外數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示，A30P和A53T突變種增加聚集率(Conway等人，2000)。多種不同組成的α-突觸核蛋白種類(單體、二聚體、寡聚體，包括原細(xì)纖維)都涉及聚集過(guò)程，所有這些可具有不同的毒性。不清楚的是，哪一個(gè)分子種類在腦中有毒性作用。然而，最近的研究表明，α-突觸核蛋白的寡聚的形式是顯著地神經(jīng)毒性的。通過(guò)引起遺傳的帕金森氏癥的某些α-突觸核蛋白突變種(A30P和A53T)，導(dǎo)致寡聚化增加率的觀察給出關(guān)于寡聚物的作用的另外的證據(jù)。

還沒(méi)有完全地了解α-突觸核蛋白聚集級(jí)聯(lián)是如何開始的。可能，在這些中間大小種類在路易體中作為不可溶解的原纖維沉積之前，單體的α-突觸核蛋白的改變的構(gòu)造開始二聚體和三聚體的形成，其繼續(xù)形成較大的可溶解的寡聚體，包括原細(xì)纖維。也應(yīng)該理解，α-突觸核蛋白寡聚體，一旦它們形成，則能結(jié)合新的單體和/或α-突觸核蛋白較小的多聚體，因此加速原纖維(fibrils)形成過(guò)程。這樣的播種(seeding)作用可能也能在細(xì)胞外空間中發(fā)生，如最近的證據(jù)表明α-突觸核蛋白病理可在患病的腦中從神經(jīng)細(xì)胞傳播到神經(jīng)細(xì)胞。

除了在α-共核蛋白病(synucleinopathies)中的神經(jīng)病理的改變之外，α-突觸蛋白的水平通常在受侵襲的腦區(qū)域中增加(Klucken等人，2006)。

α-共核蛋白病的主要的病理是細(xì)胞內(nèi)的，其引起免疫治療途徑的挑戰(zhàn)。然而，可能，活躍誘導(dǎo)的片段或被動(dòng)給予的抗體也能在神經(jīng)元內(nèi)結(jié)合它們的靶抗原。此外，血漿和腦脊髓液兩者中的α-突觸核蛋白的識(shí)別(El-Agnaf等人，2006)說(shuō)明，不僅僅在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)所述蛋白質(zhì)。減少的這樣的細(xì)胞外α-突觸核蛋白可改變細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外蛋白質(zhì)集合之間的平衡，且也導(dǎo)致減少細(xì)胞內(nèi)的α-突觸核蛋白。證據(jù)表明，在溶液中的α-突觸核蛋白能滲透細(xì)胞膜中的脂質(zhì)雙分子層，并因此內(nèi)在化或輸出細(xì)胞。最近的發(fā)現(xiàn)證明，α-突觸核蛋白在細(xì)胞外的空間中有毒性作用，因此，提供關(guān)于α-突觸核蛋白病理如何作為疾病發(fā)展傳遍腦的似乎真實(shí)的解釋。研究顯示，在移植的PD病人中路易病理傳播給移植的神經(jīng)細(xì)胞(Li等人，2008)。此外，通過(guò)內(nèi)吞作用(endocytosis)將α-突觸核蛋白傳播給鄰近的神經(jīng)細(xì)胞，且α-突觸核蛋白聚集體的細(xì)胞到細(xì)胞的傳播已經(jīng)與PD和其他α-共核蛋白病中的神經(jīng)細(xì)胞死亡和病態(tài)發(fā)展聯(lián)系(Desplats等人，2009)。

PD和DLB的診斷

需要改進(jìn)的診斷工具和方法，從而識(shí)別具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)今，在對(duì)腦的真實(shí)的傷害已經(jīng)發(fā)生之前，沒(méi)有生物化學(xué)的方法能幫助臨床醫(yī)生診斷在疾病的早期階段中的病人的臨床癥狀。

精確的診斷分析變得比新治療的可能性出現(xiàn)更加重要。截至今天，只有癥狀治療(通過(guò)取代腦中活性的多巴胺的損失)對(duì)PD病人可用。對(duì)于DLB，甚至更少的治療選擇是可用的。然而，臨床醫(yī)生經(jīng)常地評(píng)價(jià)對(duì)于AD的標(biāo)準(zhǔn)治療對(duì)DLB病人的可能的有益的影響，例如，膽堿酯酶抑制劑。在任一方法中，對(duì)于α-共核蛋白病的現(xiàn)有的治療策略沒(méi)有一個(gè)可針對(duì)潛在的疾病過(guò)程。另外，也需要監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展和治療效果。對(duì)于改變帕金森氏癥的發(fā)展的不同的方法的評(píng)價(jià)，參見(jiàn)George等人，2009。

考慮到上述提及的參與幾種神經(jīng)退化性疾病中的α-突觸核蛋白，需要能消除或減少有毒的α-突觸核蛋白種類的影響的新的治療，并需要好的生物標(biāo)志物，以監(jiān)測(cè)新的干涉并提供好的預(yù)測(cè)特異性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及具有對(duì)人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維高的親和力和α-突觸核蛋白單體的低的結(jié)合的改進(jìn)的抗體和它的片段。本發(fā)明也涉及包含這樣的抗體或片段的組合物和涉及利用這樣的抗體或片段檢測(cè)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的方法。在進(jìn)一步地實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通過(guò)給予這樣的抗體或片段預(yù)防、推遲具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)作或治療所述疾病的方法，并涉及制備在具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的治療的藥物組合物中使用的這樣的抗體或片段。本發(fā)明也涉及在具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)展的診斷或監(jiān)測(cè)中這樣的抗體或片段的應(yīng)用，并涉及通過(guò)這樣的抗體或片段的給予減少或抑制α-突觸核蛋白聚集的方法。

在一個(gè)實(shí)施例中，抗體或其片段具有對(duì)人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維高的親和力和α-突觸核蛋白單體的低的結(jié)合，和具有三個(gè)可變的重鏈(VH)CDR序列(VH-CDR-1、VH-CDR-2、和VH-CDR-3和三個(gè)可變的輕鏈(VL)CDR系列(VL-CDR-1、VL-CDR-2、和VL-CDR-3)，其中抗體或其片段的六個(gè)CDR序列選自下列各組：

VH-CDR-1 SEQ ID NOS:22，23，24，25，26或者27

VH-CDR-2 SEQ ID NOS:28，29，30，31，32，33或者34

VH-CDR-3 SEQ ID NOS:35，36，37，38，39或者40

VL-CDR-1 SEQ ID NOS:41，42，43，44，45或者46

VL-CDR-2 SEQ ID NOS:47，48或者49

VL-CDR-3 SEQ ID NOS:50，51，52，53，54或者55

在另一個(gè)實(shí)施例中，抗體或其片段具有對(duì)人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維高的親和力和α-突觸核蛋白單體的低的結(jié)合，和具有三個(gè)可變的重鏈(VH)CDR序列(VH-CDR-1、VH-CDR-2、和VH-CDR-3和三個(gè)可變的輕鏈(VL)CDR系列(VL-CDR-1、VL-CDR-2、和VL-CDR-3)，其中抗體或其片段的六個(gè)CDR序列選自下列各組，和與任何一個(gè)各自組的所述序列具有大于70、80、90、95或98％的相似性的序列：

VH-CDR-1 SEQ ID NOS:22，23，24，25，26或者27

VH-CDR-2 SEQ ID NOS:28，29，30，31，32，33或者34

VH-CDR-3 SEQ ID NOS:35，36，37，38，39或者40

VL-CDR-1 SEQ ID NOS:41，42，43，44，45或者46

VL-CDR-2 SEQ ID NOS:47，48或者49

VL-CDR-3 SEQ ID NOS:50，51，52，53，54或者55

其中抗體或其片段結(jié)合到模型系統(tǒng)中的固定的線性α-突觸核蛋白的氨基酸區(qū)域113-140內(nèi)的表位上，例如，113-131，具體地，表位125-131、121-124、121-127、121-131、113-123或136-140上，其中所述模型系統(tǒng)中的固定的線性α-突觸核蛋白包含具有11個(gè)氨基酸重疊的15-merα-突觸核蛋白肽。

根據(jù)本發(fā)明的抗體、片段、組合物和方法在具有和/或在發(fā)展這樣的疾病的風(fēng)險(xiǎn)上的個(gè)體中，在診斷、監(jiān)測(cè)、預(yù)防、推遲具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)作和/或治療中提供改進(jìn)。

通過(guò)具體的說(shuō)明，本發(fā)明的各種實(shí)施方式的另外的方面、實(shí)施例和優(yōu)勢(shì)將更加明顯。

附圖說(shuō)明

通過(guò)附圖，將更加充分地理解具體實(shí)施方式，其中：

圖1顯示如通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定的原細(xì)纖維特異性單克隆抗體的性能。如實(shí)例4中描述的利用HNE-固定(stabilized)的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維進(jìn)行試驗(yàn)。

圖2A和圖2B顯示通過(guò)如實(shí)例4中描述的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA分析原細(xì)纖維特異性抗體mAb49/G的性能。圖2A顯示原細(xì)纖維特異性單克隆抗體mAb49/G以高親和力結(jié)合到通過(guò)HNE或ONE固定的人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維上。圖2B顯示單克隆抗體也以高親和力結(jié)合到α-突觸核蛋白的人類突變的形式的HNE-固定的原細(xì)纖維上，A30P和A53T。

圖3A-圖3C顯示通過(guò)如實(shí)例4中描述的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA分析的原細(xì)纖維特異性抗體的性能。原細(xì)纖維特異性單克隆抗體以高親和力結(jié)合到通過(guò)HNE(PF-HNE)或ONE(PF-ONE)固定的野生型人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維上。單克隆抗體也以高親和力結(jié)合到α-突觸核蛋白的人類突變的形式的HNE-固定的原細(xì)纖維上，A30P(A30P-HNE)和A53T(A30P-HNE)。

圖4A和圖4B涉及通過(guò)如實(shí)例5中描述的三明治式ELISA(夾心ELISA，sandwich ELISA)，α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的量化。圖4A顯示用作捕獲抗體和檢測(cè)抗體兩種作用的原細(xì)纖維特異性抗體mAb49/G的示意圖。圖4B顯示利用HNE-固定的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)的曲線。試驗(yàn)性能達(dá)到LOQ＝9pM的量化的限制。

圖5A和圖5B顯示利用如實(shí)例6中描述的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維特異性三明治式ELISA，患病的(DLB)和對(duì)照的人類腦提取物的分析的結(jié)果。

圖6顯示如實(shí)例7中描述的對(duì)照組小鼠(ntg，非轉(zhuǎn)基因的)和來(lái)自Khale轉(zhuǎn)基因的(tg)小鼠PD模型的5月大的小鼠的腦提取物的分析。利用tris緩沖鹽(TBS)和含有Triton的TBS提取腦組織。利用如實(shí)例5中描述的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維三明治式ELISA進(jìn)行分析。原細(xì)纖維特異性抗體mAb49/G用作捕獲抗體和檢測(cè)抗體。在圖表中，y軸代表在OD450上的吸光率。

圖7A-圖7F顯示如實(shí)例8中描述的組織的免疫組織化學(xué)(IHC)分析。圖7A顯示路易體的38E2/7結(jié)合，且PD黑質(zhì)中的神經(jīng)突和陽(yáng)性α-α-突觸核蛋白對(duì)照。圖7B顯示路易體的38E2/7結(jié)合和在DLB皮質(zhì)和黑質(zhì)中的神經(jīng)突以及陽(yáng)性α-α-突觸核蛋白對(duì)照。圖7C顯示多種抗體結(jié)合路易體和在DLB皮質(zhì)和黑質(zhì)中的神經(jīng)突和陰性對(duì)照。圖7D顯示多種抗體結(jié)合路易體和在PD黑質(zhì)中的神經(jīng)突和陰性對(duì)照。圖7E顯示在非疾病相關(guān)的黑質(zhì)中38E2/7沒(méi)有結(jié)合且陽(yáng)性α-α-突觸核蛋白對(duì)照。圖7F顯示38E2/7結(jié)合和在阿爾茨海默氏癥病人的皮質(zhì)中的陽(yáng)性α-Aβ對(duì)照的比較。

圖8A和圖8B顯示利用如實(shí)例9中描述的腦提取方案，提取的具有原細(xì)纖維選擇性的單克隆抗體38E2/7的人類腦提取物的免疫沉淀反應(yīng)。

圖9A和圖9B顯示利用如實(shí)例10中描述的裝備FITC落射熒光(epifluorescence)濾光器的Axiovert 200顯微鏡測(cè)量的熒光數(shù)據(jù)。圖9A顯示處理過(guò)的細(xì)胞，而圖9B顯示與抗體未處理的α-突觸核蛋白過(guò)表達(dá)的細(xì)胞相比較，將其設(shè)定為100％，以在熒光強(qiáng)度中相對(duì)％減少計(jì)算的數(shù)據(jù)。

考慮到下面列出的實(shí)施例，將更充分地理解各個(gè)圖。

具體實(shí)施方式

在第一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有對(duì)人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維高親和力和α-突觸核蛋白單體的低的結(jié)合的改進(jìn)的抗體和它的片段。在具體的實(shí)施例中，抗體是一類IgG抗體或它的變體。在本公開內(nèi)，對(duì)人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的高的親和力意味著，抗體或片段對(duì)人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維表現(xiàn)小于10^-7M的分離常數(shù)K_d。如本領(lǐng)域已知的，原細(xì)纖維是α-突觸核蛋白的可溶解的寡聚物。典型的原細(xì)纖維具有的分子量范圍從大約1000到大約5000kDa，以球狀蛋白為參考，利用尺寸排阻色譜適當(dāng)?shù)販y(cè)量，但是本發(fā)明不限于這樣的典型的原細(xì)纖維。另外，在本公開內(nèi)，α-突觸核蛋白單體的低的結(jié)合意味著，根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段對(duì)α-突觸核蛋白單體的結(jié)合至少小于對(duì)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的結(jié)合的100倍。在具體的實(shí)施例中，根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA，例如，如實(shí)例4中描述的，測(cè)量這些結(jié)合親和力。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及在預(yù)防、推遲具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)作、所述疾病的治療、監(jiān)測(cè)和/或診斷中用于改進(jìn)的這樣的抗體和片段的方法和應(yīng)用，所述疾病包括，但不限于，帕金森氏疾病(PD)、路易體癡呆(DLB)、阿爾茨海默氏癥的路易體變體(the Lewy body variant of Alzheimer’s disease)、多發(fā)性系統(tǒng)萎縮癥、精神病、精神分裂癥和克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)。在α-共核蛋白病中，作為路易體和路易神經(jīng)突的聚集的α-突觸核蛋白在腦中，在某些指征中，也在其他器官中積聚。

已經(jīng)通過(guò)經(jīng)典的雜交瘤細(xì)胞技術(shù)揭露了根據(jù)本發(fā)明的抗體的實(shí)例?？贵w可以是多克隆抗體或單克隆抗體。在具體的實(shí)施例中，抗體是單克隆抗體。在很多場(chǎng)合中本公開涉及抗體和它的片段時(shí)，為了方便的目的，在本公開中的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括它的片段，意味著它的活性片段，例如，片段具有根據(jù)本發(fā)明的抗體定義的相同的特征，即對(duì)α-突觸核蛋白寡聚體/原細(xì)纖維具有高親和力和α-突觸核蛋白單體低的結(jié)合。在病理形式的α-突觸核蛋白的清除中，抗體和它的片段表現(xiàn)出高效率。

發(fā)明的抗體結(jié)合聚集的形式，具體地是原細(xì)纖維，包括未修飾的或結(jié)合的α-突觸核蛋白，例如，結(jié)合到4-羥基-2-壬烯醛(HNE)或4-氧-壬烯醛(4-oxo-2-nonenal)(ONE)、或其他α,β-不飽和的羥基烯烴、或多-不飽和脂肪酸，這種結(jié)合固定致病的原細(xì)纖維/寡聚α-突觸核蛋白表位。所述表位在構(gòu)象改變的或修飾的α-突觸核蛋白上出現(xiàn)，例如，在患有α-共核蛋白病的病人的腦中出現(xiàn)的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維和寡聚體，如，但不限于，帕金森氏癥、DLB，等等。發(fā)明的抗體也結(jié)合到通過(guò)α-突觸核蛋白突變種形成的致病的原細(xì)纖維/寡聚結(jié)構(gòu)上，例如，已經(jīng)描述了引起家族PD的A30P和A53T(Kruger等人，1998)(Polymeropoulos等人，1997)。本發(fā)明的抗體的這種靶目標(biāo)的另一個(gè)實(shí)例是通過(guò)引起PD或DLB的突變種α-突觸核蛋白E46K形成的原細(xì)纖維。

在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施例中，提供用于區(qū)分、診斷、識(shí)別與α-突觸核蛋白病理有關(guān)的疾病的發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)、和/或治療所述疾病的單克隆抗體，包括，但不限于，例如，帕金森氏癥、路易體癡呆、阿爾茨海默氏病的路易體變體、阿爾茨海默氏病、唐氏綜合征、多發(fā)性系統(tǒng)萎縮癥、精神錯(cuò)亂、精神分裂癥、克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)和其他神經(jīng)退化性疾病。

本發(fā)明的抗體或片段包括在抗體的可變的輕鏈(VL)和可變的重鏈(VH)鏈上的CDR1-3區(qū)域限定的氨基酸序列，其中所述抗體對(duì)含有“PD和/或DLB疾病的表位”的可溶解的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維具有高的親和力。在具體的實(shí)施例中，CDR區(qū)域與Fc區(qū)域的變型結(jié)合，以便調(diào)節(jié)效應(yīng)器功能，如，但不限于，F(xiàn)c受體結(jié)合(Fc receptor binding)、補(bǔ)體因子C1q結(jié)合(complement factor Clq binding)、有效的半衰期(effecting half-life)、補(bǔ)體的激活(complement activation)和炎癥過(guò)程?？贵w的恒定區(qū)具有許多重要的功能，顯著地結(jié)合Fc-受體和補(bǔ)體因子C1q。能阻止后面的功能激活，以便避免炎癥反應(yīng)。

如與其他已知的免疫治療的治療藥比較，具有對(duì)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維高的親和力和對(duì)α-突觸核蛋白單體低的結(jié)合的本發(fā)明的抗體和片段具有下列獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：

1)本發(fā)明的抗體和片段例如，通過(guò)抑制寡聚化(參見(jiàn)實(shí)例10)或通過(guò)其他機(jī)制，靶向和滅活或至少減少疾病引起的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維。

2)通過(guò)本發(fā)明的抗體和片段表現(xiàn)的對(duì)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的高的親和力減少治療需要的有效的臨床劑量。

3)與活性的免疫方法例如疫苗比較，本發(fā)明的抗體和片段提供在老年病人中精確劑量的模式。

4)在邊緣區(qū)/全身中對(duì)α-突觸核蛋白單體的低的結(jié)合，因此允許更多的抗體/片段可用于腦中α-突觸核蛋白寡聚形式的結(jié)合和清除。

5)抗體和片段通過(guò)對(duì)補(bǔ)體因子C1q低的或沒(méi)有的結(jié)合減少炎癥副作用的風(fēng)險(xiǎn)，例如，腦膜腦炎(meningioencephalitis)。

本發(fā)明的一個(gè)方面是CDR區(qū)域的抗體氨基酸序列的發(fā)現(xiàn)，其中所述CDR區(qū)域?qū)τ谌祟愐吧秃屯蛔凅wα-突觸核蛋白原細(xì)纖維的結(jié)合扮演重要的作用。通過(guò)對(duì)野生型人類α-突觸核蛋白寡聚體/原細(xì)纖維的高的親和力表征具有根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合位點(diǎn)(CDR區(qū)域)的抗體，以便用作治療或診斷。

免疫球蛋白(IgG)分子的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)包括通過(guò)二硫橋連接在一起的兩個(gè)同樣的輕鏈和兩個(gè)同樣的重鏈。輕鏈，其是λ或κ，具有每一個(gè)大約110個(gè)氨基酸殘基的可變區(qū)域(VL)和恒定區(qū)域(CL)。重鏈具有大約110個(gè)氨基酸殘基的可變區(qū)域(VH)，但是具有300-400個(gè)氨基酸殘基的更大的恒定區(qū)域(CH)，包括CHγ1、CHγ2和CHγ3區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。

恒定區(qū)(Fc)激活補(bǔ)體系統(tǒng)并結(jié)合到巨噬細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞上的Fc受體上，其吸收和破壞感染的微生物或外源的/非自身的抗原。這種功能是重要的，因?yàn)樗强贵w的治療原則的部分，例如，F(xiàn)c受體介導(dǎo)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用和α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的清除。已經(jīng)證明了通過(guò)溶酶體降解途徑調(diào)節(jié)的α-突觸核蛋白寡聚體的清除(Lee等人，2004)。這個(gè)過(guò)程涉及，在其中降解α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的溶酶體的融合之后，受體依賴的或非受體依賴的抗體/原細(xì)纖維復(fù)合物的內(nèi)吞作用(Masliah等人，2005)。已經(jīng)表明了控制這個(gè)過(guò)程的受體包括Thy1.1受體和與脂蛋白受體有關(guān)的蛋白質(zhì)(LPR)。

也可能操作其他的抗α-突觸核蛋白的清除機(jī)制?？扇芙獾摩?突觸核蛋白原細(xì)纖維的清除是根據(jù)本發(fā)明的治療的重要的機(jī)制，認(rèn)為α-突觸核蛋白原細(xì)纖維是高度地毒害神經(jīng)的，啟動(dòng)和加快了疾病過(guò)程。腦中α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的清除是重要的臨床評(píng)價(jià)的機(jī)制。除了α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的清除之外，將通過(guò)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維如，α-突觸核蛋白原細(xì)纖維、二聚體、三聚體、四聚體和更高的寡聚形式的前體形式的清除間接地簡(jiǎn)化包括α-突觸核蛋白原纖維的其他α-突觸核蛋白聚集的形式。包括原細(xì)纖維和原纖維的不同的α-突觸核蛋白形式保持平衡狀態(tài)。利用高的親和力的原細(xì)纖維結(jié)合抗體的治療并通過(guò)所述抗體對(duì)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的清除也具有間接地簡(jiǎn)化其他α-突觸核蛋白聚集的或寡聚的形式的優(yōu)勢(shì)。還有另一個(gè)抗體的作用機(jī)制是通過(guò)結(jié)合到毒性的α-突觸核蛋白種類和阻止它們的與神經(jīng)細(xì)胞的相互作用阻斷或抑制α-突觸核蛋白的毒性。

重鏈和輕鏈的各自的可變區(qū)含有稱作互補(bǔ)決定區(qū)或CDR的三個(gè)高變區(qū)(hyper variable regions)。CDR區(qū)域是位于VL和VH區(qū)域中的，大約7-23個(gè)，例如，13-23個(gè)氨基酸的短的延伸。抗體的一個(gè)“臂”上的六個(gè)CDR區(qū)域形成結(jié)合抗原的“口袋”。在文獻(xiàn)中使用CDR-序列的幾個(gè)定義。SEQ ID NOS:1-21利用第一識(shí)別系統(tǒng)定義發(fā)明的CDR-序列，因而在表格1中(參見(jiàn)實(shí)例2)通過(guò)下劃線區(qū)域在人類野生型和突變體α-突觸核蛋白原細(xì)纖維特異性單克隆抗體中的VL和VH中顯示識(shí)別的CDR序列。SEQ ID NOS:22-55利用已知的Kabat系統(tǒng)識(shí)別發(fā)明的CDR-序列，因而在表格2中(參見(jiàn)實(shí)例2)通過(guò)下劃線區(qū)域在人類野生型和突變種α-突觸核蛋白原細(xì)纖維特異性單克隆抗體中的VL和VH中顯示識(shí)別的Kabat CDR序列。在本公開中使用根據(jù)Kabat(SEQ ID NOS:22-55)發(fā)明的CDR-序列的識(shí)別。

因而，一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)具有六個(gè)CDR序列(VH-CDR-1、VH-CDR-2、VH-CDR-3、VL-CDR-1、VL-CDR-2、和VL-CDR-3)表征根據(jù)本發(fā)明的抗體，其中所述CDR序列選自以任意組合的方式的CDR序列的每個(gè)下列各自組。

VH CDR-1

VH CDR-2

VH CDR-3

VL CDR-1

VL CDR-2

KVSNRFS SEQ ID NO:17(SEQ ID NO:47)

RTSNLAS SEQ ID NO:18(SEQ ID NO:48)

WASTRES SEQ ID NO:49

VL CDR-3

排除了為了某些感興趣的特征最初選擇的一個(gè)抗體，因?yàn)樗荒軡M足根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)的定義的抗體。這種排除的重要的參數(shù)是具有由這種抗體暴露的五個(gè)氨基酸的相當(dāng)短的VH CDR-3序列。因此，推斷，VH CDR-3序列需要超過(guò)5個(gè)氨基酸。在具體的實(shí)施例中，VH CDR-3序列是9、10、11或12個(gè)氨基酸。

在具體的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的抗體和片段具有選自下列組合的六個(gè)CDR序列：

SEQ ID NOS:22，28，35，41，47和50，

SEQ ID NOS:23，29，36，42，47和50，

SEQ ID NOS:24，30，37，43，48和51，

SEQ ID NOS:25，31，38，44，47和52，

SEQ ID NOS:26，32，39，45，47和53，

SEQ ID NOS:23，33，37，43，48和54,和

SEQ ID NOS:27，34，40，46，49和55。

在另外的具體的實(shí)施例中，在滿足此處定義的其他重要的特征時(shí)，提供關(guān)于α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的期望的特異性的抗體具有選自下列下列各組的抗體或片段的六個(gè)CDR序列：

VH CDR-1 SEQ ID NOS:23，24，25或者26

VH CDR-2 SEQ ID NOS:29，30，31或者32

VH CDR-3 SEQ ID NO:36

VL CDR-1 SEQ ID NOS:42，43，44或者45

VL CDR-2 SEQ ID NOS:47或者48

VL CDR-3 SEQ ID NOS:50，51，52或者53

或選自下列各組：

VH CDR-1 SEQ ID NOS:23，24，25或者26

VH CDR-2 SEQ ID NOS:29，30，31或者32

VH CDR-3 SEQ ID NO:37

VL CDR-1 SEQ ID NOS:42，43，44或者45

VL CDR-2 SEQ ID NOS:47或者48

VL CDR-3 SEQ ID NOS:50，51，52或者53

或選自下列各組：

VH CDR-1 SEQ ID NOS:23，24，25或者26

VH CDR-2 SEQ ID NOS:29，30，31或者32

VH CDR-3 SEQ ID NO:38

VL CDR-1 SEQ ID NOS:42，43，44或者45

VL CDR-2 SEQ ID NOS:47或者48

VL CDR-3 SEQ ID NOS:50，51，52或者53

或選自下列各組：

VH CDR-1 SEQ ID NOS:23，24，25或者26

VH CDR-2 SEQ ID NOS:29，30，31或者32

VH CDR-3 SEQ ID NO:39

VL CDR-1 SEQ ID NOS:42，43，44或者45

VL CDR-2 SEQ ID NOS:47或者48

VL CDR-3 SEQ ID NOS:50，51，52或者53。

如先前提到的，通過(guò)對(duì)靶目標(biāo)的高的親和力表征α-突觸核蛋白原細(xì)纖維結(jié)合的根據(jù)本發(fā)明的抗體和片段。高親和力，以分離常數(shù)Kd表示，小于10^-7M。在另外的實(shí)施例中，對(duì)于人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的分離常數(shù)Kd小于10^-8M、小于10^-9M、小于10^-10M、或甚至小于10^-11M。與具有10^-6M周圍或更高的親和力的抗體比較，這些抗體和片段具有它們能夠以較低的劑量給予的優(yōu)勢(shì)。如這些能通過(guò)注射給予的高親和力抗體，能皮下給予，因?yàn)闉榱诉_(dá)到功效只需要低量的抗體，這具有重要的臨床優(yōu)勢(shì)。給予方式不限于皮下的或靜脈注射。此外，功效需要較低的劑量將減少用于抗體生產(chǎn)的物質(zhì)的成本。

除了抗體對(duì)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的高的親和力之外，抗體和片段對(duì)α-突觸核蛋白單體表現(xiàn)低的結(jié)合，和可選地對(duì)α-突觸核蛋白原纖維表現(xiàn)低的結(jié)合。如上述提到的，對(duì)α-突觸核蛋白單體的低的結(jié)合意味著，根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段對(duì)α-突觸核蛋白單體的結(jié)合小于對(duì)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的結(jié)合的至少100倍。在更具體的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段對(duì)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的結(jié)合超過(guò)對(duì)α-突觸核蛋白單體的結(jié)合的500倍或甚至超過(guò)1000倍。

在另一個(gè)實(shí)施例中，抗體和片段對(duì)α-突觸核蛋白原纖維表現(xiàn)低的結(jié)合。在更具體的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段對(duì)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的結(jié)合超過(guò)對(duì)α-突觸核蛋白原纖維的結(jié)合的100倍、500倍、或甚至超過(guò)1000倍。

在本發(fā)明的還有的另一個(gè)實(shí)施例中，抗體和片段對(duì)β淀粉樣(Aβ)原細(xì)纖維表現(xiàn)低的結(jié)合(例如，Kd>10^-5M)且對(duì)β淀粉體單體表現(xiàn)低的結(jié)合(例如，Kd>10^-5M)。

在本發(fā)明的還有的另一個(gè)實(shí)施例中，抗體和片段對(duì)β-突觸核蛋白單體、γ-突觸核蛋白單體、IAPP(胰島淀粉樣多肽(islet amyloid polypeptide))、和/或Medin多肽表現(xiàn)低的結(jié)合，例如，抗體和片段對(duì)一個(gè)或更多這些肽/蛋白質(zhì)的結(jié)合至少小于對(duì)人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的結(jié)合的100倍。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，能通過(guò)在模型系統(tǒng)中對(duì)氨基酸(aa)區(qū)域113-140內(nèi)的α-突觸核蛋白中的線性表位的結(jié)合限定為根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段，例如，aa區(qū)域113-131，具有aa 125-131、121-124、121-127、121-131、113-123和136-140作為特定的表位的實(shí)例。在這種模型系統(tǒng)中，使用具有11個(gè)氨基酸序列重疊的15-merα-突觸核蛋白肽(參見(jiàn)下列實(shí)例3)。

根據(jù)本發(fā)明的另外的實(shí)施例，提供抗體或片段，所述抗體或片段具有對(duì)人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維高的親和力和α-突觸核蛋白單體低的結(jié)合，且包含選自SEQ ID NO:22-27、28-34、35-40、41-46、47-49和50-52的每一個(gè)六個(gè)CDR序列組的一個(gè)CDR-序列的組合，且序列與每一個(gè)各自組中的所述序列的任何一個(gè)具有大于70、80、90、95或98％的相似性?？贵w或片段結(jié)合到氨基酸(aa)區(qū)域113-140內(nèi)的表位上，例如，aa區(qū)域113-131，和具體地模型系統(tǒng)中的固定的線性α-突觸核蛋白的表位aa125-131、121-124、121-127、121-131、113-123或136-140，其中所述系統(tǒng)包含具有11個(gè)氨基酸重疊的15-merα-突觸核蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施例，高親和力α-突觸核蛋白原細(xì)纖維結(jié)合的抗體能減少或抑制α-突觸核蛋白聚集，因此減少腦中可溶解的寡聚α-突觸核蛋白形式的水平。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施例，高親和力α-突觸核蛋白原細(xì)纖維結(jié)合的抗體也能結(jié)合CNS外面的α-突觸核蛋白寡聚體/原細(xì)纖維，因此以這樣的方式改變血腦屏障上的所述α-突觸核蛋白形式的平衡，以便降低所述α-突觸核蛋白形式的CNS水平(排除)。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體的實(shí)施例，抗體是IgG類型的抗體，適于能經(jīng)過(guò)血腦屏障的治療應(yīng)用?？稍O(shè)計(jì)高親和力α-突觸核蛋白原細(xì)纖維結(jié)合的IgG抗體，以便減少結(jié)合到IgG1的CH2結(jié)構(gòu)域上的補(bǔ)體因子C1q，并減少補(bǔ)體激活和炎癥的風(fēng)險(xiǎn)。能以幾種不同的方式完成這種修飾。一種方式是制造嵌合抗體，其中刪除了IgG1恒定區(qū)的CHγ2結(jié)構(gòu)域并換成IgG4的相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域或賦予C1q結(jié)合的部分結(jié)構(gòu)域。很確定，IgG4不結(jié)合C1q，因此不激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)。為了完成這個(gè)，以這樣的方式設(shè)計(jì)重鏈(CH)的恒定區(qū)，以使IgG1上的高親和力Fc-受體結(jié)構(gòu)域(CHγ3)與IgG4對(duì)補(bǔ)體因子C1q不具有結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(CHγ2)結(jié)合。含有嵌合的恒定的重鏈(IgG1：CHγ1、CHγ2：IgG4、CHγ3：IgG1)的這種新的抗體具有通過(guò)Fc-受體介導(dǎo)的吞噬作用使α-突觸核蛋白原細(xì)纖維有效的清除的重要的性能并減少副作用的風(fēng)險(xiǎn)，例如炎癥如腦膜腦炎的副作用的風(fēng)險(xiǎn)。

減少炎癥的風(fēng)險(xiǎn)的還有的另一個(gè)方式是改變抗體的寡聚糖結(jié)構(gòu)，其將減少補(bǔ)體因子C1q結(jié)合和補(bǔ)體激活作用。已經(jīng)描述了人類IgG1中Asn-297上的合成的雜合的寡聚糖的三十個(gè)不同的結(jié)構(gòu)。認(rèn)為CH2關(guān)聯(lián)的糖類的缺失引起抗體的“鉸鏈”區(qū)中的構(gòu)象的改變，減少與效應(yīng)器分子的相互作用的功效和補(bǔ)體激活功能和C1q結(jié)合的損失。

高親和力人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維結(jié)合抗體通過(guò)Asn-297的位置定點(diǎn)突變成任意其他的氨基酸的修飾將產(chǎn)生具有較少的C1q結(jié)合的保留Fc-受體結(jié)合的抗體，因此減少炎癥的風(fēng)險(xiǎn)，具體地是在血腦屏障上的炎癥的風(fēng)險(xiǎn)?？贵w上可替換地修飾糖基化是在其中已經(jīng)抑制了N-乙酰葡糖胺(acteylglucosaminyl)轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞類型中表達(dá)抗體。這將產(chǎn)生在Asn-297上具有改變的碳水化合物結(jié)構(gòu)的抗體。形成Man5GlcNAc2的結(jié)構(gòu)，但不限于這個(gè)結(jié)構(gòu)。這種碳水化合物修飾將減少補(bǔ)體因子C1q結(jié)合和抑制炎癥(Wright等人，1998)。可替換地，能通過(guò)在含有衣霉素的情況下培養(yǎng)表達(dá)抗體的細(xì)胞獲得無(wú)糖基化的(aglycosylated)原細(xì)纖維結(jié)合抗體，其中所述衣霉素抑制糖基化。這些抗體已經(jīng)改變了補(bǔ)體激活活性和改變Fc-受體功能(Leatherbarrow等人，1985)。具有低的補(bǔ)體激活和高的Fc-受體結(jié)合的表達(dá)抗體的克隆表達(dá)的篩選將產(chǎn)生原細(xì)纖維結(jié)合抗體，其表現(xiàn)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的高的Fc-介導(dǎo)的清除和低的C1q結(jié)合。

在另一個(gè)實(shí)施例中，高親和力人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維結(jié)合抗體是IgG亞型，例如，IgG1或IgG4，其中以這樣的方式已經(jīng)修飾了補(bǔ)體因子C1q結(jié)合位點(diǎn)，例如，Pro331>Ser331(Xu等人，1994)，以便減少或抑制補(bǔ)體因子C1q的結(jié)合。這樣的抗體特別地適合于，例如，用于治療、預(yù)防或推遲具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的發(fā)作，對(duì)患有這樣的疾病或在發(fā)展這樣的疾病的風(fēng)險(xiǎn)上的個(gè)體給予這樣的抗體，例如，但不限于，患有或具有發(fā)展成PD的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。也能將人類IgG1中的位置331上的脯氨酸殘基改變成蘇氨酸或甘氨酸或任何其他極性氨基酸。能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)如定點(diǎn)突變或DNA缺失完成這種修飾。

本發(fā)明的還有的另一個(gè)方面是關(guān)于具體地測(cè)定人類或動(dòng)物組織中的原細(xì)纖維水平的高親和力人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維結(jié)合抗體的應(yīng)用，例如，腦脊髓液(CSF)、血、尿、唾液、腦組織中，作為診斷工具或生物標(biāo)志用于，或用于監(jiān)測(cè)，患有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病。帕金森氏癥(PD)、路易體癡呆(DLB0、阿爾茨海默氏病的路易體變體、多發(fā)性系統(tǒng)萎縮癥、精神錯(cuò)亂、精神分裂癥、和克雅二氏癥僅僅是患有α-突觸核蛋白病理的這樣的神經(jīng)退化性疾病的例證。例如，如與不具有帕金森氏癥或任何其他α-共核蛋白病的匹配的老年的對(duì)照組相比，PD病人的CSF或血中的人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的水平可能是不同的。與對(duì)照的受試者相比，發(fā)展帕金森氏癥或任何其他α-共核蛋白病的人可能改變了CSF或血液中的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的水平。因此，CSF或血液中α-突觸核蛋白原細(xì)纖維水平的測(cè)定能提供所述疾病的早期診斷。對(duì)于以根據(jù)本發(fā)明的新的高親和力的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維結(jié)合抗體完成所述測(cè)定是可能的，且，在具體的實(shí)施例中，可結(jié)合三明治氏ELISA方法完成所述測(cè)定(參見(jiàn)實(shí)例5)，其中已經(jīng)測(cè)定了降至9pM水平的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維。可以忽略其他α-突觸核蛋白形式的干擾，具體地α-突觸核蛋白單體，和可選地α-突觸核蛋白原纖維和試驗(yàn)中的α-突觸核蛋白片段的干擾。

利用抗-α-突觸核蛋白原細(xì)纖維抗體分析這些組織和細(xì)胞培養(yǎng)基中的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的適當(dāng)?shù)姆椒ǖ膶?shí)例包含免疫分析如ELSA、RIA、蛋白質(zhì)印跡或斑點(diǎn)印跡(dot blotting)。這些方法適合于如通過(guò)臨床試驗(yàn)中原細(xì)纖維減少測(cè)量和/或如診斷檢驗(yàn)的下列治療功效。因?yàn)镃SF和血中的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維水平是非常低的，本發(fā)明的高親和力α-突觸核蛋白原細(xì)纖維結(jié)合抗體用于診斷檢驗(yàn)是有利的，例如，基于ELISA方法的診斷檢驗(yàn)，以允許低水平的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的測(cè)量。

根據(jù)這樣的方法，將根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段加入到包含或懷疑包含α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的生物樣品上，且檢測(cè)在α-突觸核蛋白原細(xì)纖維和抗體或片段之間形成的復(fù)合物(complex)的存在。可定性地檢測(cè)復(fù)合物，例如，檢測(cè)復(fù)合物的存在，或定性地，例如，如期望的，可檢測(cè)復(fù)合物的濃度或復(fù)合物的閾值濃度。

在另外的實(shí)施例中，本發(fā)明包括在用于人類和動(dòng)物組織中的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的檢測(cè)、定位和定量的成像中高親和力原細(xì)纖維特異性抗體和片段的應(yīng)用。可利用可檢測(cè)的標(biāo)簽標(biāo)記抗體或片段，例如，放射性的配體如I¹³¹、C¹⁴、H³或鎵⁶⁸，但不限于這些放射性同位元素，且與樣品接觸或?yàn)榱藱z測(cè)目的給予。這樣的方法適于用作具有α-突觸核蛋白病理的神經(jīng)退化性疾病的診斷工具，所述疾病包括，但不限于，帕金森氏癥、路易體癡呆和其他α-突觸核蛋白有關(guān)的神經(jīng)退化性疾病。在具體的實(shí)施例中，這樣的方法可指導(dǎo)監(jiān)測(cè)沒(méi)有或在藥物治療或其他可能的治療下的受試者中的α-突觸核蛋白有關(guān)的疾病的發(fā)展。

因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，將抗體加入到包含或懷疑包含α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的生物樣品中，測(cè)量所述原細(xì)纖維和所述抗體之間形成的復(fù)合物的濃度，用于樣品中原細(xì)纖維的檢測(cè)和/或定量化。在具體的實(shí)施例中，檢測(cè)方法包含免疫分析和鄰位連接技術(shù)(proximity ligation assay)。生物樣品可以是從受試者獲得的體外樣品和體內(nèi)液體。

本發(fā)明的還有的另一個(gè)方面是制造在獸醫(yī)中應(yīng)用的特定的抗體種類。列出的診斷方法也適合于獸醫(yī)應(yīng)用。

本發(fā)明的另一個(gè)方面是所述抗體的人源化，以便避免副作用，例如，以避免當(dāng)用作治療或診斷試劑時(shí)對(duì)抗人類中的抗體的免疫響應(yīng)。這樣的人源化技術(shù)在本領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人員的能力內(nèi)。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含此處描述的抗體或片段，和藥物學(xué)上可接受的載體。在治療應(yīng)用的具體的實(shí)施例中，組合物是生理學(xué)上可接受的配制劑，其包含在適于人類和/或動(dòng)物給予的生理學(xué)上的緩沖液中根據(jù)本發(fā)明的抗體或片段的治療上的活性量，所述緩沖液例如，但不限于，PBS。為了更好的固定性，能凍干抗體或片段。凍干的配制劑可含有任何適當(dāng)?shù)膫鹘y(tǒng)的賦形劑，包括固定劑、凍干支持劑(lyoprotectants)、緩沖液等等，如，但不限于，甘露醇，用于在凍干和/或后來(lái)的存儲(chǔ)期間和/或之后，保護(hù)和/或固定產(chǎn)品。

可選擇地，抗體配制劑可含有抗菌試劑或其他防腐劑或不干擾原細(xì)纖維結(jié)合抗體或片段的功能或功效的添加劑。

實(shí)施例

下列實(shí)施例用于說(shuō)明，并不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的這些具體的實(shí)施例。

實(shí)施例1

α-突觸核蛋白原細(xì)纖維抗體

免疫/多克隆抗體

在免疫方案中，利用Balb/C小鼠。如抗原，使用HNE固定的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維。如上面描述的生產(chǎn)這些，除了使用HNE和α-突觸核蛋白之間60:1的比率(WO 2009/133521，包括在此以供參考)。對(duì)于免疫，用HNE固定的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維和佐劑(例如，3-6倍)注射小鼠。在處死小鼠之前，進(jìn)行含有HNE-修飾的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的一個(gè)加強(qiáng)注射(booster injection)。分析對(duì)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維和α-突觸核蛋白單體反應(yīng)性的免疫的小鼠的血液。通過(guò)直接的ELISA分析多克隆抗體響應(yīng)的特異性。在典型的實(shí)驗(yàn)中，利用單體的α-突觸核蛋白(未修飾的或利用HNE或其他醛修飾的)、原細(xì)纖維/寡聚α-突觸核蛋白(未修飾的或利用HNE或其他醛修飾的)或纖維狀的α-突觸核蛋白，以400ng/孔的最終濃度包被在平底高度結(jié)合的96-孔聚苯乙烯微滴定板上。利用2％BSA封閉所述板，利用0.05％Tween-20/PBS洗滌板，并將來(lái)自研究的多克隆抗體的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液(未稀釋的或利用磷酸鹽緩沖的鹽1:1稀釋的)作為初級(jí)抗體加入到孔中。將1/1000的稀釋的堿性的磷酸酶-結(jié)合的山羊-抗鼠鼠IgG/IgM抗體(Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA)用作第二抗體。利用p-硝基苯磷酸鹽(p-nitrophenyl-phosphate)(Sigma-Aldrich,MO,USA)可視化顯示免疫反應(yīng)性。

在血清中，檢測(cè)特異性地識(shí)別α-突觸核蛋白原細(xì)纖維/寡聚體的抗體。另外，能發(fā)現(xiàn)識(shí)別α-突觸核蛋白單體的抗體。陰性對(duì)照代表未免疫的小鼠。

雜交瘤細(xì)胞/單克隆抗體

鼠B-細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞用于生產(chǎn)單克隆α-突觸核蛋白原細(xì)纖維結(jié)合抗體。分離脾細(xì)胞且將其放置在消過(guò)毒的磷酸鹽-緩沖的鹽(PBS)中，以及在1200×g上離心10min，以便收集細(xì)胞富集的顆粒狀物。進(jìn)一步利用PBS洗滌細(xì)胞，且在1200×g上離心10min。在以1％抗生素補(bǔ)充的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM，Invitrogen,La Jolla,CA,USA)中重懸細(xì)胞顆粒狀物。在DMEM中將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞(鼠骨髓瘤細(xì)胞系)以1:1比率混合。為了促進(jìn)細(xì)胞融合，將1ml聚乙二醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)加入到細(xì)胞混合物中，且添加DMEM終止反應(yīng)。收集細(xì)胞，且在以10％(v/v)胎牛血清(Cambrex,Charles City,IA,USA)補(bǔ)充的和也含有1％(v/v)丙酮酸鈉(Cambrex,Charles City,IA,USA)、1％(v/v)抗生素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和1％(v/v)L-谷氨酸(Cambrex,Charles City,IA,USA)、5％(v/v)BM條件介質(zhì)(BM condition media)(Roche Diagnostics Scandinavia,Bromma,Sweden)和2％(v/v)HAT介質(zhì)補(bǔ)充物(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)的DMEM中重懸顆粒狀物。將細(xì)胞平鋪在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，且允許保留并生長(zhǎng)2周。

在直接的ELISA中分析雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞上清液。在典型的實(shí)驗(yàn)中，利用單體的α-突觸核蛋白(未修飾的或利用HNE或其他醛修飾的)、寡聚/原細(xì)纖維α-突觸核蛋白(未修飾的或利用HNE或其他醛修飾的)或纖維狀的α-突觸核蛋白包被在平底高度結(jié)合96-孔聚苯乙烯微滴定板上。利用1％BSA封閉所述板，利用PBS-Tween 20(0.05％)洗滌板，并將來(lái)自研究的雜交瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液(未稀釋的或利用PBS-Tween 20(0.05％)1:2或1:5稀釋的)作為初級(jí)抗體加入到孔中。將1/5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶-結(jié)合的HRP-連接結(jié)合的山羊抗鼠Ig(Southern Biotechnology,prod.No.1010-05)用作第二抗體。利用K-藍(lán)色水性TMB基底液(K-Blue Aqueous TMB substrate)(Neogen Corp.prod.No.331177)可視化顯示免疫反應(yīng)性。

實(shí)施例2

α-突觸核蛋白原細(xì)纖維特異性單克隆抗體重鏈(VH)和輕鏈(VL/Vkappa)的可變區(qū)的氨基酸序列

通過(guò)mRNA模板的RT PCR，隨后通過(guò)DNA測(cè)序測(cè)定抗體的重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區(qū)的氨基酸序列，包括抗體的CDR區(qū)域的氨基酸序列。在表格1中顯示選擇性的抗體的可變重鏈區(qū)域(VH)和可變輕鏈區(qū)域(VL)的氨基酸序列。在CDR區(qū)域1-3的位置下劃線并顯示。CDR區(qū)域的氨基酸序列形成結(jié)合人類野生型和組成α-突觸核蛋白的“致病的表位”的突變的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

在表格1中顯示根據(jù)本發(fā)明的原細(xì)纖維特異性抗體的各自的VL和VH鏈的CDR區(qū)域1-3的氨基酸序列。在表格2中，包括根據(jù)本發(fā)明的一系列另外的抗體的CDR-序列。

VH和VL鏈的CDR1-3區(qū)域的組合的氨基酸序列形成以高親和力和特異性結(jié)合人類α-突觸核蛋白野生型原細(xì)纖維的分子“口袋”。這種“口袋”形成“PD/DLB表位”的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在VH鏈和VL鏈兩種鏈中都觀察到CDR氨基酸序列長(zhǎng)度中的變化，且所述變化與對(duì)人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的結(jié)合一致。較短的CDR區(qū)域提供更加有限的三維結(jié)構(gòu)的抗體結(jié)合口袋，然而較長(zhǎng)的CDR區(qū)域更靈活。

如在表格1和2中示出的CDR序列是本發(fā)明的實(shí)施例，因?yàn)樗鼈兪荲H和VL鏈的“鼠框架”區(qū)域中的氨基酸序列，例如，CDR區(qū)域外面的，和原細(xì)纖維特異性抗體的人類VL和VH框架區(qū)域，但不限于那些。

與在表格1和2中示出的相比較，CDR區(qū)域中的其他氨基酸置換與高親和力和高特異性結(jié)合人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維相同。其中極性氨基酸在能通過(guò)一個(gè)極性氨基酸置換的具體的氨基酸的CDR區(qū)域中的具體的位置中出現(xiàn)，對(duì)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維具有保留的或改進(jìn)的高親和力和特異性結(jié)合。同樣地，如果非極性或負(fù)或正帶電荷的氨基酸在某些位置中出現(xiàn)，能通過(guò)來(lái)自相同的極性組的相似的氨基酸置換某些位置上的氨基酸。

如通過(guò)功能等效物在CDR區(qū)域中的任何位置中交換具體的氨基酸，其中功能的等效物賦予關(guān)于α-突觸核蛋白原細(xì)纖維親和力的抗體充分地相同的功能和結(jié)構(gòu)，這樣的構(gòu)造當(dāng)然在本發(fā)明的范疇內(nèi)。在這點(diǎn)上，與一個(gè)先前指示的各自組的VH CDR和VL CDR序列具有大于70、80、90、95或98％的相似性的抗體和片段，具有在本文中描述的維持的表位結(jié)合，都在本發(fā)明的范疇內(nèi)。

表格1.來(lái)自人類野生型和突變?chǔ)?突觸核蛋白原細(xì)纖維特異性的四個(gè)不同單克隆抗體的重鏈(VH)和輕鏈(VL/Vκ)的可變區(qū)的氨基酸序列。在VL和VH中的各種CDR區(qū)域(1-3)的位置有下劃線?？贵wBA1-BA4是根據(jù)本發(fā)明的高親和力原細(xì)纖維特異性抗體的實(shí)例。

表格2.來(lái)自人類野生型和突變?chǔ)?突觸核蛋白原細(xì)纖維特異性的八個(gè)不同抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的氨基酸序列。標(biāo)記根據(jù)Kabat系統(tǒng)的各種CDR-區(qū)域的位置?？贵w是根據(jù)本發(fā)明的高親和力原細(xì)纖維特異性抗體的實(shí)例。重鏈分別是SEQ ID NO:64-71和輕鏈分別是SEQ ID NO:72-79。

重鏈

輕鏈

突出CDR1-3。

實(shí)施例3

α-突觸核蛋白原細(xì)纖維特異性單克隆抗體的表位測(cè)定(Epitope mapping)

通過(guò)在Pepspots膜上的蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行抗體的表位測(cè)定。通常通過(guò)JPT Peptide Technologies(Sigma Aldrich,UK的子公司)合成生成人類α-突觸核蛋白的全部序列(氨基酸1-140)的合成的多肽，且固定在Pepspots膜上。以11個(gè)氨基酸序列重疊設(shè)計(jì)33合成的15-mer肽。所述肽通過(guò)C-末端共價(jià)地連接到Whatman 50纖維素膜上(Whatman,England)，且由于對(duì)于降解的更高的穩(wěn)定性通常乙?；疦-末端。未改變的N-ac較好的代表天然的抗原中的區(qū)域，然后使NH³⁺-集團(tuán)帶電荷。在表格3中列出結(jié)果。

表格3

人類α-突觸核蛋白(SEQ ID NO:80)

可替換地，通過(guò)在Pepspots膜(Sigma Aldrich)上的蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行抗體的表位測(cè)定，如下：習(xí)慣合成生成從氨基酸100到140的人類α-突觸核蛋白的C-末端序列的合成的肽，且在Pepspots膜(Sigma Aldrich)上固定。以9個(gè)氨基酸重疊設(shè)計(jì)30合成的10-mer多肽。在表格4中顯示結(jié)果。

表格4：

因此，表位的長(zhǎng)度和精確位置依賴用于測(cè)定的方法。

實(shí)施例4

通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA顯示高親和力人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維結(jié)合的單克隆單體的特征

這個(gè)實(shí)施例顯示四個(gè)抗體(mAb49/G、mAb38E2/7、mAb38Fl l/2_8和mAb48Bll/8)。如依靠下面描述的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA分析測(cè)量的，這些抗體對(duì)α-突觸核蛋白原細(xì)纖維顯示高的親和力，且對(duì)α-突觸核蛋白單體顯示低的交叉反應(yīng)性(結(jié)合)。簡(jiǎn)要地，允許要檢驗(yàn)的抗-α-突觸核蛋白抗體在溶液中與α-突觸核蛋白單體或原細(xì)纖維相互作用，其后，將混合物加入到預(yù)包被有α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的微滴定板中。如果抗體結(jié)合到預(yù)孵育步驟中的抗原上，較少的抗體將結(jié)合到微滴定板上的固定的抗原上。通過(guò)堿性磷酸酶(APL)結(jié)合的第二抗體檢測(cè)結(jié)合到固定的抗原上的抗體。利用產(chǎn)生黃色的ALP基質(zhì)(pNPP)孵育結(jié)合物，所述黃色能在微滴定板讀取器中在405nm上檢測(cè)。因此，低OD值反應(yīng)溶液中抗體對(duì)抗原的高親和力。

具體地，以100μl/孔的在1×PBS中稀釋的1μg/ml的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維包被在高度結(jié)合的ELISA微滴定板上，利用帶粘性的密封層密封且在+4℃孵育過(guò)夜。然后，丟棄包被溶液，且通過(guò)添加200μl/孔的PBS-Tween 20(0.05％)封閉板的殘余的結(jié)合能力。將密封板在室溫下(R.T.)通過(guò)900rpm的搖動(dòng)孵育60min。

同時(shí)，在1×PBS-Tween 20(0.05％)中，通過(guò)將α-突觸核蛋白單體或原細(xì)纖維稀釋成140nM的濃度制備多肽溶液。在圓底的、低蛋白結(jié)合的微滴定板中，在50μl的體積中進(jìn)行α-突觸核蛋白單體和原細(xì)纖維的10步的3×稀釋系列。關(guān)于這種溶液，加入在PBS-Tween 20(0.05％)中稀釋成100ng/ml的50μl的檢驗(yàn)的抗體，且允許其在R.T.下通過(guò)在900rpm上搖動(dòng)60min相互作用。隨后，將這些預(yù)孵育的樣品加入到洗滌過(guò)的(3×洗滌)包被的高結(jié)合的板上，且允許在R.T.下，而沒(méi)有搖動(dòng)的情況下孵育15min。然后洗滌ELISA板，以便清除未結(jié)合的抗體。利用在PBS-Tween20(0.05％)中以1/1000稀釋的100μl ALP-連接結(jié)合的抗-鼠-IgG檢測(cè)結(jié)合的抗體，且在R.T.下通過(guò)在900rpm上搖動(dòng)孵育60min。

最終，洗滌ELISA板，以便清除未結(jié)合的抗體并將100μl ALP-基質(zhì)加入到每孔中。在R.T.孵育期間將板保持黑暗，直到形成黃色。每隔15min到120min，在405nm的波長(zhǎng)上在連續(xù)的模式上測(cè)量吸光值。如果時(shí)間和吸光率之間存在線性關(guān)系，測(cè)量結(jié)果可用于IC 50測(cè)定。

以需要達(dá)到ELISA中的一半的信號(hào)的單體或原細(xì)纖維的濃度計(jì)算IC50值。通過(guò)方法UV-SEC，利用作為參考的商業(yè)的α-突觸核蛋白標(biāo)準(zhǔn)(cat.S-1001-1,rPeptide,USA,0.5mg作為利用BCA的檢測(cè))檢測(cè)這種方法中使用的α-突觸核蛋白單體或原細(xì)纖維的濃度。圖1顯示如通過(guò)描述的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)的四個(gè)原細(xì)纖維特異性單克隆抗體在450nm上的吸光率。利用HNE-固定的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維進(jìn)行試驗(yàn)。

進(jìn)一步的ELISA實(shí)驗(yàn)顯示，候選的抗體對(duì)通過(guò)HNE或ONE固定的人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維顯現(xiàn)相同的親和力。如依靠競(jìng)爭(zhēng)性ELISA證明的，抗體也結(jié)合通過(guò)HNE固定的A30P或A53Tα-突觸核蛋白突變種組成的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維/聚集體。

特異性地，圖2A和2B顯示通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA分析的原細(xì)纖維特異性抗體mAb49/G的結(jié)果。原細(xì)纖維特異性單克隆抗體mAb49/G以高親和力結(jié)合到通過(guò)HNE或ONE固定的人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維上(圖2A)。單克隆抗體也以高親和力結(jié)合到α-突觸核蛋白的人類突變的形式的HNE-固定的原細(xì)纖維，A30P和A53T上(圖2B)。如通過(guò)尺寸排阻色譜定義的，利用ONE的α-突觸核蛋白單體的聚集產(chǎn)生兩個(gè)截然不同的復(fù)合物種群。分別地洗脫這兩個(gè)截然不同的峰并標(biāo)記為FP-ONE_大和FP-ONE_小。

另外，圖3A-3C顯示通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA分析的另外的原細(xì)纖維特異性抗體38E2/7、38F11/2_8和48B11/8的結(jié)果。原細(xì)纖維特異性單克隆抗體以高親和力結(jié)合到通過(guò)HNE(PF-HNE)或ONE(PF-ONE)固定的野生型人類α-突觸核蛋白原細(xì)纖維上。單克隆抗體也以高親和力結(jié)合到α-突觸核蛋白的人類突變的形式的HNE-固定的原細(xì)纖維A30P(A30P-HNE)和A53T(A30P-HNE)上。

實(shí)施例5

α-突觸核蛋白原細(xì)纖維特異性三明治氏ELISA的建立

為了能夠測(cè)量生物樣品中的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維，建立作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體的具有mAb49/G的三明治式ELISA。這個(gè)試驗(yàn)測(cè)量具有量化LOQ＝9pM的限制的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維(參見(jiàn)圖4B)。由于關(guān)于在標(biāo)準(zhǔn)的曲線中使用的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的大小的不確定，pM中的濃度基于一個(gè)α-突觸核蛋白單體的分子量(14000g/mol)。因?yàn)橥ㄟ^(guò)尺寸排阻色譜，已經(jīng)評(píng)價(jià)了至少1,000,000g/mol的原細(xì)纖維的分子量，如摩爾α-突觸核蛋白原細(xì)纖維計(jì)算的檢測(cè)的限制能低至0.13pM。

通過(guò)HNE固定的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維和單體的α-突觸核蛋白用于驗(yàn)證ELISA的構(gòu)造特異性。

由兩個(gè)同一的抗體組成的ELISA需要蛋白質(zhì)的至少二聚體，以便產(chǎn)生信號(hào)。然而，大量過(guò)量的單體的α-突觸核蛋白，其可在生物樣品中自然地出現(xiàn)，能通過(guò)占據(jù)捕獲抗體包被的結(jié)合位點(diǎn)干擾α-突觸核蛋白原細(xì)纖維結(jié)合，因此抑制原細(xì)纖維結(jié)合。通過(guò)將增加的過(guò)量的α-突觸核蛋白單體加入到固定濃度的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維(500pM，表示成單體單元)中研究這種問(wèn)題，且利用mAb49/G ELISA分析。如期望的，因?yàn)棣?突觸核蛋白單體很少結(jié)合到捕獲抗體上，如與α-突觸核蛋白原細(xì)纖維(500pM)比較，30000-倍摩爾過(guò)量的α-突觸核蛋白單體(15μM)不擾亂利用mAb49/G三明治式ELISA的測(cè)量。

圖4A顯示通過(guò)三明治式ELISA關(guān)于α-突觸核蛋白原細(xì)纖維量化的ELISA結(jié)合的示意圖。圖4B顯示利用HNE-固定的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)的曲線。試驗(yàn)性能達(dá)到量化LOQ＝9pM的限制。

實(shí)施例6

利用α-突觸核蛋白原細(xì)纖維特異性三明治式ELISA進(jìn)行患病的和對(duì)照組人類腦提取物的分析

利用不同的洗劑進(jìn)行腦提取方案，產(chǎn)生三個(gè)不同的提取物：TBS提取物(圖5A，白色柱)，包含細(xì)胞外和細(xì)胞質(zhì)α-突觸核蛋白種類；Triton提取物(圖5A，條紋柱)，包含膜-關(guān)聯(lián)的α-突觸核蛋白種類；和SDS提取物(圖5B，黑色柱)，包含SDS-可溶解的α-突觸核蛋白種類。分析診斷的患有α-共核蛋白病路易體癡呆(DLB)的病人的腦提取物。分析皮質(zhì)和黑質(zhì)的腦組織。作為對(duì)照，也分析沒(méi)有可檢測(cè)的免疫組織化學(xué)的路易體病理的受試者的腦組織。三明治式ELISA基于作為捕獲抗體和檢測(cè)抗體的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維特異性mAb49/G。圖5A和5B顯示利用α-突觸核蛋白原細(xì)纖維特異性三明治式ELISA，患病的和對(duì)照的人類腦組織提取物的分析的結(jié)果。試驗(yàn)允許在大于9pM的水平上的原細(xì)纖維的量化(量化限制；LOQ＝9pM)。

實(shí)施例7

PD轉(zhuǎn)基因的小鼠模型的腦提取物中的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的測(cè)量

盡管迄今為止不存在關(guān)于生物樣品中的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的直接的分析方法，但已經(jīng)表明了細(xì)胞和小鼠模型中的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的存在。mAb49/G三明治式ELISA因此提供測(cè)量α-共核蛋白病的生物樣品和小鼠模型中的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的首次機(jī)會(huì)，所述α-共核蛋白病由聚集的α-突觸核蛋白的積聚表征。

將過(guò)表達(dá)人類α-突觸核蛋白A53T突變體的轉(zhuǎn)基因的小鼠的腦提取物樣品與來(lái)自野生型小鼠的樣品比較。在TBS或TBS+tween中使腦組織均勻，且在分析之前離心，以便重新獲得可溶解的α-突觸核蛋白片段。非轉(zhuǎn)基因的小鼠腦勻漿的TBS-可溶解的片段中的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維水平的測(cè)量與轉(zhuǎn)基因的小鼠中的比較(Kahle模型)(圖6)。為了確保這個(gè)試驗(yàn)中測(cè)量的所有的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維是在可溶解的狀態(tài)中，在分析之前，將所有的樣品在16000×g上離心5min。測(cè)量具有α-突觸核蛋白病理的5個(gè)月大的轉(zhuǎn)基因的小鼠的腦中的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維的水平。

圖6顯示對(duì)照組小鼠(ntg，非轉(zhuǎn)基因的)和5個(gè)月大的Kahle轉(zhuǎn)基因的(tg)小鼠PD模型的腦提取物的分析的結(jié)果，其中，y軸代表在OD450上的吸光率。

實(shí)施例8

人類腦組織的免疫組織化學(xué)(IHC)分析

如描述的，來(lái)自PD和DLB病人的皮質(zhì)和黑質(zhì)用于進(jìn)行免疫組織化學(xué)(IHC)分析(Oinas等人，2010)。作為對(duì)照，使用來(lái)自年齡匹配的非患病的病人的皮質(zhì)和黑質(zhì)。α-突觸核蛋白的陽(yáng)性抗體對(duì)照是鼠抗-α-突觸核蛋白mAb(BD 610787)。

如下評(píng)價(jià)Aβ噬菌斑的結(jié)合：處理來(lái)自AD病人的皮質(zhì)的兩個(gè)連續(xù)的載玻片，以便顯示抗原，且利用陽(yáng)性抗-AβmAb(mAbl58,BioArctic)或利用每一個(gè)候選的抗體孵育。通過(guò)連接到辣根過(guò)氧化酶(HRP)上的第二抗-種類特定的抗體檢測(cè)結(jié)合的抗體。然后利用HRP基質(zhì)DAB孵育結(jié)合物，產(chǎn)生有色的沉淀物，其可通過(guò)光顯微鏡方法檢測(cè)。在利用候選的抗體處理的載玻片中的共分別的區(qū)域分析通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照中的有色的沉淀檢測(cè)Aβ噬菌斑的區(qū)域。視覺(jué)上評(píng)價(jià)有色的沉淀的缺失，且解釋為通過(guò)候選的抗體對(duì)于Aβ噬菌斑的結(jié)合的缺失。

圖7A顯示路易體的38E2/7結(jié)合和PD黑質(zhì)中的神經(jīng)突和陽(yáng)性α-α-突觸核蛋白對(duì)照。圖7B顯示路易體的38E2/7結(jié)合和DLB皮質(zhì)和黑質(zhì)中的神經(jīng)突和陽(yáng)性α-α-突觸核蛋白對(duì)照。圖7C顯示各種抗體結(jié)合的路易體和DLB皮質(zhì)和黑質(zhì)中的神經(jīng)突和陰性對(duì)照。圖7D顯示各種抗體結(jié)合的路易體和PD黑質(zhì)中的神經(jīng)突和陰性對(duì)照。圖7E顯示在非疾病有關(guān)的黑質(zhì)中沒(méi)有38E2/7的結(jié)合和陽(yáng)性α-α-突觸核蛋白對(duì)照。圖7F顯示阿爾茨海默氏癥病人的皮質(zhì)中的38E2/7結(jié)合和陽(yáng)性α-Aβ對(duì)照的比較。

實(shí)施例9

利用免疫沉淀反應(yīng)(IP)和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行人類腦提取物的分析

利用蛋白質(zhì)印跡指導(dǎo)人類腦提取物和原細(xì)纖維結(jié)合的單克隆抗體38E2/7的免疫沉淀反應(yīng)。利用四個(gè)不同的洗劑進(jìn)行腦提取實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生四個(gè)不同的提取物：TBS提取物，包含細(xì)胞外和細(xì)胞質(zhì)α-突觸核蛋白種類；Triton提取物，包含膜-相關(guān)的α-突觸核蛋白種類；和SDS提取物，包含SDS-可溶解的α-突觸核蛋白種類和FA提取物，包含不可溶解的α-突觸核蛋白。利用抗體38E2/7或?qū)φ湛贵w15P能連接到其上的磁性珠使這些提取物免疫反應(yīng)?？贵w15P能同樣地結(jié)合到α-突觸核蛋白原細(xì)纖維和單體上，且期望結(jié)合(pull down)出現(xiàn)的所有的種類。圖8A顯示DLB病人的黑質(zhì)的SDS提取物，而圖8B顯示DLB病人的黑質(zhì)的Triton提取物。如看到的，在圖8A和8B中，mAb38E2/7只捕獲來(lái)自DLB黑質(zhì)的α-突觸核蛋白原細(xì)纖維，兩者都在Triton和SDS提取物中，然而mAb 15捕獲所有提取物中的α-突觸核蛋白單體。

實(shí)施例10

α-突觸核蛋白寡聚化抑制的分析

這個(gè)實(shí)施例顯示抗體mAb49/G利用以2個(gè)載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)細(xì)胞的體外方法抑制α-突觸核蛋白單體的寡聚化，兩者都含有與GFP的N-末端或C-末端片段融合的α-突觸核蛋白的一個(gè)拷貝(aa 1-140)。只有那些細(xì)胞中，α-突觸核蛋白在其中寡聚，引起兩個(gè)GFP片段連接在一起，將產(chǎn)生能利用熒光顯微鏡檢測(cè)的綠色熒光。與沒(méi)有抗體添加的對(duì)照組比較，能通過(guò)比較這些培養(yǎng)基中的熒光評(píng)價(jià)能抑制和/或破壞寡聚化的抗體的存在。

具體地，利用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)將含有利用GFP(aa1-155)的N-末端片段融合的α-突觸核蛋白(aa1-140)或利用GFP(aa 156-238)的C-末端片段融合的α-突觸核蛋白(aa 1-140)的等摩爾比率的DNA-構(gòu)造，轉(zhuǎn)染H4神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。同時(shí)地，對(duì)照抗-α-突觸核蛋白單克隆抗體(mAb5C2,Santa Cruz Bio)和mAb49/G以1μg/ml的終濃度細(xì)胞外地加入到細(xì)胞中。將細(xì)胞在37℃5％CO₂中孵育24小時(shí)。在24小時(shí)之后，將細(xì)胞移動(dòng)到30℃，以便GFP-熒光的完全的重組，且孵育另外的24小時(shí)的時(shí)間。利用裝備FITC落射熒光濾光器的Axiovert 200顯微鏡測(cè)量熒光。如與將其設(shè)為100％的抗體未處理的α-突觸核蛋白過(guò)表達(dá)的細(xì)胞相比較，相對(duì)％熒光強(qiáng)度計(jì)算所有的數(shù)據(jù)。

如圖9A中看到的，利用mAb49/G處理在α-突觸核蛋白寡聚化中顯示顯著的(*p<0.05)減少(與未處理的細(xì)胞比較在熒光強(qiáng)度中42％減少)。圖9B顯示與設(shè)為100％的未處理的α-突觸核蛋白過(guò)表達(dá)的細(xì)胞相比較，百分比熒光強(qiáng)度的用圖表表示的結(jié)果。

此處描述的特定的實(shí)例和實(shí)施例在本質(zhì)上僅作為例證，并不意在限制由權(quán)利要求限定的本發(fā)明?？紤]到這個(gè)說(shuō)明書，進(jìn)一步的實(shí)施例和實(shí)例及其優(yōu)勢(shì)對(duì)于本領(lǐng)域的一個(gè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，且它們都在所要求保護(hù)的發(fā)明的范疇內(nèi)。

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