本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法，具體涉及的是利用thz檢測(cè)的方法，比較轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米的吸收峰的差異，進(jìn)一步通過ls—svm、bpnn、rf建模的方法，從而區(qū)分出不同品種玉米的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的安全問題尤為關(guān)注，由此帶來的一系列的對(duì)于研究轉(zhuǎn)基因食品的準(zhǔn)確、快速檢測(cè)的方法。因此，近年來對(duì)于轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)一直是農(nóng)業(yè)工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

目前對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)方法主要有蛋白質(zhì)印跡法、elisa檢測(cè)法、pcr檢測(cè)法等。蛋白質(zhì)印跡法用聚苯乙烯反應(yīng)板作為固相載體，它是讓目標(biāo)蛋白特異性的非標(biāo)記性抗體與目標(biāo)蛋白中的相關(guān)抗原結(jié)合在一起，再檢測(cè)已結(jié)合上去的抗體。這種方法研究的難度大，成本較高，不適用于大批量的檢測(cè)。elisa檢測(cè)的原理是將待檢測(cè)的樣品中的目標(biāo)蛋白與固相載體表面的相關(guān)抗體發(fā)生反應(yīng)，加入和酶反應(yīng)的相關(guān)的底物之后，底物被催化轉(zhuǎn)變成為有顏色的物質(zhì)，通過一系列的反應(yīng)，可以檢測(cè)出待檢測(cè)的物質(zhì)中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。這種方法存在有一些問題：很難找到目標(biāo)蛋白，待測(cè)物質(zhì)中包含有復(fù)雜的基質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、精確性會(huì)產(chǎn)生很大的影響，而且只適用于未經(jīng)過加工處理過的原材料。pcr檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)的主要原理是通過對(duì)于目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增，再通過相應(yīng)的方法來檢測(cè)擴(kuò)增之后的產(chǎn)物。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)大多都是對(duì)于dna和蛋白質(zhì)的檢測(cè)，這些方法對(duì)于作物本身具有破壞性，且成本高、檢測(cè)方法制樣繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長、需要專業(yè)人員操作的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種區(qū)分轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米的檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)無損檢測(cè)、提高檢測(cè)效率，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，并簡(jiǎn)化操作。

為了解決上技術(shù)問題，本發(fā)明采用太赫茲時(shí)域譜探測(cè)系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米樣本進(jìn)行檢測(cè)，得到轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米的吸收太赫茲譜，通過比較吸收譜的差異，區(qū)分轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因玉米，具體技術(shù)方案如下：

一種區(qū)分轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米的檢測(cè)方法，其特征包括以下步驟：

步驟一，研磨處理：將非轉(zhuǎn)基因玉米顆粒放入高通量組織球磨儀的兩個(gè)半球內(nèi)，進(jìn)行粉碎，充分研磨后得非轉(zhuǎn)基因玉米粉樣本；

步驟二，干燥處理：將所述的非轉(zhuǎn)基因玉米粉樣本和購得的粉末狀轉(zhuǎn)基因玉米樣本分別放入不同的真空干燥箱中進(jìn)行充分干燥，得到干燥的非轉(zhuǎn)基因玉米粉樣本和干燥的轉(zhuǎn)基因玉米粉樣本；

步驟三，壓片處理：將所述干燥的轉(zhuǎn)基因玉米粉和干燥的非轉(zhuǎn)基因玉米粉置于壓片機(jī)模具上，對(duì)壓片機(jī)施加15kn的力，得到壓片樣本即非轉(zhuǎn)基因玉米壓片樣本和轉(zhuǎn)基因玉米壓片樣本；

步驟四，將所述轉(zhuǎn)基因玉米壓片樣本和非轉(zhuǎn)基因玉米壓片樣本放置于太赫茲時(shí)域光譜探測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)臺(tái)上，并對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)抽真空；

步驟五，在所述太赫茲測(cè)量系統(tǒng)中輸入轉(zhuǎn)基因玉米壓片樣本和非轉(zhuǎn)基因玉米壓片樣本的測(cè)量參數(shù)，使得太赫茲測(cè)量系統(tǒng)的掃描面積將所有待測(cè)樣本完全包含，同時(shí)保證測(cè)量的精度；

步驟六，設(shè)置測(cè)量條件，使得設(shè)置的測(cè)量樣本厚度與實(shí)際樣本厚度相一致，從而保證實(shí)驗(yàn)所測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性；

步驟七，設(shè)置太赫茲對(duì)樣本掃描的頻率范圍和分析方式；

步驟八，對(duì)太赫茲檢測(cè)臺(tái)進(jìn)行背景掃描，用以排除背景對(duì)樣本掃描結(jié)果的影響；

步驟九，然后再分別對(duì)所述壓片樣本進(jìn)行掃描，獲得樣本太赫茲吸收譜，即轉(zhuǎn)基因玉米壓片樣本太赫茲吸收譜和非轉(zhuǎn)基因玉米壓片樣本太赫茲吸收譜；

步驟十，對(duì)所得樣本太赫茲吸收譜進(jìn)行預(yù)處理，從中找到一個(gè)最優(yōu)的方案，以此來準(zhǔn)確地區(qū)分出轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米。

所述步驟一具體為：

將非轉(zhuǎn)基因玉米顆粒放入高通量球磨儀(gt100)的兩半球內(nèi)，然后將兩半球夾緊，對(duì)非轉(zhuǎn)基因玉米顆粒進(jìn)行粉粹，設(shè)置球磨儀轉(zhuǎn)速為1006rpm，研磨時(shí)間0.4min。

步驟二中：真空干燥箱為d2g-6020；干燥處理溫度為60℃，時(shí)間12h。

步驟三中：所述壓片機(jī)模具的直徑是12mm，壓出的壓片樣本厚度為1.5mm，對(duì)壓片機(jī)施加15kn的力。

所述步驟五中：在掃描平面內(nèi)，在x、y軸方向掃描步長均為3mm，掃描10×10個(gè)點(diǎn)，整個(gè)掃描面積為30×30mm。

所述測(cè)量樣本厚度設(shè)置為1.5mm。

所述太赫茲測(cè)量系統(tǒng)對(duì)樣本掃描的頻率范圍為0.3~4thz，分析方式為吸收譜。

所述步驟八在設(shè)定的測(cè)量范圍內(nèi)，對(duì)太赫茲檢測(cè)臺(tái)背景進(jìn)行掃描；

所述步驟九具體為：在樣本臺(tái)內(nèi)按縱橫方向放置待測(cè)量的壓片樣本，壓片樣本之間保留間隙不小于5mm，單次掃描放置的壓片樣本個(gè)數(shù)是3個(gè)，對(duì)壓片樣本進(jìn)行掃描得到轉(zhuǎn)基因玉米壓片樣本太赫茲吸收譜和非轉(zhuǎn)基因玉米壓片樣本太赫茲吸收譜。

所述步驟十具體為：觀察分析得到的太赫茲吸收譜，取顏色最深、特征最明顯的8到10個(gè)樣本點(diǎn)，取它們的平均值，繪制各個(gè)品種玉米樣本的太赫茲吸收譜，觀察它們太赫茲吸收譜的特征，通過ls—svm、bpnn、rf方法在matlab中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行建模分析比較，從中找到一個(gè)最優(yōu)的模型，以此來準(zhǔn)確的區(qū)分轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米。

本發(fā)明具有有益效果。本發(fā)明在粉碎過程中破壞樣本的外形但沒有破壞轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米的化學(xué)成分，不用借助傳統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)，無需對(duì)樣本內(nèi)部的dna和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，借助thz檢測(cè)技術(shù)，可以獲取轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米的吸收太赫茲譜。通過對(duì)吸收太赫茲譜的分析，可以比較出不同種類的玉米的。本發(fā)明提供了一種利用thz探測(cè)技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米的測(cè)量方法。其原理是通過太赫茲波被聚焦元件聚焦到樣品的某一點(diǎn)上，收集元件則將透過樣品(或從樣品反射)的thz波收集后聚焦到thz探測(cè)元件上。thz探測(cè)元件將含有位置信息的thz信號(hào)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電信號(hào)，圖像處理單元將此信號(hào)轉(zhuǎn)換為圖像，再通過分析圖像信息可以區(qū)分轉(zhuǎn)基因作物。對(duì)于太赫茲檢測(cè)技術(shù)，它具有穿透力強(qiáng)、非接觸、無損傷、無需液體介質(zhì)，及其對(duì)于周圍環(huán)境溫度不敏感等特點(diǎn)，無需對(duì)檢測(cè)樣品的化學(xué)成分進(jìn)行破環(huán)就可以區(qū)分出轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因。thz檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)單快速，檢測(cè)過程不會(huì)破壞樣本的化學(xué)成分，無須通過化學(xué)反應(yīng)來區(qū)分轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因樣本，而且檢測(cè)過程不會(huì)損害被測(cè)對(duì)象的使用性能。

目前，太赫茲檢測(cè)技術(shù)主要應(yīng)用于安全檢查、生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用、環(huán)境檢測(cè)、制藥、農(nóng)產(chǎn)品及食品等諸多領(lǐng)域，它還可以用于非金屬材料特性和缺陷檢測(cè)中，但沒有看到在對(duì)于使用太赫茲方法來區(qū)別轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米的報(bào)道。

附圖說明

圖1是本發(fā)明測(cè)量原理示意圖；

圖2是本發(fā)明數(shù)據(jù)采集和分析的主要流程圖；

圖3是本發(fā)明玉米樣本掃描結(jié)果圖；

圖4是本發(fā)明中所用品種的玉米的吸收太赫茲譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述。

本發(fā)明具體實(shí)施方式中所采用的太赫茲時(shí)域太赫茲譜探測(cè)系統(tǒng)是tas7400ts型，利用太赫茲時(shí)域太赫茲譜探測(cè)系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因的玉米進(jìn)行掃描，采集到轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米的thz光譜，這里我主要分析了吸收光譜，通過觀察吸收光譜來區(qū)別出轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因玉米。本發(fā)明于2016年10月至2016年12月在江蘇大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為確保使用的非轉(zhuǎn)基因玉米是不摻雜有別的成分，因此購買的非轉(zhuǎn)基因玉米都為種子，后期需要自行研磨成粉末。非轉(zhuǎn)基因玉米種子都購買于壽光市春花秋實(shí)種業(yè)，它們的品種選用五彩甜糯玉米、脆甜水果玉米、超甜水果玉米、銀香糯玉米、糯玉米和紫糯玉米。轉(zhuǎn)基因玉米品種是從深圳卓越生物科技有限公司購買，選用bt11（2%）、bt176（5%）、mon810（10%）的標(biāo)準(zhǔn)品的粉末，這三種目前中國批準(zhǔn)進(jìn)口的國內(nèi)比較流行的轉(zhuǎn)基因玉米。為了保證樣本的代表性，對(duì)每一種玉米都制作了5個(gè)樣本。

（1）轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米種子樣本的制作

先將購買的非轉(zhuǎn)基因玉米種子篩選干凈，去除雜質(zhì)的干擾。然后將適量的種子置于高通量組織的球磨儀（gt100）的模具內(nèi)，設(shè)置轉(zhuǎn)速1006rpm，時(shí)間0.4min，使種子充分研磨。研磨成粉末后，裝入透明塑料袋中，置于真空干燥箱（d2g-6020）中，設(shè)置干燥箱溫度為60℃，時(shí)間12h，因?yàn)橛衩追N子中的dna等遺傳物質(zhì)在94℃以上會(huì)發(fā)生變性。分別取出適量的干燥的轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米粉末，將粉末放入12mm的手動(dòng)壓片機(jī)模具（鶴壁，河南）上，通過手動(dòng)的方式對(duì)壓片機(jī)施加適當(dāng)?shù)牧?，可以獲得干燥的轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米壓片樣本，通過控制加入模具的粉末的多少，可以保證壓片的厚度在1.5mm左右，每種玉米樣本做5個(gè)樣本，保證實(shí)驗(yàn)可以測(cè)得的數(shù)據(jù)更能代表樣本的特性。

（2）儀器參數(shù)設(shè)置及樣本安裝

將經(jīng)過壓片處理的轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米壓片放置于太赫茲時(shí)域光譜探測(cè)系統(tǒng)（tas7400ts，上海）型號(hào)的的檢測(cè)臺(tái)上，找出檢測(cè)臺(tái)上的合適位置。輸入樣本的測(cè)量參數(shù)，掃描的面積是30×30mm，在x、y軸方向上掃描步長均為3mm，在掃描的面積內(nèi)上掃描10×10個(gè)點(diǎn)。設(shè)置測(cè)量條件，樣本厚度在1.5mm，分析方式采用吸收，測(cè)量范圍在0.3到4thz。測(cè)量的時(shí)候先進(jìn)行背景掃描，以排除背景對(duì)樣本掃描的影響，然后將樣本樣本臺(tái)上設(shè)定的測(cè)量范圍，按縱橫方向分別排列，每個(gè)樣本之間間隔不小于5mm，使用太赫茲時(shí)域光譜探測(cè)系統(tǒng)對(duì)上述制成的壓片樣本進(jìn)行掃描，重復(fù)上述步驟多次，可以得到轉(zhuǎn)基因樣本和非轉(zhuǎn)基因樣本的太赫茲譜，本發(fā)明主要分析吸收光譜。圖1是測(cè)量原理示意圖。

（3）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取

使用太赫茲時(shí)域光譜探測(cè)系統(tǒng)對(duì)壓片樣本進(jìn)行掃描，可以獲得吸收、反射等光譜。經(jīng)觀察、分析發(fā)現(xiàn)由于不同種類的玉米種子對(duì)thz波的吸收是不同的，因此，本發(fā)明主要對(duì)吸收光譜進(jìn)行了分析，對(duì)于一般樣本的區(qū)分，吸收光譜能較為明顯的表示。

（4）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的預(yù)處理

在太赫茲圖像系統(tǒng)中，對(duì)于每個(gè)樣本都會(huì)有不同的圖像信息，尤其是在壓片樣本的邊緣，它們的圖像信息的差別會(huì)更加明顯。因此，我們需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，將掃描圖像中多余的樣本點(diǎn)進(jìn)行去除，提取玉米樣本表面的掃描結(jié)果圖（圖3）中，顏色最深、特征最明顯的8到10個(gè)樣本，并取它們的平均值，將其作為樣本的吸收光譜。

（5）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吸收譜的分析

將篩選好的樣本點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入origin軟件內(nèi)，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值處理，然后將處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像生成處理，得到各個(gè)品種的玉米的吸收光譜圖。如圖4各個(gè)品種的玉米吸收光譜圖可以通過比較不同品種玉米的峰值來區(qū)分它們不同。

（6）數(shù)學(xué)建模

通過前面的步驟只能夠初步區(qū)分很難直接通過吸收光譜區(qū)分轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因玉米，需要通過比較ls-svm、bpnn、rf等方法，從中找到一個(gè)最優(yōu)的方法，以此來準(zhǔn)確的區(qū)分轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因玉米。

以上過程就是本發(fā)明的具體的主要流程，圖2是數(shù)據(jù)采集和分析的主要流程圖。