本發(fā)明涉及布洛芬對映體濃度檢測，尤其涉及一種檢測極微量全血樣品中布洛芬對映體的手性拆分方法。

背景技術(shù)：

1、布洛芬，又稱異丁苯丙酸，是一種廣泛使用于臨床的非甾體抗炎藥，在解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎方面發(fā)揮著重要作用。布洛芬結(jié)構(gòu)中含有一個手性中心，可將其拆分為左旋布洛芬與右旋布洛芬。臨床常用的布洛芬為消旋體，含有等量的右旋布洛芬與左旋布洛芬，右旋布洛芬為主要發(fā)揮藥理活性的優(yōu)勢對映體，但左旋布洛芬可在機體內(nèi)手性轉(zhuǎn)化為右旋布洛芬，因此，分別對左、右旋布洛芬進行定量有重要意義。建立快速、靈敏、簡便易操作的檢測全血樣品中左、右旋布洛芬藥物濃度的方法，并將驗證后的方法應(yīng)用于km小鼠灌胃給藥消旋布洛芬的藥代動力學(xué)研究十分重要。因此需要一種檢測極微量全血樣品中布洛芬對映體的手性拆分方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)問題而提出的一種檢測極微量全血樣品中布洛芬對映體的手性拆分方法。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明包括以下步驟：

4、s1、制備消旋布洛芬儲備液和制備內(nèi)標(biāo)溶液；

5、s2、獲得全血樣品；

6、s3、構(gòu)建左、右旋布洛芬在全血樣本中的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

7、s4、取全血樣品5μl，加入沉淀劑含1.3%甲酸的乙腈進行蛋白沉淀后進行l(wèi)c-ms/ms分析；

8、s5、通過所述標(biāo)準(zhǔn)曲線對所述全血樣品進行定量，通過插值計算，得到全血樣品中左、右旋布洛芬的濃度。

9、進一步地，步驟s1中，制備消旋布洛芬儲備液：精密稱定標(biāo)準(zhǔn)品消旋布洛芬，用二甲基亞砜配制儲備液濃度為2/2mg/ml。

10、進一步地，在步驟s1中，制備內(nèi)標(biāo)溶液：布洛芬雜質(zhì)80使用二甲基亞砜配制為2mg/ml的儲備液，精密量取儲備液，用乙腈逐步稀釋成濃度為50μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液備用。

11、進一步地，在步驟s2中，全血樣品的獲得：km小鼠6只，給藥前12h禁食；灌胃給藥消旋布洛芬，給藥劑量為100mg/kg于給藥后5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h由靜脈竇采血20μl置于含edtak2的抗凝管中，于-70℃冰箱存放待測。

12、進一步地，在步驟s3中，用體積比1：1的甲醇和水稀釋成系列濃度的布洛芬標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，分別取各濃度工作溶液5μl于5μl空白全血中，使得全血中左、右旋布洛芬終濃度分別為0.04/0.04μg/ml，0.1/0.1μg/ml，0.5/0.5μg/ml，2.5/2.5μg/ml，10/10μg/ml，25/25μg/ml，70/70μg/ml，80/80μg/ml，渦旋30s，加入10μl的所述內(nèi)標(biāo)溶液和40μl乙腈（含1.3%甲酸），渦旋90s，離心處理10min，取40μl上清液加入40μl超純水，渦旋后進行l(wèi)c-ms/ms分析，以左、右旋布洛芬血藥濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算，所得直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

13、進一步地，在步驟s4中，全血樣品處理：取步驟s2中全血樣品5μl，加入5μl甲醇，渦旋，加入10μl步驟s1中的內(nèi)標(biāo)溶液和40μl乙腈（含1.3%甲酸），渦旋90s，離心處理10min，取40μl上清液加入40μl超純水，渦旋后進行l(wèi)c-ms/ms分析。

14、相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

15、本發(fā)明避免了萃取、濃縮等繁瑣操作，提高了樣品處理效率，簡便快捷，靈敏度高，基質(zhì)效應(yīng)?。槐痉椒ú裳繕O少，僅使用一只小鼠便可完成一條藥-時曲線，并在小鼠全血中完成了布洛芬對映體的拆分，本檢測方法驗證結(jié)果顯示準(zhǔn)確可靠，回收率高。

技術(shù)特征：

1.一種檢測極微量全血樣品中布洛芬對映體的手性拆分方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測極微量全血樣品中布洛芬對映體的手性拆分方法，其特征在于，步驟s1中，制備消旋布洛芬儲備液：精密稱定標(biāo)準(zhǔn)品消旋布洛芬，用二甲基亞砜配制儲備液濃度為2/2mg/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測極微量全血樣品中布洛芬對映體的手性拆分方法，其特征在于，在步驟s1中，制備內(nèi)標(biāo)溶液：布洛芬雜質(zhì)80使用二甲基亞砜配制為2mg/ml的儲備液，精密量取儲備液，用乙腈逐步稀釋成濃度為50μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液備用。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測極微量全血樣品中布洛芬對映體的手性拆分方法，其特征在于，在步驟s2中，全血樣品的獲得：km小鼠6只，給藥前12h禁食；灌胃給藥消旋布洛芬、給藥劑量為100mg/kg于給藥后5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h由靜脈竇采血20μl置于含edtak2的抗凝管中，于-70℃冰箱存放待測。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測極微量全血樣品中布洛芬對映體的手性拆分方法，其特征在于，在步驟s3中，用體積比1：1的甲醇和水稀釋成系列濃度的布洛芬標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，分別取各濃度工作溶液5μl于5μl空白全血中，使得全血中左、右旋布洛芬終濃度分別為0.04/0.04μg/ml，0.1/0.1μg/ml，0.5/0.5μg/ml，2.5/2.5μg/ml，10/10μg/ml，25/25μg/ml，70/70μg/ml，80/80μg/ml，渦旋30s，加入10μl的所述內(nèi)標(biāo)溶液和40μl乙腈，渦旋90s，離心處理10min，取40μl上清液加入40μl超純水，渦旋后進行l(wèi)c-ms/ms分析，以左、右旋布洛芬血藥濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算，所得直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測極微量全血樣品中布洛芬對映體的手性拆分方法，其特征在于，在步驟s4中，全血樣品處理：取步驟s2中全血樣品5μl，加入5μl甲醇，渦旋，加入10μl步驟s1中的內(nèi)標(biāo)溶液和40μl乙腈，渦旋90s，離心處理10min，取40μl上清液加入40μl超純水，渦旋后進行l(wèi)c-ms/ms分析。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種檢測極微量全血樣品中布洛芬對映體的手性拆分方法，包括制備消旋布洛芬儲備液和內(nèi)標(biāo)溶液；獲得全血樣品；構(gòu)建左、右旋布洛芬在全血樣本中的標(biāo)準(zhǔn)曲線；取全血樣品5μL，進行蛋白沉淀后注入LC?MS/MS分析；通過所述標(biāo)準(zhǔn)曲線對所述全血樣品進行定量，通過插值計算，得到全血樣品中左、右旋布洛芬的濃度。本發(fā)明避免了萃取、濃縮等繁瑣操作，提高了樣品處理效率，采血量極少，僅使用一只小鼠便可完成一條藥?時曲線，簡便快捷，靈敏度高，基質(zhì)效應(yīng)小。

技術(shù)研發(fā)人員：李敬來,李悅新,阮志鵬,劉詩琦,羅歡,楊緩緩
受保護的技術(shù)使用者：國科卓越（北京）醫(yī)藥科技研究有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/26