本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)病理領(lǐng)域，尤其涉及一種快速、低毒的蚊蟲石蠟切片制作方法。

背景技術(shù)：

石蠟切片法是組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中最為廣泛應(yīng)用的方法，石蠟切片不僅用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察及判斷細(xì)胞組織形態(tài)變化的主要方法。石蠟切片法的基本過程是先將已經(jīng)固定的送檢組織經(jīng)沖洗、脫水、透明、浸蠟，然后用石蠟將組織包埋成蠟塊，再經(jīng)切片機(jī)切片和染色，最終制成石蠟切片。

石蠟切片技術(shù)也是研究蚊蟲組織形態(tài)及組織病理的重要實(shí)驗技術(shù)。對于蚊蟲的切片研究，對掌握蚊蟲體內(nèi)的病毒分布和機(jī)體結(jié)構(gòu)具有重要的意義。但是，蚊蟲蟲外骨骼較為堅硬，水溶性固定液、脫水酒精等難以迅速、均一的滲透于整個蚊蟲中，從而難以制作完整的石蠟切片。同時，蚊蟲體內(nèi)組織相對柔軟，價值血淋巴的存在，致使組織像懸浮于流體物質(zhì)中，若浸蠟不足，難以切出完整的切片。目前蚊蟲石蠟切片方法多數(shù)用于蚊蟲的局部組織或器官(如觸角、消化道、足等)，這樣不能觀察到蚊蟲整體的顯微結(jié)構(gòu)。針針對這種身體柔軟、液體含量高、腔室比例大的幼蟲蟲體材料，埋、切片等的效果不夠理想，最終切片對組織區(qū)分度十分有限，尤其是占蟲體比例非常大的消化道容易變形或破碎，難以觀察到蟲體完整空間結(jié)構(gòu)。

同時，傳統(tǒng)制片方法中所采用的福爾馬林、二甲苯等易揮發(fā)、有強(qiáng)烈的刺激性和高劇毒性，對病理工作人員的工作環(huán)境和生活環(huán)境都十分有害，長期接觸福爾馬林可能會引起慢性呼吸道疾病、癌癥發(fā)生，導(dǎo)致記憶力和智力下降，嚴(yán)重時可出現(xiàn)胃腸穿孔、肝臟損害甚至昏迷；(2)傳統(tǒng)的組織處理過程都是分步進(jìn)行的，每個過程所需要的試劑量大，對操作人員的危害大；組織處理時間長，從取材到出報告需要3-5d的時間。

目前常規(guī)的切片方法不僅操作復(fù)雜，需要耗費(fèi)較長時間，且常使用毒性大的二甲苯，易揮發(fā)、有強(qiáng)烈的刺激性和高劇毒性，對病理工作人員的工作環(huán)境和生活環(huán)境都十分有害，長期接觸可能會引起慢性呼吸道疾病、癌癥發(fā)生，導(dǎo)致記憶力和智力下降，嚴(yán)重時可出現(xiàn)胃腸穿孔、肝臟損害甚至昏迷。更重要的是最終固定、包埋、切片等的效果不夠理想，最終切片對組織區(qū)分度十分有限，難以觀察到蟲體完整空間結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，一種快速、低毒的蚊蟲石蠟切片制作方法，操作簡單、耗時短，毒性低，且能觀察到蚊蟲體完整的空間結(jié)構(gòu)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種快速、低毒的蚊蟲石蠟切片制作方法，包括以下步驟：

1)人工喂養(yǎng) 取若干只蚊蟲，饑餓10-24h,放入蚊籠內(nèi)，并放入蘸滿小鼠血的海綿塊，30min-60min后取出蚊蟲。

2)取材與固定 將喂養(yǎng)后的蚊蟲凍麻，然后去除腿和翅，放入固定液中固定，在負(fù)壓下固定1h,繼續(xù)室溫下固定12-24h,用60％酒精清洗2-3次，然后保存在60％酒精中備用。

3)脫水、透明 取固定后的蟲體，在4℃條件下，依次用濃度梯度為60％、70％、90％、100％Ⅰ、100％Ⅱ的乙醇溶液脫水，每個梯度的處理時間至少為1小時，最后加入到透明劑中加熱煮沸，進(jìn)行透明。100％Ⅰ、100％Ⅱ均為濃度為100％的乙醇。

4)透蠟、包埋 將3)中透明好的蟲體，在負(fù)壓條件下放入Hemo-De和石蠟1：1的混合溶液中浸泡20-40min,然后放入石蠟中浸泡30min-1h三次，完成透蠟過程，最后，放入硬蠟中完成包埋過程。Hemo-De為一種衍生于n-檸檬油精的透明劑。

5)切片 將4)中包埋好的石蠟塊經(jīng)過分割、修整與固著，然后經(jīng)切片機(jī)將石蠟塊切成5-8μm的切片，并展片。

6)染色 具體步驟為：采用蘇木精染液染色2-3min,自來水沖洗5-10min,1％鹽酸酒精5-10s,自來水洗3-5min，弱堿性水溶液顯藍(lán)30s,自來水洗5-10min,蒸餾水洗2-3次，0.25％水溶液伊紅染液染色2-3min,蒸餾水洗1-2次,最后用梯度酒精脫水。

7)封片 采用松節(jié)油稀釋的樹膠封片。

作為一種優(yōu)選的方案，步驟2)中，所述固定液為Bouin氏液或含4％甲醛的PBS溶液。

作為一種優(yōu)選的方案，所述的Bouin氏液是由下列試劑按體積比配制而成：飽和苦味酸15份，福爾馬林5份，冰醋酸1份。

作為一種優(yōu)選的方案，步驟3)中，所述透明劑為甲基環(huán)己烷、氯仿或正丁醇中的一種。

作為一種優(yōu)選的方案，步驟2)中的負(fù)壓為-0.05～-0.3MPa，步驟4)中的負(fù)壓為-0.1～-0.5MPa。

作為一種優(yōu)選的方案，步驟4)中，所述蟲體放入石蠟中浸泡30min-1h三次具體為在50-55℃下浸泡30min,55-58℃下浸泡30min,58-60℃下浸泡1h。

作為一種優(yōu)選的方案，步驟5)中，所述切片機(jī)為輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)。

由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明涉及的石蠟切片制作方法，針對蚊蟲外壁較硬，固定液難以迅速、均勻的滲透；同時，體內(nèi)組織較柔軟，透蠟不足則很難切片的特性，采取了一系列措施。首先，采取喂養(yǎng)后的蚊蟲進(jìn)行切片，更直觀的觀察蚊蟲的腸和食道。然后，固定前去除蚊蟲的腳和翅，一方面便于固定，另一方面加快后續(xù)的透蠟過程，保證透蠟的均勻性。同時，本制作方法的固定和透蠟過程均在負(fù)壓下進(jìn)行，組織和溶劑的阻力將至最低，更有利于固定液和石蠟的浸入，從而保證切片的順利進(jìn)行；還一定程度上較少了制片的時間，加快了工作效率。最后，本制作方法，采用的固定液、透明劑、封片劑等溶劑中并未使用二甲苯，，大大降低了對病理科技術(shù)人員的身體危害及對環(huán)境的污染。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

一種快速、低毒的蚊蟲石蠟切片制作方法，包括以下步驟：

1)人工喂養(yǎng) 取若干只蚊蟲，饑餓12h,放入蚊籠內(nèi)，并放入蘸滿小鼠血的海綿塊，30min后取出蚊蟲。

2)取材與固定 將喂養(yǎng)后的蚊蟲凍麻，然后去除腿和翅，放入固定液Bouin氏液中固定，在負(fù)壓下固定1h,繼續(xù)室溫下固定12h,用60％酒精清洗2次，然后保存在60％酒精(均指濃度)中備用。

3)脫水、透明 取固定后的蟲體，在4℃條件下，依次用濃度梯度為60％、70％、90％、100％Ⅰ、100％Ⅱ的乙醇溶液脫水，每個梯度的處理時間為1小時，最后加入到透明劑甲基環(huán)己烷中加熱煮沸，進(jìn)行透明。

4)透蠟、包埋 將3)中透明好的蟲體，在負(fù)壓條件下放入Hemo-De和石蠟1：1的混合溶液中浸泡20min,然后放入石蠟中浸泡三次，三次具體為在50℃下浸泡30min,55℃下浸泡30min,58℃下浸泡1h完成透蠟過程，最后，放入硬蠟中完成包埋過程。

5)切片 將4)中包埋好的石蠟塊經(jīng)過分割、修整與固著，然后經(jīng)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)將石蠟塊切成5μm的切片，并展片。

6)染色 具體步驟為：采用蘇木精染液染色2min,自來水沖洗5min,1％鹽酸酒精5s,自來水洗3min，弱堿性水溶液顯藍(lán)30s,自來水洗5min,蒸餾水洗2次，0.25％水溶液伊紅染液染色2min,蒸餾水洗1次。染色后的切片尚不能在顯微鏡下觀察，需經(jīng)梯度酒精脫水，在95％及純酒精中的時間可適當(dāng)加長以保證脫水徹底。

7)封片 采用松節(jié)油稀釋的樹膠封片，制成標(biāo)本。

實(shí)施例2

一種快速、低毒的蚊蟲石蠟切片制作方法，包括以下步驟：

1)人工喂養(yǎng) 取若干只蚊蟲，饑餓18h,放入蚊籠內(nèi)，并放入蘸滿小鼠血的海綿塊，60min后取出蚊蟲。

2)取材與固定 將喂養(yǎng)后的蚊蟲凍麻，然后去除腿和翅，放入固定液中固定，在負(fù)壓-0.1MPa下固定1h,繼續(xù)室溫下固定15h,用60％酒精清洗3次，然后保存在60％酒精中備用。

3)脫水、透明 取固定后的蟲體，在4℃條件下，依次用濃度梯度為60％、70％、90％、100％Ⅰ、100％Ⅱ的乙醇溶液脫水，每個梯度的處理時間為1小時，最后加入到透明劑中加熱煮沸，進(jìn)行透明。100％Ⅰ、100％Ⅱ均為濃度為100％的乙醇。

4)透蠟、包埋 將3)中透明好的蟲體，在負(fù)壓-0.3MPa條件下放入Hemo-De和石蠟1：1的混合溶液中浸泡30min,然后放入石蠟中浸泡三次，三次具體為在52℃下浸泡30min,55℃下浸泡30min,60℃下浸泡1h完成透蠟過程，完成透蠟過程，最后，放入硬蠟中完成包埋過程。Hemo-De為一種衍生于n-檸檬油精的透明劑。

5)切片 將4)中包埋好的石蠟塊經(jīng)過分割、修整與固著，然后經(jīng)切片機(jī)將石蠟塊切成8μm的切片，并展片。

6)染色 具體步驟為：采用蘇木精染液染色3min,自來水沖洗10min,1％鹽酸酒精10s,自來水洗5min，弱堿性水溶液顯藍(lán)30s,自來水洗10min,蒸餾水洗3次，0.25％水溶液伊紅染液染色3min,蒸餾水洗2次,最后用梯度酒精脫水。

7)封片 松節(jié)油透明后，迅速擦去材料周圍多余液體，滴加適量(1～2滴)中性樹膠，再將潔凈蓋玻片傾斜放下，以免出現(xiàn)氣泡，封片后即制成永久性玻片標(biāo)本。