本發(fā)明涉及體外檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

透明帶是一層包繞著卵母細(xì)胞及著床前孕卵的非細(xì)胞性明膠樣酸性糖蛋白膜，主要由3 種糖蛋白組成的內(nèi)含特異性精子受體，其作用是誘發(fā)精子頂體反應(yīng)、精卵識別、結(jié)合、穿透和阻止多精子入卵，在正常生理情況下，精子與透明帶結(jié)合后，依靠精子的酶系統(tǒng)產(chǎn)生局部的溶解作用，受精后透明帶恢復(fù)完整性，保護(hù)受精卵的發(fā)育。

抗透明帶抗體在體內(nèi)與透明帶結(jié)合，可以阻止精卵結(jié)合，干擾卵子與卵泡細(xì)胞間的反應(yīng)，導(dǎo)致卵細(xì)胞和卵子閉鎖?？雇该鲙Э贵w另一方面會使精子的運(yùn)動能力下降，影響精子穿過宮頸黏液及上行，并影響精子獲能；另外還會對透明帶的孕卵產(chǎn)生損傷作用，結(jié)果導(dǎo)致不能正常發(fā)育而至流產(chǎn)。國內(nèi)外研究均在不孕婦女中發(fā)現(xiàn)較高的透明帶抗體檢出率。因此抗透明帶抗體檢測對臨床診斷與治療不孕不育患者也有重要意義。

目前臨床檢測抗透明帶抗體的常見方法有酶聯(lián)免疫吸附法、酶促化學(xué)發(fā)光法，但這些方法都存在著一些不足之處。

一、酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 被廣泛應(yīng)用，但該方法也存在著下述的不足之處：

(1) 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96 孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應(yīng)容器，在使用時只能分成12 批次、6 批次、8 批次或整板一次使用，無法進(jìn)行獨(dú)立的、單人份的檢測；

(2) 定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；

(3) 缺少對檢測信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識才能了解或知悉檢測試劑的生產(chǎn)批號及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；

(4) 檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；

(5) 檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差；

(6) 在檢測項目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項目數(shù)×48/96人份，如果需要檢測10 個項目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10×48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測10 個不同的項目，也需要配置10×48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟(jì)合理的缺點(diǎn)。

二、化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光法按發(fā)光原理可分為直接化學(xué)發(fā)光和酶促化學(xué)發(fā)光。

酶促化學(xué)發(fā)光主要有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶兩種，但都有一定的局限性，辣根過氧化物酶主要缺點(diǎn)為：魯米諾在沒有辣根過氧化物酶存在情況下，也會被H2O2氧化自身發(fā)光，本底相對較高，影響信噪比，反應(yīng)動力學(xué)復(fù)雜，影響因素多，結(jié)果不夠穩(wěn)定，要得到靈敏度高且平臺期長的底物不容易。堿性磷酸酶主要缺點(diǎn)為：底物達(dá)到平臺期的時間長，底物成本高，導(dǎo)致檢測成本高，患者負(fù)擔(dān)重。

吖啶酯作為標(biāo)記物的直接化學(xué)發(fā)光相比酶促化學(xué)發(fā)光具有明細(xì)優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在：反應(yīng)不需要催化劑，只要堿性環(huán)境即可進(jìn)行，反應(yīng)迅速，背景發(fā)光低，信噪比高，干擾因素少，試劑穩(wěn)定性好，可以兩點(diǎn)定標(biāo)，體系簡單，激發(fā)液成本低，吖啶酯易與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)，且聯(lián)結(jié)后光子產(chǎn)率不減少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種檢測靈敏度較高的抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒及其制備方法。

一種抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，包括：抗透明帶抗體重組蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。

在一個實施例中，所述抗透明帶抗體重組蛋白包被的羧基化的磁微粒中，所述抗透明帶抗體重組蛋白與所述羧基化的磁微粒的比例為1：25~35。

在一個實施例中，所述抗人免疫球蛋白標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中，所述抗人免疫球蛋白與所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的比例為50：1~10。

在一個實施例中，所述羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm~1μm。

在一個實施例中，所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。

在一個實施例中，還包括化學(xué)發(fā)光底物液，所述化學(xué)發(fā)光底物液包括A液和B液。

在一個實施例中，所述A液為H₂O₂溶液，所述B液為NaOH溶液。

在一個實施例中，還包括抗透明帶抗體定標(biāo)品。

在一個實施例中，所述抗透明帶抗體定標(biāo)品為濃度分別為1U/L、10U/L、100U/L、500U/L、1000U/L和2000U/L的抗透明帶抗體的溶液。

一種上述的抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入抗透明帶抗體重組蛋白，室溫下混懸2h~10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到抗透明帶抗體重組蛋白包被的羧基化的磁微粒；以及

取抗人免疫球蛋白，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加入化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物后混勻，室溫下避光反應(yīng)1h~2h后除雜，得到抗人免疫球蛋白標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。

這種抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，完成抗透明帶抗體的檢測這種抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，經(jīng)過實驗，其檢測靈敏度達(dá)到1U/L，相對于傳統(tǒng)的抗透明帶抗體的檢測方法靈敏度至少提高了10倍，這種抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。

附圖說明

圖1為一實施方式的抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法的流程圖；

圖2為實施例3得到的抗透明帶抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的具體實施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。

一實施方式的抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，包括：抗透明帶抗體重組蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。

優(yōu)選的，抗透明帶抗體重組蛋白包被的羧基化的磁微粒中，抗透明帶抗體重組蛋白與羧基化的磁微粒的比例為1：25~35。

優(yōu)選的，抗人免疫球蛋白標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中，抗抗人免疫球蛋白與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的比例為50：1~10。

優(yōu)選的，羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm~1μm。

化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。其中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物優(yōu)選為吖啶酯。

在其他的實施例中，上述抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒還包括化學(xué)發(fā)光底物液。

化學(xué)發(fā)光底物液包括A液和B液。A液可以為H₂O₂溶液，B液可以為NaOH溶液。

本實施例中，A液為濃度為0.1mol/L的H₂O₂溶液，B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶液。

在其他的實施例中，上述抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒還包括抗透明帶抗體定標(biāo)品。

抗透明帶抗體定標(biāo)品為濃度分別為1U/L、10U/L、100U/L、500U/L、1000U/L和2000U/L的抗透明帶抗體的溶液。

具體的，抗透明帶抗體定標(biāo)品可以采用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液將抗透明帶抗體配制成濃度分別為1U/L、10U/L、100U/L、500U/L、1000U/L和2000U/L的抗透明帶抗體的溶液。

這種抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒用于抗透明帶抗體檢測時，利用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對抗透明帶抗體定標(biāo)品進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)置于電腦軟件；接著測試實際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計算樣本濃度；最后對抗透明帶抗體全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行性能（靈敏度、線性、精密度、干擾性）的評價。

這種抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，完成抗透明帶抗體的檢測這種抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，經(jīng)過實驗，其檢測靈敏度達(dá)到1U/L，相對于傳統(tǒng)的抗透明帶抗體的檢測方法靈敏度至少提高了10倍，這種抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。

此外，這種抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒還具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、選擇吖啶酯作為標(biāo)記材料，并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直接化學(xué)發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學(xué)發(fā)光相比，該反應(yīng)不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；

2、選用吖啶酯的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)線性范圍寬，能達(dá)到1U/L~ 1000U/L，而傳統(tǒng)的抗透明帶抗體的檢測方法的檢線性范圍為20U/L~ 1000U/L；

3、吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復(fù)性高，批內(nèi)及批間差均在5%以內(nèi)，這是其它化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達(dá)到的；

4、化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；

5、化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)可以實現(xiàn)全自動化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。

如圖1所示的上述抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入抗透明帶抗體重組蛋白，室溫下混懸2h~10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到抗透明帶抗體重組蛋白包被的羧基化的磁微粒。

MES（2-(N-嗎啡啉)乙磺酸）緩沖液的濃度為0.02M，pH為5.5。

Tris緩沖液的濃度為0.1M并且含有2%BSA，pH為8.0。

EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺）水溶液的濃度為10mg/mL~20mg/mL，EDC與羧基化的磁微粒的比例為0.05：0.1~1。

優(yōu)選的，抗透明帶抗體重組蛋白包被的羧基化的磁微粒中，抗透明帶抗體重組蛋白與羧基化的磁微粒的比例為1：25~35。

優(yōu)選的，羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm~1μm。

取抗人免疫球蛋白，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加入化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物后混勻，室溫下避光反應(yīng)1h~2h后除雜，得到抗人免疫球蛋白標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。

碳酸鹽緩沖液濃度為0.1M，pH為9.0~9.5，

除雜的操作為離心脫鹽柱脫鹽，具體操作為：先分別用純凈水及TBS緩沖液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）處理離心脫鹽柱，最后加入得到的抗透明帶抗體重組蛋白包被的羧基化的磁微粒的溶液，最后收集離心管中的液體。

優(yōu)選的，抗人免疫球蛋白標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中，抗透明帶抗體重組蛋白與化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的比例為50：1~10。

化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。其中，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物優(yōu)選為吖啶酯。

得到的抗透明帶抗體重組蛋白包被的羧基化的磁微粒和抗人免疫球蛋白標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物組合即可得到上述抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒。

這種抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒在使用時，還需要化學(xué)發(fā)光底物液和抗透明帶抗體定標(biāo)品。

化學(xué)發(fā)光底物液和抗透明帶抗體定標(biāo)品可以自行配制得到。

化學(xué)發(fā)光底物液包括A液和B液。A液可以為H₂O₂溶液，B液可以為NaOH溶液。

本實施例中，A液為濃度為0.1mol/L的H₂O₂溶液，B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶液。

具體的，抗透明帶抗體定標(biāo)品可以采用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液將抗透明帶抗體配制成濃度分別為1U/L、10U/L、100U/L、500U/L、1000U/L和2000U/L的抗透明帶抗體的溶液。

這種抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法簡單方便，制得的抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的檢測靈敏度較高，具有良好的應(yīng)用前景。

以下為具體實施例。

實施例1：抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備

（1）抗透明帶抗體重組蛋白包被的羧基化的磁微粒的制備：

取含有50mg粒徑為0.05μm~1μm的羧基化的磁微粒（MagnaBind21353）懸浮液，磁分離去上清，用0.02 M，pH為5.5 MES緩沖液重懸，加入1mL新配置的10mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入4mg抗透明帶抗體重組蛋白（biorbyt，貨號orb48780），室溫下混懸6h，磁分離，去除上清，用含2%BSA的0.1M，pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到抗透明帶抗體重組蛋白包被的羧基化的磁微粒，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

（2）抗人免疫球蛋白標(biāo)記的吖啶酯的制備：

取50μL濃度為25mg/mL的抗人免疫球蛋白，加入150μL濃度為0.1M、pH為9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1.5μL濃度為5mg/mL的吖啶酯溶液混勻，室溫下避光反應(yīng)，1.5h后取出，用2mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進(jìn)行處理，最后加入得到的抗人免疫球蛋白標(biāo)記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到抗人免疫球蛋白標(biāo)記的吖啶酯，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）抗透明帶抗體定標(biāo)品的制備：

用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）將抗透明帶抗體配置成濃度為0U/L、10U/L、100U/L、500U/L、1000U/L和2000U/L，每瓶0.5 mL分裝凍干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2：抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法

以全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（YHLO，貨號iFlash3000）為檢測工具，方法學(xué)模式為間接免疫法，即儀器依次加入50 μL的樣品、50 μL的抗透明帶抗體重組蛋白包被的羧基化的磁微粒以及50 μL的抗透明帶抗體處理液，反應(yīng)20 min后，再加50 μL的抗人免疫球蛋白吖啶酯，反應(yīng)20 min后，進(jìn)行磁分離，儀器將反應(yīng)混合物送入暗室，依次加入發(fā)光底物A液（H₂O₂）及B液（NaOH）進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，最后記錄發(fā)光值。

實施例3：抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒性能評價

采用實施例2中的方法對抗透明帶抗體定標(biāo)品進(jìn)行檢測，得到繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

接著對接著測試實際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計算樣本濃度。

靈敏度的檢測：

參照CLSI EP17-A 文件推薦實驗方案，計算抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為1U/L。

線性的檢測：

對濃度為1U/L、10U/L、100U/L、500U/L、1000U/L和2000U/L 標(biāo)準(zhǔn)品做線性分析，計算線性相關(guān)系數(shù)，r=0.9996，另外，該試劑盒對抗透明帶抗體樣品檢測的線性范圍為1U/L ~1000U/L。

精密度測定：

取濃度為50U/L及500U/L兩個抗透明帶抗體樣品，每個樣本每個濃度各做3個平行，用三批試劑盒進(jìn)行檢測，計算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果表明該試劑盒批內(nèi)及批間差均小于5%。

干擾性實驗：

取混合血清分別添加干擾物包括：結(jié)合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加比例按照 1：20進(jìn)行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計算二者之間的偏差，以 ±10%為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達(dá)到 NCCLS 的文件標(biāo)準(zhǔn)，可用于臨床實驗室抗透明帶抗體 狀況的準(zhǔn)確評估。

實施例4、抗透明帶抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的對比實驗

分別用化學(xué)發(fā)光檢測方法和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法對濃度為0、50U/L的抗透明帶抗體樣品做檢測，兩種方法檢測靈敏度相比，數(shù)據(jù)如下表所示：

由上表可以看出，化學(xué)發(fā)光檢測方法的靈敏度較酶聯(lián)免疫吸附法提高了10倍以上。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。