本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及植物激素的定性定量分析技術(shù)，具體涉及玉蘭亞屬植物中內(nèi)源激素的測(cè)定方法，特別是玉蘭亞屬中紅花玉蘭和白玉蘭中赤霉素(ga3)、生長(zhǎng)素(iaa)、脫落酸(aba)的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

紅花玉蘭(magnoliawufengensisl.y.maetl.r.wang)是2004年3月于湖北五峰發(fā)現(xiàn)的木蘭科木蘭屬玉蘭亞屬新種，該玉蘭花被片數(shù)為9(～11)片，內(nèi)外全紅且花色均勻的特征十分罕見。隨后在該區(qū)域的調(diào)查中更是發(fā)現(xiàn)了玉蘭花被片數(shù)為12、15、18、24等，甚至多達(dá)46片的野生類群，將與紅花玉蘭花色相近，花被片數(shù)目增多的類群正式命名為多瓣紅花玉蘭(magnoliawufengensisvar.multitepalal.y.maetl.r.wang)。隨著紅花玉蘭新品種選育和繁殖工作的不斷推進(jìn)，紅花玉蘭苗木的產(chǎn)業(yè)化、商業(yè)化已成為必然趨勢(shì)。植物內(nèi)源激素如赤霉素(ga3)、生長(zhǎng)素(iaa)、脫落酸(aba)和玉米素(zt)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用。了解掌握紅花玉蘭植物激素水平的變化規(guī)律是生產(chǎn)上通過施用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑改良觀賞性狀的理論基礎(chǔ)。

植物激素在植物體內(nèi)含量甚微，而且其在植物體內(nèi)的組成復(fù)雜，相互共存的干擾組分多，對(duì)溫度等條件敏感，因而對(duì)植物激素的測(cè)定比較困難。高效液相色譜(hplc)是較理想的植物內(nèi)源激素分析方法，植物激素的hplc測(cè)定已在仁用杏花芽、甜櫻桃、梨等果實(shí)，油菜、萵苣等籽粒上有所應(yīng)用，對(duì)植物種子方面，主要集中在銀杏、山楂、甜櫻桃、五味子、早蜜梨和黃金梨等種子的激素含量測(cè)定上。目前，針對(duì)于玉蘭亞屬植物激素研究的報(bào)道較少，仍未建立起一種通用的植物激素測(cè)定方法。

在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)中至少存在如下問題：

1、不同種類植物內(nèi)植物激素的高效液相色譜測(cè)定法中，其前處理方法、洗脫系統(tǒng)及檢測(cè)系統(tǒng)差異十分明顯，并不能直接借鑒其他植物的植物激素高效液相色譜測(cè)定法來測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素特別是紅花玉蘭赤霉素(ga3)、生長(zhǎng)素(iaa)和脫落酸(aba)含量以及和白玉蘭中赤霉素(ga3)、生長(zhǎng)素(iaa)和脫落酸(aba)含量。

2、紅花玉蘭幼嫩的植物組織，尤其是花芽在研磨過程中極易發(fā)生褐化，影響檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3、在前處理過程中，提取溶劑難以直接選擇。在完成本發(fā)明的過程中，使用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)溶劑，會(huì)出現(xiàn)色素去除效果不理想的問題，萃取液乳化而不能分層的問題，待檢測(cè)的植物激素離子化等問題，提取流程繁瑣、提取效率低的問題。

4、待測(cè)樣品組分復(fù)雜，極性很強(qiáng)，使用常規(guī)柱層析技術(shù)，色譜峰嚴(yán)重重疊，且有拖尾現(xiàn)象。

發(fā)明人在完成本發(fā)明的過程中，還發(fā)現(xiàn)玉蘭亞屬植物特別是紅花玉蘭和白玉蘭中赤霉素(ga3)、生長(zhǎng)素(iaa)、脫落酸(aba)三種植物內(nèi)源激素與玉米素(zt)的前處理方法和柱層析方法，技術(shù)要求具有非常大的差異。本發(fā)明主要目的是檢測(cè)玉蘭亞屬植物特別是紅花玉蘭和白玉蘭中赤霉素(ga3)、生長(zhǎng)素(iaa)、脫落酸(aba)三種植物內(nèi)源激素的含量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中缺少玉蘭亞屬植物中植物激素測(cè)定方法特別是紅花玉蘭中赤霉素(ga3)、生長(zhǎng)素(iaa)、脫落酸(aba)的測(cè)定方法以及白玉蘭中赤霉素(ga3)、生長(zhǎng)素(iaa)、脫落酸(aba)的測(cè)定方法的問題。

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是克服玉蘭亞屬植物特別是紅花玉蘭或白玉蘭前處理方法中出現(xiàn)色素去除效果不理想的問題、萃取液乳化而不能分層的問題、待檢測(cè)的植物激素離子化中至少一個(gè)問題。

本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是克服在液相色譜中，色譜峰嚴(yán)重重疊的問題。

發(fā)明人通過長(zhǎng)期的探索和嘗試，以及多次的實(shí)驗(yàn)和努力，不斷的改革創(chuàng)新，為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是，提供一種測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法，包括植物激素的提取步驟、標(biāo)準(zhǔn)溶液制備步驟、高效液相色譜分析步驟和標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定步驟；

所述植物激素的提取步驟如下：

a)低溫研磨植物組織樣品至粉末，隨后加入低溫甲醇溶液，繼續(xù)研磨成勻漿；

b)將所述勻漿轉(zhuǎn)入第一離心管中，第一低溫避光浸提；

c)第一離心，吸取第一上清液，在沉淀中加入低溫甲醇溶液，第二低溫避光浸提；

d)第二離心，吸取第二上清液，合并第一上清液和第二上清液至第一雞心瓶；

e)向第一雞心瓶中滴入氨水，35℃～40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至水相；

f)將前述水相完全轉(zhuǎn)移至第二離心管，向第二離心管中加入pvpp，搖床振蕩后第三離心；吸取第三上清液，并用hcl溶液調(diào)節(jié)ph至2.5～3.0，隨后加入等體積乙酸乙酯萃取，重復(fù)操作本步驟1～3次；

g)合并萃取液至第二雞心瓶，35℃～40℃減壓濃縮至干；

h)用初始流動(dòng)相溶解后過微孔濾膜，得到樣品待測(cè)液，低溫保存。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式，所述高效液相色譜分析步驟中：

色譜條件為：

色譜柱：agilentzorbaxsb-c18；流動(dòng)相a：甲醇，流動(dòng)相b：0.1m乙酸水溶液；進(jìn)樣量：10μl；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；

用外標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式，所述高效液相色譜分析步驟中，采用梯度洗脫條件：0～5min，20％～20％a；5～10min，20％～30％a；10～20min，30％～30％a；20～23min，30％～40％a；23～40min，40％～40％a；40～45min，40％～20％a；流速：1ml/min。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述玉蘭亞屬植物為紅花玉蘭或白玉蘭；所述植物激素為ga3、iaa和aba中的一種、兩種或三種；所述植物組織為紅花玉蘭花芽、花被片或葉片，或白玉蘭的花被片或葉片。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液制備步驟具體是，準(zhǔn)確稱取ga3標(biāo)準(zhǔn)品0.0057g、iaa標(biāo)準(zhǔn)品0.0052g、aba標(biāo)準(zhǔn)品0.0042g，分別用甲醇定容至10ml，配制成濃度分別為570mg/l、520mg/l、420mg/l的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，密封后于-20℃低溫避光保存；用移液器吸取一定量各激素的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，稀釋成相當(dāng)于原濃度1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1024、1/2048的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定步驟具體是，將ga3、iaa、aba的標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別在確定的色譜條件下進(jìn)樣，記錄每種激素的保留時(shí)間，從而定性；再將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在確定的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；以各進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，從而定量。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述低溫研磨采用預(yù)冷的研缽，優(yōu)選采用液氮預(yù)冷的研缽；所述低溫甲醇溶液為預(yù)冷的甲醇溶液，優(yōu)選為4℃預(yù)冷的甲醇溶液，更優(yōu)選的是4℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為80％的甲醇溶液；所述甲醇溶液為體積分?jǐn)?shù)為80％的甲醇溶液。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式，所述第一低溫避光浸提為1～4℃避光浸提15～21h。

優(yōu)選地，所述第一低溫避光浸提為4℃避光浸提15～21h。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式，所述第二低溫避光浸提為1～4℃避光浸提1～3h。

優(yōu)選地，所述第二低溫避光浸提為4℃避光浸提2h。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式，所述第一離心為1～4℃、10000～14000r/min離心8～12min。

優(yōu)選地，所述第一離心為4℃12000r/min離心10min。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式，所述第二離心為1～4℃、10000～14000r/min離心8～12min。

優(yōu)選地，所述第二離心為4℃12000r/min離心10min。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式，所述第三離心為10000～14000r/min離心8～12min。

優(yōu)選地，所述第三離心為12000r/min離心10min。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方式，所述搖床振蕩為常溫?fù)u床振蕩15～25min。

優(yōu)選地，所述搖床振蕩為常溫?fù)u床振蕩20min。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述hcl溶液為0.1mhcl溶液；所述初始流動(dòng)相為20％甲醇，80％0.1m乙酸水溶液；所述微孔濾膜為0.45μm微孔濾膜；所述低溫保存為4℃保存。

根據(jù)本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，所述植物激素的提取步驟具體如下：

準(zhǔn)確稱取0.5000g紅花玉蘭植物組織樣品放入預(yù)冷的研缽，加入液氮研磨成粉末后再加入8ml預(yù)冷的80％甲醇，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10ml第一離心管中置于4℃冰箱內(nèi)第一低溫避光浸提15～21h；4℃12000r/min第一離心10min，吸取第一上清液后在沉淀中加入4ml預(yù)冷的80％甲醇第二低溫避光浸提2h；4℃12000r/min第二離心10min，吸取第二上清液，合并第一上清液和第二上清液至100ml第一雞心瓶中；加入1滴氨水，35℃～40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至水相，將水相轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，并向第一雞心瓶中加入2ml超純水清洗，合并水相；稱取0.1000gpvpp于離心管中，常溫?fù)u床振蕩20min；12000r/min第三離心10min，吸取第三上清液并用0.1mhcl調(diào)節(jié)ph至2.5～3.0；加入等體積乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次；合并酯相，倒入第二雞心瓶中于35℃～40℃條件下減壓濃縮至干；用0.5ml的初始流動(dòng)相溶解后過0.45μm微孔濾膜得到樣品待測(cè)液，置于4℃冰箱保存，用于測(cè)定ga3、iaa和aba；所述初始流動(dòng)相為20％甲醇，80％0.1m乙酸水溶液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中的一個(gè)技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)：

a)發(fā)明人在完成本發(fā)明過程中發(fā)現(xiàn)，紅花玉蘭幼嫩的植物組織，尤其是花芽在研磨過程中極易發(fā)生褐化。在研磨前使用低溫的研缽，如用液氮將研缽預(yù)冷，研磨過程保證低溫環(huán)境可以在一定程度上防止褐化。

b)本發(fā)明使用pvpp去除色素和酚類物質(zhì)，一方面不會(huì)對(duì)乙酸乙酯萃取造成乳化的負(fù)面影響，另一方面，能夠滿足除雜要求，并且提取流程得以簡(jiǎn)化。

c)本發(fā)明采用梯度洗脫的方法，選擇20％甲醇：80％0.1m乙酸(0.575％的乙酸溶液)作為初始流動(dòng)相，峰形更好，分離度高，無拖尾現(xiàn)象。

d)洗脫系統(tǒng)梯度設(shè)計(jì)，整個(gè)程序運(yùn)行過程中，出峰結(jié)束后基線恢復(fù)平穩(wěn)，保證了自動(dòng)進(jìn)樣的連續(xù)性和樣品的等精度測(cè)量。

e)柱溫的選擇，可以保證ga3、iaa、aba的分離度達(dá)到最佳。

f)流速過快會(huì)導(dǎo)致色譜峰重疊，流速過慢會(huì)出現(xiàn)“平頭峰”，當(dāng)流速為1.0ml/min時(shí)各激素的峰形最好。

g)本發(fā)明重復(fù)性好，回收率高，準(zhǔn)確可靠。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施方式的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施方式中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中g(shù)a3、iaa和aba標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中樣品液相色譜圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中樣品加標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖。

圖4是流動(dòng)相為35％甲醇：65％水(水中含1.0％乙酸)的色譜圖。

圖中，1為ga3，2為iaa，3為aba。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施方式的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施方式中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施方式是本發(fā)明一部分實(shí)施方式，而不是全部的實(shí)施方式?；诒景l(fā)明中的實(shí)施方式，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施方式，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。因此，以下對(duì)在附圖中提供的本發(fā)明的實(shí)施方式的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施方式。

實(shí)施例1

本實(shí)施例中，使用以下儀器和試劑。

儀器：美國(guó)agilent1260高效液相色譜儀，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和紫外檢測(cè)器；3-30k高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)sigma)；hei-vap旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)heidolph)；pb-21酸度計(jì)(德國(guó)sartorius)；quintix224-1cn電子天平(德國(guó)sartorius)；移液器(德國(guó)eppendorf)；shb-ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

試劑：聚乙烯聚吡咯烷酮(pvpp)(美國(guó)sigma)；甲醇(色譜純，美國(guó)fischerscientific)；冰醋酸、乙酸乙酯、氨水、鹽酸(分析純，北京化工廠)；超純水；ga3、iaa和aba標(biāo)準(zhǔn)品(hplc級(jí)，純度≥98％，美國(guó)sigma)。

本發(fā)明測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法，可以用于測(cè)定紅花玉蘭花芽、花被片或葉片中g(shù)a3、iaa和aba含量，也可以用于測(cè)定白玉蘭的花被片或葉片中g(shù)a3、iaa和aba含量。在本實(shí)施例中，是以紅花玉蘭花芽作為提取對(duì)象。以下提及的紅花玉蘭植物組織樣品，若無特殊說明，均指紅花玉蘭花芽。

本實(shí)施例測(cè)定玉蘭亞屬植物中植物激素的方法，包括植物激素的提取步驟、標(biāo)準(zhǔn)溶液制備步驟、高效液相色譜分析步驟和標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定步驟。

1、植物激素的提取步驟

準(zhǔn)確稱取0.5000g紅花玉蘭植物組織樣品放入預(yù)冷的研缽，加入液氮研磨成粉末后再加入8ml預(yù)冷的80％甲醇，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10ml第一離心管中置于4℃冰箱內(nèi)第一低溫避光浸提15～21h。4℃12000r/min第一離心10min，吸取第一上清液后在沉淀中加入預(yù)冷的4ml80％甲醇第二低溫避光浸提2h。4℃12000r/min第二離心10min，吸取第二上清液，合并第一上清液和第二上清液至100ml第一雞心瓶中。加入1滴氨水，35℃～40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至水相，此時(shí)溶液體積約減少2/3，將所述水相轉(zhuǎn)移至10ml第二離心管中，并向第一雞心瓶中加入2ml超純水清洗，合并水相。稱取0.1000gpvpp于第二離心管中，常溫?fù)u床振蕩20min。12000r/min第三離心10min，吸取第三上清液并用0.1mhcl調(diào)節(jié)ph至2.5～3.0。加入等體積乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次。合并酯相，倒入第二雞心瓶中于35℃～40℃條件下減壓濃縮至干。用0.5ml的初始流動(dòng)相(20％甲醇，80％0.1m乙酸水溶液)溶解后過0.45μm微孔濾膜得到樣品待測(cè)液，置于4℃冰箱保存，用于測(cè)定ga3、iaa和aba。

上述第一、第二、第三僅具有區(qū)分對(duì)象的作用，不具有實(shí)際含義。本實(shí)施例中，植物激素的提取方法基于現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，做了大量的探索和研究，最終獲得了改進(jìn)的優(yōu)化方案。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在提取過程中，紅花玉蘭幼嫩的植物組織，尤其是花芽在研磨過程中極易發(fā)生褐化。在研磨前用液氮將研缽預(yù)冷，研磨過程保證低溫環(huán)境可以一定程度上防止褐化。已知文獻(xiàn)指出了80％甲醇粗提取后添加石油醚可大部分去除色素的干擾，但發(fā)明人在完成本發(fā)明過程中發(fā)現(xiàn)使用石油醚會(huì)對(duì)提取過程中乙酸乙酯的萃取產(chǎn)生影響，導(dǎo)致提取液出現(xiàn)乳化現(xiàn)象不能分層。有研究人員為了解決乳化現(xiàn)象，在提取植物激素樣品前處理階段添加等體積的5g/l的naoh。但發(fā)明人發(fā)現(xiàn)強(qiáng)堿物質(zhì)不僅會(huì)破壞植物激素還會(huì)導(dǎo)致提取液ph上升，使酸性的ga3、iaa、aba離子化，因此會(huì)大幅降低提取效率。發(fā)明人通過進(jìn)一步研究表明，加入一定飽和的nacl溶液能夠消除提取液的乳化現(xiàn)象，對(duì)激素影響較小。但是，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)石油醚的脫色效果十分有限，也使提取流程更加繁瑣。最終，發(fā)明人篩選使用了pvpp去除色素和酚類物質(zhì)，加入pvpp后，不會(huì)對(duì)乙酸乙酯萃取造成影響，并且能夠滿足除雜要求，簡(jiǎn)化提取流程。

需要說明的是，上述提及的現(xiàn)有方法都不是針對(duì)玉蘭亞屬植物特別是紅花玉蘭中植物激素的提取。而是其他植物中植物激素的提取方法。

2、標(biāo)準(zhǔn)溶液制備步驟

準(zhǔn)確稱取ga3標(biāo)準(zhǔn)品0.0057g，iaa標(biāo)準(zhǔn)品0.0052g，aba標(biāo)準(zhǔn)品0.0042g分別用甲醇定容至10ml，配制成濃度分別為570mg/l、520mg/l、420mg/l的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，密封后于-20℃低溫避光保存。用移液器吸取一定量各激素的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，稀釋成相當(dāng)于原濃度1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1024、1/2048的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

3、高效液相色譜分析步驟

色譜條件

色譜柱：agilentzorbaxsb-c18(4.6×150mm，5μm)；流動(dòng)相a：甲醇，流動(dòng)相b：0.1m乙酸水溶液。

梯度洗脫條件：0～5min，20％～20％a；5～10min，20％～30％a；10～20min，30％～30％a；20～23min，30％～40％a；23～40min，40％～40％a；40～45min，40％～20％a；，運(yùn)行時(shí)間48min。流速：1ml/min；進(jìn)樣量：10μl；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。用外標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定。

ga3、iaa和aba的梯度洗脫時(shí)間表如下表所示：

本實(shí)施例采用二異丁基鍵合相agilentzorbaxsb-c18柱，能在低ph、高溫條件下分析酸性、堿性和中性組分，具有峰形優(yōu)異，柱壽命長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。

現(xiàn)有技術(shù)中，甲醇-水的流動(dòng)相組成是目前常用的組合。發(fā)明人分別試驗(yàn)了35％甲醇：65％水，40％甲醇：60％水，45％：55％水，50％：50％水的等度洗脫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅花玉蘭的樣品組分極性很強(qiáng)，色譜峰嚴(yán)重重疊，且有拖尾的現(xiàn)象。不同的洗脫系統(tǒng)對(duì)洗脫效果有著非常明顯的影響，圖4示出了流動(dòng)相為35％甲醇：65％水(水中含1.0％乙酸)的色譜圖；色譜柱：agilentzorbaxsb-c18(4.6×150mm，5μm)；流速：1ml/min；進(jìn)樣量：10μl；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；色譜峰出現(xiàn)重疊和拖尾，樣品中的3種待測(cè)激素不能有效分離。

有文獻(xiàn)記載，甲醇與乙腈配合使用能夠改善峰形，提高分離度。發(fā)明人在改進(jìn)流動(dòng)相組成試驗(yàn)中，采用20％甲醇：20％乙腈：60％水(其中含0.75％的乙酸)時(shí)仍不能使激素的色譜峰與雜質(zhì)峰分離，結(jié)果說明紅花玉蘭樣品組分復(fù)雜，極性很強(qiáng)，等度洗脫hplc法不適用于其植物激素的檢測(cè)。

最終，發(fā)明人選擇了梯度洗脫法，最后通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)選擇20％甲醇：80％0.1m乙酸水溶液(0.575％的乙酸水溶液)作為初始流動(dòng)相。減小有機(jī)相的比例能夠增加洗脫強(qiáng)度，在梯度洗脫后期增加有機(jī)相的比例可使樣品中剩余的極性組分被洗脫出來。檢測(cè)ga3、iaa和aba時(shí)，0～5min甲醇比例為20％，5～10min甲醇比例從20％增加到30％，影響ga3色譜峰的雜質(zhì)在10min內(nèi)出峰結(jié)束；從10～20min甲醇比例保持在30％，ga3和iaa出峰結(jié)束；從20～23min，甲醇比例從30％變化到40％；23～40min，甲醇比例保持在40％，包括aba色譜峰在內(nèi)的其余峰出峰結(jié)束；40～45min甲醇比例降至20％。整個(gè)程序運(yùn)行48min，基線恢復(fù)平穩(wěn)，保證了自動(dòng)進(jìn)樣的連續(xù)性和樣品的等精度測(cè)量。

在液相色譜中，提高柱溫可以縮短出峰時(shí)間，提高靈敏度。試驗(yàn)中分別對(duì)比了25℃、30℃、35℃和40℃的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)35℃柱溫條件下，ga3、iaa、aba的分離度最佳。

流動(dòng)相速度增加可以縮短保留時(shí)間，使峰形變窄。試驗(yàn)對(duì)比了0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min這4種流速，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流速過快會(huì)導(dǎo)致色譜峰重疊，流速過慢會(huì)出現(xiàn)“平頭峰”，當(dāng)流速為1.0ml/min時(shí)各激素的峰形最好。

4、標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定步驟

將各激素的標(biāo)準(zhǔn)貯備液分別在確定的色譜條件下進(jìn)樣，記錄每種激素的保留時(shí)間，從而定性。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在確定的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。以各進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，從而定量。計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表1所示。將信噪比s/n＝3時(shí)檢測(cè)到的植物激素的最低濃度作為方法的檢出限，結(jié)果如表1所示，各激素的濃度與峰面積之間有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9990。

表1植物激素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及檢出限

樣品的測(cè)定和加標(biāo)回收率

稱取0.5000g紅花玉蘭花芽，按照前述步驟進(jìn)行提取和檢測(cè)，在已測(cè)樣品中添加一定量的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果如表2所示，各激素的保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.024，ga3、iaa和aba的回收率分別為125.18％、109.72％和103.92％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd均小于1.0％。表明本方法重復(fù)性好，回收率高，準(zhǔn)確可靠。如圖1所示，ga3、iaa和aba標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖峰形尖銳，不受溶劑峰的干擾；如圖2所示，各激素與雜質(zhì)峰不重疊，分離度較好；如圖3所示，樣品加入標(biāo)準(zhǔn)品后，在相同的保留時(shí)間與樣品中的激素疊加出峰。

表2植物激素的加標(biāo)回收率

*mean±sd。

實(shí)施例2

將實(shí)施例1中紅花玉蘭植物組織即紅花玉蘭花芽分別用紅花玉蘭花被片、紅花玉蘭葉片、白玉蘭花被片和白玉蘭葉片替代，其他步驟相同，進(jìn)行植物激素測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣3次。各植物組織的ga3、iaa、aba含量如表3所示，紅花玉蘭花芽ga3含量最高，為125.31±0.43μg/g.fw；紅花玉蘭花被片樣品為初開期的花被片，除aba外，其余2種激素均低于處在盛開期的白玉蘭花被片；紅花玉蘭葉片的采樣時(shí)期為夏季，各項(xiàng)激素的含量均較高；白玉蘭葉片采樣時(shí)期為秋季，iaa含量最低，為0.84±0.04μg/g.fw。

表3不同植物組織的激素含量

*mean±sd。

結(jié)果表明，本方法同時(shí)適用于紅花玉蘭和白玉蘭的植物激素測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)差較小，精確度高。本方法適用性廣、實(shí)用性強(qiáng)，為紅花玉蘭生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律的研究工作提供了技術(shù)支持。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實(shí)施方式不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。