基于部分還原氧化石墨烯的dna熒光檢測方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于部分還原氧化石墨烯熒光共振能量轉(zhuǎn)移納米探針的DNA熒光檢測方法及其試劑盒，屬于分析化學(xué)及納米技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]氧化石墨稀是一種性能優(yōu)異的新型碳納米材料，具有較高的比表面積和豐富的表面官能團(tuán)，其理想的晶格結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的光學(xué)、表面、機(jī)械、電學(xué)及熱學(xué)性質(zhì)在生物和化學(xué)傳感器、儲(chǔ)能器件及復(fù)合材料等諸多領(lǐng)域都具有良好的應(yīng)用前景。
[0003]熒光共振能量轉(zhuǎn)移是能量由供體熒光團(tuán)經(jīng)無輻射途徑轉(zhuǎn)移給受體熒光團(tuán)，并引起供體熒光猝滅和受體熒光增強(qiáng)的光學(xué)現(xiàn)象。近年來，人們致力于開發(fā)基于氧化石墨烯熒光淬滅效應(yīng)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳感器，并將其用于生物及化學(xué)檢測。研究表明，由于氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其對帶有裸露的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的化合物具有強(qiáng)烈的吸附能力。單鏈DNA(ssDNA)中的堿基包含六元環(huán)結(jié)構(gòu)，氧化石墨烯會(huì)與裸露的堿基發(fā)生強(qiáng)烈的JT-JT相互作用、疏水作用等，從而吸附ssDNA。而在雙鏈DNA (dsDNA)中磷酸骨架將堿基有效屏蔽在其中，使氧化石墨稀無法與堿基接觸，從而造成結(jié)合能力的減弱。利用氧化石墨稀結(jié)合不同分子結(jié)構(gòu)的DNA能力的差異，以氧化石墨烯作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移納米探針，可以測定特定序列的DNA含量。
[0004]本發(fā)明提供了一種基于部分還原氧化石墨烯熒光共振能量轉(zhuǎn)移納米探針的DNA熒光檢測方法及其試劑盒。部分還原氧化石墨烯通過氧化石墨烯在堿性溶液中的室溫控制還原得到，在保持水溶液體系穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，有效增加了 sp2雜化晶域，對熒光分子修飾ssDNA的熒光猝滅效率和猝滅速度均大幅度提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種基于部分還原氧化石墨烯熒光共振能量轉(zhuǎn)移納米探針的DNA檢測方法。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種基于部分還原氧化石墨烯的DNA熒光檢測試劑盒。試劑盒中包括提供部分還原氧化石墨烯(a液)，探針鏈DNA溶液(b液)。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:本發(fā)明所述的一種基于部分還原的氧化石墨烯的DNA熒光檢測方法，其特征是將6-羧基熒光素標(biāo)記單鏈DNA與目標(biāo)鏈DNA加入到Tris-HCl緩沖液中，雜交反應(yīng)后加入部分還原氧化石墨稀，室溫反應(yīng)，測定520 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為494 nm;所使用的部分還原氧化石墨烯由以下方法制備而得:將4 mg/mL氧化石墨烯水溶液與10 mmol/L NaOH水溶液等體積混合，將混合物在室溫條件下攪拌反應(yīng)后所得的懸浮液離心分離，并用純凈水洗滌至中性，干燥，獲得的沉淀物為部分還原氧化石墨稀。
[0008]所述的部分還原氧化石墨烯對6-羧基熒光素標(biāo)記單鏈DNA的熒光猝滅率為99.3%。
[0009]將40 mL 500 nmol/L 6-羧基熒光素標(biāo)記單鏈DNA與40 mL目標(biāo)鏈DNA加入到405mL 濃度為 10 mmol/L 的 pH 為 8.0 且含 50 mmol/L NaCl 和 1 mmol/L EDTA 的 Tris-HCl 緩沖液中，37 °C條件下雜交30分鐘，加入15 mL 100 mg/mL部分還原氧化石墨稀，室溫反應(yīng)30秒，測定520 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為494 nm。
[0010]上述的目標(biāo)鏈DNA檢測線性范圍為0.2-40 nmol/L，檢測限為50 pmol/L。
[0011]本發(fā)明所述的一種基于部分還原氧化石墨烯的DNA熒光檢測試劑盒，其特征是試劑盒包括a液和b液；a液為部分還原氧化石墨烯溶液，b液為含探針鏈FAM-ssDNA的Tris-HCl緩沖液。
[0012]上述的a液為濃度為100 mg/mL的部分還原氧化石墨稀水溶液。
[0013]上述的b 液為含 44.94 nmol/L 探針鏈 FAM-ssDNA 的 10 mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液，所述的 Tris-HCl 緩沖液其 pH 為 8.0，且含 50 mmol/L NaCl 和 lmmol/L EDTA。
[0014]本發(fā)明所述的一種基于部分還原氧化石墨烯的DNA熒光檢測試劑盒的使用方法為:40 mL目標(biāo)鏈DNA加入到445 mL b液中，混合后在37 °(:條件下雜交反應(yīng)30分鐘，在混合溶液中加入15 mL a液，混合后室溫反應(yīng)30秒，測定520 nm處的熒光強(qiáng)度F，激發(fā)波長為494 nmD
[0015]上述的目標(biāo)鏈DNA檢測線性范圍為0.2-40 nmol/L，檢測限為50 pmol/L。
[0016]所述的方法，能區(qū)分單堿基錯(cuò)配DNA和目標(biāo)鏈DNA。
[0017]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
(一)氧化石墨烯的制備
氧化石墨烯的制備:稱取325目鱗片石墨，加入到體積比為9:1的濃硫酸和磷酸混合溶液中。充分?jǐn)嚢韬?，置于? °C冰浴中。將高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中。保持0 °C冰浴，磁力攪拌3小時(shí)后，將所得墨綠混懸液轉(zhuǎn)移至35 °(:溫水浴中，控溫1小時(shí)，然后再將混懸液轉(zhuǎn)移至50 °(:溫水浴中，控溫12小時(shí)。將一定量的冰水混合物緩慢加入到得到的紫黑色混懸液中，劇烈攪拌1小時(shí)。繼而往溶液中逐滴滴加30%過氧化氫溶液，至溶液顏色突變?yōu)榱咙S色。所得溶液經(jīng)G1砂芯漏斗(孔徑20-30微米)過濾，繼而4000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，分別經(jīng)過水洗一次，酸洗一次，醇洗至中性，最后用乙醚沖洗后經(jīng)G5砂芯漏斗(孔徑1.5-2.5微米)過濾。濾餅在室溫下過夜晾干，得到氧化石墨烯固體。
[0018](二)部分還原氧化石墨烯熒光共振能量轉(zhuǎn)移納米探針的制備
將4 mg/mL上述方法制備的氧化石墨稀水溶液與10 mmol/L的NaOH水溶液等體積混合，室溫條件下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，并用水洗滌至中性。最后置于恒溫干燥箱50 °C干燥12小時(shí)，得到部分還原氧化石墨烯固體。
[0019](三)DNA檢測
將40 nmol/L 6-羧基熒光素標(biāo)記單鏈DNA(FAM-ssDNA)與不同濃度目標(biāo)鏈DNA混合，37°C條件下雜交30分鐘，雜交緩沖液為10 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0，含50 mmol/L NaCl和1 mmol/L EDTA)。加入3 mg/mL部分還原氧化石墨稀，反應(yīng)30秒，用焚光分光光度計(jì)檢測熒光(激發(fā)波長494 nm)。
[0020]為了實(shí)現(xiàn)上述試劑盒的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
(四)試劑盒組成
a液包括上述技術(shù)方案(二)制備的部分還原氧化石墨烯加入超純水超聲分散所形成的溶液，其濃度為100 mg/mLo b液為含44.94 nmol/L探針鏈DNA的10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0，含 50 mmol/L NaCl 和 lmmol/L EDTA)。
[0021](五)試劑盒使用方法
將目標(biāo)鏈DNA 40 mL加入到445 mL技術(shù)方案(四)的b液，混合后37 °C雜交30分鐘。加入15 mL技術(shù)方案(四)的a液，混合后室溫條件下反應(yīng)30秒，立即用494 nm激發(fā)波長檢測其520 nm處熒光強(qiáng)度(F)。以F (含有目標(biāo)鏈DNA)與F。(空白)的差值(F- F。)對目標(biāo)鏈DNA繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。熒光分光光度法測定的檢測限為50 pmol/L ο
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
(1)本發(fā)明使用部分還原的氧化石墨烯為探針，吸附單鏈DNA能力強(qiáng)，用量少，反應(yīng)迅速等特點(diǎn)。
[0023](2)本發(fā)明使用的部分還原的氧化石墨烯納米材料其本身具有良好的水溶性，熒光背景低等性質(zhì)，不需要任何前修飾步驟。
[0024](3)本發(fā)明在檢測DNA中測定靈敏度高，DNA檢測限為50 pmol/L。
[0025](4)本發(fā)明檢測DNA選擇性好，能有效區(qū)分單堿基錯(cuò)配和非互補(bǔ)DNA序列。
【附圖說明】
[0026]圖1為氧化石墨烯、部分還原氧化石墨烯與FAM-ssDNA作用的熒光光譜圖。
[0027]圖2為部分還原氧化石墨烯對FAM-ssDNA的猝滅動(dòng)力學(xué)曲線。
[0028]圖3為檢測不同濃度目標(biāo)DNA時(shí)的熒光光譜圖。
[0029]圖4為目標(biāo)DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0030]圖5為DNA檢測特異性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供一種基于部分還原氧化石墨烯的DNA熒光檢測方法。以下結(jié)合附圖及若干實(shí)施例對本發(fā)明檢測方法的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。
[0032]實(shí)例1:
稱取325目鱗片石墨2.7 g，加入到316 mL濃度為18.4 mol/L的濃硫酸和36 mL濃度為14.7 mol/L的磷酸的混合溶液中。充分?jǐn)嚢韬?，置于? °(:冰浴中。將16.2 g高錳酸鉀少量多次，緩慢加入到以上混合溶液中。保持0 °C冰浴，磁力攪拌3小時(shí)后，將所得墨綠混懸液轉(zhuǎn)移至35 °(:溫水浴中，控溫1小時(shí)，然后將所得墨綠混懸液轉(zhuǎn)移至50 °C溫水浴中，控溫12小時(shí)。360 mL冰水緩慢加入到得到的紫黑色混懸液混合物中，劇烈攪拌1小時(shí)。繼而往溶液中逐滴滴加12 mL 30wt%過氧化氫溶液，溶液顏色突變?yōu)榱咙S色，攪拌30分鐘。所得溶液經(jīng)G1砂芯漏斗(孔徑20-30微米)過濾，繼而4000轉(zhuǎn)每分鐘離心30分鐘，棄去上清液；加入180 mL超純水充分振蕩洗滌，4000轉(zhuǎn)每分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀顏色呈土黃色；再加入180 mL 30wt%鹽酸充分振蕩洗滌，經(jīng)G