一種基于熒光定量法的下箴刺桐堿濃度測量方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子測量領域，特別涉及一種基于熒光定量法的下箴刺桐堿濃度測量 方法。
【背景技術】
[0002] 下箴刺桐堿又名海帕刺桐堿，CAS號487-58-1，分子式C14H18N2O 2，是豆科相思子屬 和刺桐屬植物中常見的生物堿。下箴刺桐堿能明顯抑制小鼠耳廓腫脹，減少小鼠耳廓重量； 增加小鼠胸腺、脾臟重量，提高小鼠血清溶血素水平；明顯降低〇：1 4和異硫氰酸萘酯所致的 肝損傷小鼠血清轉氨酶活性及膽紅素含量，保護肝損傷。小鼠實驗提示海帕刺桐堿具有明 顯的抗炎、增強免疫和降酶退黃、抗肝損傷作用，是雞骨草等藥材的有效成分之一，下箴刺 桐堿的結構與植物生長激素之一的生長素相似，均含吲哚基，但卻是生長素拮抗劑，通過抑 制植物根毛的伸長而發(fā)揮作用。
[0003] 色氨酸分子含有吲哚基，結構與下箴刺桐堿、生長素的相似，微溶于乙醇，不溶于 氯仿、乙醚，在稀酸或稀堿中溶解。
[0004] 生長素、色氨酸、下箴刺桐堿的定量方法主要是液相色譜法、毛細管電泳法和酶連 免疫分析法。但這些方法存在儀器較貴或者檢測費用高、樣品處理步驟比較復雜、消耗時間 比較長等局限。
[0005] 熒光光譜法是利用物質吸收較短波長的光波后發(fā)射較長波長特征光譜的性質，對 物質定性或定量分析的方法，該方法靈敏度高，選擇性強。
[0006] 色氨酸的定量很早就已經運用熒光方法，通常用三氯醋酸除去蛋白質后添加甲醛 與三氯化鐵使色氨酸的熒光衍產物生成后以激發(fā)波長350nm，發(fā)射波長450nm進行測量，作 用原理是色氨酸與甲醛縮合成環(huán)狀，經三氯化鐵氧化成熒光較強的去甲哈爾曼，但此法也 沒有考慮生長素和下箴刺桐堿等其他含吲哚基物質對測定結果的影響。
[0007] 下箴刺桐堿、色氨酸、生長素分子內都含吲哚基，均具天然熒光。單獨存在時，各自 的熒光強度與其濃度具有良好的線性關系，但三者的熒光光譜幾乎完全重疊，當激發(fā)波長 280nm時發(fā)射波長為350nm，因此三者混合時無法直接用熒光光譜法分別定量，雖然根據三 者的的親水性可以用有機溶劑（乙酸乙酯）將生長素分離，但下箴刺桐堿與色氨酸的親水 性非常接近，無法用常見的溶劑進行萃取分離，這樣，在下箴刺桐堿的定量過程中，色氨酸 成了一種難以除去的雜質。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明為在色氨酸雜質存在條件下一種基于熒光定量法的下箴刺桐堿濃度測量 方法，其前處理時間短、檢測成本低、能快速大批量檢測。
[0009] 實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案是：
[0010] 一種基于熒光定量法的下箴刺桐堿濃度測量方法，包含如下步驟：
[0011] 1)配制色氨酸標準溶液，繪制色氨酸標準曲線；
[0012] 2)配制色氨酸標準溶液與下箴刺桐堿標準溶液，測定標準混合溶液的熒光強度， 繪制混標準合液的標準曲線；計算混合標準溶液中色氨酸質量濃度（A)與下箴刺桐堿質量 濃度⑶的比值U(U = A/B)
[0013] 3)線性關系曲線1的繪制
[0014] 4)線性關系曲線2的繪制
[0015] 5)推導下箴刺桐堿的濃度的計算公式
[0016] 6)下箴刺桐堿溶液濃度的確定
[0017] 步驟1)中配制一定濃度梯度的色氨酸溶液，測定其熒光強度，以濃度值為橫坐 標，對應各濃度值的熒光強度為縱坐標繪制色氨酸溶液標準曲線；
[0018] 步驟2)中配制色氨酸標準溶液與下箴刺桐堿標準溶液，并按一定體積比混合，計 算混合標準溶液中色氨酸質量濃度A與下箴刺桐堿質量濃度B的比值U并記錄；
[0019] 步驟3)中測定標準混合溶液的熒光強度X，空白對照組（蒸餾水）的熒光強度為 X。，在試管中分別滴加甲醛，靜置1小時，再測定添加甲醛后的混合溶液的熒光強度Y，空白 對照組（蒸餾水中滴加甲醛）的熒光強度為Y。，
[0020] W = Y/X (1)
[0021] 式中W為橫坐標，以色氨酸與下箴刺桐堿的質量濃度之比U為縱坐標，得到線性關 系曲線1 ;
[0022] 步驟4)中使用步驟2)試管中色氨酸質量濃度在步驟1)中對應的熒光強度值記 為Z，空白對照組如蒸餾水的熒光強度為Z。，計算減去空白值后的值Z'與減去空白值后的 不添加甲醛的色氨酸熒光強度值t之比V，以每只試管添加甲醛與不添加甲醛的測量值 之比W'為橫坐標，以V為縱坐標，得線性關系曲線2 ;
[0023] 步驟5)中色氨酸標準曲線線性方程為
[0024] Tr =mA+n (2)
[0025] 線性關系曲線1的線性方程為
[0026] U = kff+j (3)
[0027] 線性關系曲線2的線性方程為
[0028] V = pff ; +q (4)
[0029] 推導下箴刺桐堿的濃度P的計算公式為
[0030] p = [V (X 一 X0) 一 n]/mU (5)
[0031] 即：
[0033] 其中X為不添加甲醛測得的待測液熒光強度，Y為添加甲醛后待測液的熒光強度， XD、Yc分別為添加甲醛前后空白對照的熒光強度，P的濃度單位與測定色氨酸標準曲線時A 的單位相同，P的單位為μ g/L。公式（6)的建立；
[0034] 步驟6)中取1份體積的待測下箴刺桐堿溶液，加9份pH7. 4磷酸氫二鈉/磷酸二 氫鈉緩沖溶液，試測此稀釋液的熒光強度，熒光強度應在1000至4000范圍內，若熒光強度 過高，可再適當稀釋，并記錄稀釋倍數(shù)；測得合適的熒光強度X后，按步驟5)中的公式計算 出稀釋后下箴刺桐堿溶液的濃度，再根據稀釋倍數(shù)，計算出原溶液中下箴刺桐堿的濃度。
[0035] 有益效果
[0036] 本發(fā)明為一種基于熒光定量法的下箴刺桐堿濃度測量方法，能直接用熒光光譜法 在色氨酸雜質存在條件下定量下箴刺桐堿的熒光量，避免色氨酸雜質對測試結果的影響， 本法前處理時間短、檢測成本低、能快速大批量檢測。
【附圖說明】
[0037] 圖1為添加等體積的濃度為40%甲醛前后，下箴刺桐堿溶液的熒光光譜；
[0038] 圖2為添加等體積的濃度為40%甲醛前后，色氨酸溶液的熒光光譜；
[0039] 圖3為色氨酸的熒光標準曲線；
[0040] 圖4為線性關系曲線1 ;
[0041] 圖5為線性關系曲線2。
【具體實施方式】
[0042] 下面結合附圖對本發(fā)明作進一步的闡述，但不是對本發(fā)明的限定。
[0043] 實施例
[0044] -種基于熒光定量法的下箴刺桐堿濃度測量方法，包含如下步驟：
[0045] 1)配制色氨酸標準溶液，繪制色氨酸標準曲線；
[0046] 2)配制色氨酸標準溶液與下箴刺桐堿標準溶液，測定標準混合溶液的熒光強度， 繪制混標準合液的標準曲線；計算混合標準溶液中色氨酸質量濃度A與下箴刺桐堿質量濃 度B的比值U
[0047] 3)線性關系曲線1的繪制
[0048] 4)線性關系曲線2的繪制
[0049] 5)推導下箴刺桐堿的濃度的計算公式
[0050] 6)下箴刺桐堿溶液濃度的確定
[0051] 步驟1)中配制一定濃度梯度的色氨酸溶液，測定其熒光強度，以濃度值為橫坐 標，對應各濃度值的熒光強度為縱坐標繪制色氨酸溶液標準曲線；
[0052] 步驟2)中配制色氨酸標準溶液與下箴刺桐堿標準溶液，并按一定體積比混合，計 算混合標準溶液中色氨酸質量濃度A與下箴刺桐堿質量濃度B的比值U并記錄；
[0053] 步驟3)中測定標準混合溶液的熒光強度X，空白對照組（蒸餾水）的熒光強度為 X。，在試管中分別滴加甲醛，靜置1小時，再測定添加甲醛后的混合溶液的熒光強度Y，空白 對照組（蒸餾水中滴加甲醛）的熒光強度為Y。，
[0054] W = Y/X (1)
[0055] 式中W為橫坐標，以色氨酸與下箴刺桐堿的質量濃度之比（U)為縱坐標，得到線性 關系曲線1 ;
[0056] 步驟4)中使用步驟2)試管中色氨酸質量濃度在步驟1)中對應的熒光強度值記 為Z，空白對照組如蒸餾水的熒光強度為Z。，計算減去空白值后的值Z'與減去空白值后的 不添加甲醛的色氨酸熒光強度值t之比V，以每只試管添加甲醛與不添加甲醛的測量值 之比W'為橫坐標，以V為縱坐標，得線性關系曲線2 ;
[0057] 步驟5)中色氨酸標準曲線線性方程為
[0058] Τ' = mA+n (2)
[0059] 線性關系曲線1的線性方程為
[0060] U = kff+j (3)
[0061] 線性關系曲線2的線性方程為
[0062] V = pff ; +q (4)
[0063] 推導下箴刺桐堿的濃度P的計算公式為
[0064] P = [V (X - X0) - n]/mU (5)
[0065] 艮P :
[0067] 其中X為不添加甲醛測得的待測液熒光強度，Y為添加甲醛后待測液的熒光強度， XD、Yc分別為添加甲醛前后空白對照的熒光強度，P的濃度單位與測定色氨酸標準曲線時A 的單位相同，P的單位為μ g/L。公式（6)的建立；
[0068] 步驟6)中取1份體積的待測下箴刺桐堿溶液，加9份pH7. 4磷酸氫二鈉/磷酸二 氫鈉緩沖溶液，試測此稀釋液的熒光強度，熒光強度應在1000至4000范圍內，若熒光強度 過高，可再適當稀釋，并記錄稀釋倍數(shù)；測得合適的熒光強度X后，按步驟5)中的公式計算 出稀釋后下箴刺桐堿溶液的濃度，再根據稀釋倍數(shù)，計算出原溶液中下箴刺桐堿的濃度。 [0069] 下箴刺桐堿與色氨酸都具有天然熒光，在添加等體積的甲醛（濃度為40% )前后， 下箴刺桐堿溶液的熒光光譜如圖1所示，可見熒光強度降低了一半。在添加等體積的甲醛