專(zhuān)利名稱：轉(zhuǎn)基因玉米59122品系特異定量pcr精準(zhǔn)檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因的定量的分析方法。
背景技術(shù)：
國(guó)際上很多國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施限量標(biāo)識(shí)和進(jìn)口，而我國(guó)尚無(wú)具體的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)閾值。為了打破歐盟等國(guó)家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘，同時(shí)彌補(bǔ)和完善我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測(cè)技術(shù)體系，更好地保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)，建立一種新型轉(zhuǎn)基因玉米59122品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法已成為必要。目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米59122的檢測(cè)技術(shù)，主要集中在普通定性PCR分析方法和標(biāo)準(zhǔn)，尚無(wú)關(guān)于擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米59122及產(chǎn)品的品系特異性某特定位點(diǎn)(基因序列)的定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的主要是提供一種擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米59122及產(chǎn)品的品系特異性某特定位點(diǎn)的定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
轉(zhuǎn)基因玉米59122品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，主要包括以下步驟
(1)合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，59122event-F: 5’ -AATTCGCCCTATAGTGAGTCGTA-3’
下游引物序列，59122event-R: 5’ -GATAAACAAACGGGACCATAGAA-3’
熒光探針序列，59122event-P: 5’ -FAM-CGCAATTCAGTACATTAAAAACGTCCGC-TAMRA-3’ ；
(2)制備59122品系的DNA稀釋液；
(3)配制PCR反應(yīng)體系；
(4)定量PCR檢測(cè)。進(jìn)一步，步驟(I)所述合成的引物及熒光探針的濃度都為lOMfflol/l，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。為了達(dá)到最好的檢測(cè)效果，步驟(3)所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將3μ1的DNA稀釋液加入到25μ1反應(yīng)體系中，所述25μ1的反應(yīng)體系包括以下組分
Taqman Master mix12. 5μ1
上游引物ιμ
下游引物ιμ
熒光探針0.5 μι
水IOul。作為最優(yōu)的反應(yīng)條件，所述PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性lOmin，I個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，59。。退火60s, 45個(gè)循環(huán)。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果1、本發(fā)明打破歐盟等國(guó)家和地區(qū)設(shè)置的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品貿(mào)易技術(shù)壁壘；
2、本發(fā)明彌補(bǔ)和完善我國(guó)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測(cè)技術(shù)體系；
3、本發(fā)明提供的檢測(cè)技術(shù)可更好地保護(hù)消費(fèi)者對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)；
4、本發(fā)明擴(kuò)增效率高、準(zhǔn)確度高。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的 說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此。實(shí)施例轉(zhuǎn)基因玉米59122品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，主要包括以下步驟
(I)合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，59122event-F: 5’ -AAITCGCCCTATAGTGAGTCGTA-3’
下游引物序列，59122event-R: 5’ -GATAAACAAACGGGACCATAGAA-3’
熒光探針序列，59122event-P: 5’ -FAM-CGCAAITCAGTACAITAAAAACGTCCGC-TAMRA-3’。本實(shí)施例引物及熒光探針的合成濃度都為lOMfflol/1。以上引物和熒光探針的核苷酸序列是針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米59122及產(chǎn)品的品系特異性某特定位點(diǎn)，即外源基因與玉米基因組DNA的整合位點(diǎn)設(shè)計(jì)，通過(guò)該設(shè)計(jì)就可以精準(zhǔn)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米59122中的轉(zhuǎn)化事件。(2)制備59122品系的DNA稀釋液；即采用常規(guī)的DNA提取手段，從轉(zhuǎn)基因玉米59122中提取出濃度為50ng/W的DNA稀釋液。(3)配制PCR反應(yīng)體系；即將3ul制備好的DNA稀釋液加入25ul反應(yīng)體系中。以上25ul反應(yīng)體系包括以下組分
Taqman Master mix12. 51^1
上游引物IW
下游引物1耵
熒光探針o. 5 m
水10P1。(4)定量 PCR 檢測(cè)。根據(jù)上述PCR反應(yīng)體系，在以下PCR反應(yīng)條件下對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)，所述PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性10min，l個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，59°C退火60s，45個(gè)循環(huán)。本實(shí)施例中采用的是ABI公司生產(chǎn)的7500型熒光定量PCR儀器。對(duì)本實(shí)施例的方法數(shù)據(jù)連續(xù)重復(fù)做16個(gè)平行樣品，對(duì)該16個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，其檢測(cè)數(shù)據(jù)如表I。表I
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因玉米59122品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，主要包括以下步驟 (1)合成具有以下核苷酸序列的引物及與引物配合使用的熒光探針， 上游引物序列，59122event-F: 5’ -AAITCGCCCTATAGTGAGTCGTA-3’ 下游引物序列，59122event-R: 5’ -GATAAACAAACGGGACCATAGAA-3’ 熒光探針序列，59122event-P: 5’ -FAM-CGCAAITCAGTACATTAAAAACGTCCGC-TAMRA-3’ ； (2)制備59122品系的DNA稀釋液； (3)配制PCR反應(yīng)體系； (4)定量PCR檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因玉米59122品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(I)所述合成的引物及熒光探針的濃度均為lOMfliol/1，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/W。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米59122品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將3W的DNA稀釋液加入到25W反應(yīng)體系中，所述25M1的反應(yīng)體系包括以下組分 Taqman Master mix12. 5M-I上游引物IW下游引物IW熒光探針0. 5 m水IOul。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的轉(zhuǎn)基因玉米59122品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性lOmin，I個(gè)循環(huán)；95°C變性15s，59°C退火60s，45個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及基因的定量分析方法，具體是指轉(zhuǎn)基因玉米59122品系特異定量PCR精準(zhǔn)檢測(cè)方法。本發(fā)明采用設(shè)計(jì)的特異性上游引物59122event-F、下游引物59122event-R、熒光探針59122event-P、59122品系的DNA稀釋液以及TaqmanMastermix和水配制成PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。本發(fā)明主要建立了一種高擴(kuò)增效率、高準(zhǔn)確度的Taqman定量PCR檢測(cè)技術(shù)，適用于國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)、進(jìn)出境口岸轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品檢驗(yàn)、企業(yè)內(nèi)部進(jìn)口原材料含轉(zhuǎn)基因59122品系生物成分檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102618657SQ201210114359
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月18日
發(fā)明者劉勇, 劉文娟, 宋君, 尹全, 常麗娟, 張富麗, 王東, 郭靈安, 雷紹榮 申請(qǐng)人:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心