本發(fā)明專利涉及一種血清ACY1抗體定量檢測試劑盒，可用于肝硬化患者的篩查和早期診斷。

背景技術(shù)：

慢性乙肝-肝硬化-肝細胞癌(HCC)是總所周知的肝癌發(fā)生三部曲。由于HCC缺乏早期癥狀，大部分病人出現(xiàn)癥狀時已屬中晚期，失去有效治療的機會，存活期一般少于1年，早期HCC通過切除術(shù)或肝移植，5年生存率在60-70％以上。因此，對高危人群如肝硬化的篩查和早期診斷、準(zhǔn)確區(qū)分慢性乙肝和肝硬化，對指導(dǎo)病人的及時治療至關(guān)重要。目前肝硬化的診斷主要通過肝臟活檢和影像學(xué)檢查，肝臟活檢雖然一直被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于取樣誤差以及侵入性特點等限制了其廣泛應(yīng)用；影像學(xué)檢查如B超對臨床醫(yī)生的個人經(jīng)驗要求較高。比較而言，血清標(biāo)志物因為獲取方便，便于重復(fù)操作和動態(tài)觀察，易于被患者接受，非常適合在人群中篩查肝硬化病例，但目前臨床上仍缺乏敏感度高、特異性好，可用于區(qū)分乙肝和肝硬化的血清學(xué)標(biāo)志物。

近年來的研究表明，在疾病發(fā)生發(fā)展的過程中，由于內(nèi)外因素的影響，機體某些與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白有可能由于基因突變、異常表達或細胞定位異常等改變而產(chǎn)生抗原性，患者細胞中會出現(xiàn)針對這些自體細胞抗原的抗體免疫反應(yīng)，通過檢測外周血中的這些自身抗體可以進行疾病的診斷。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，自身抗體不僅可以出現(xiàn)在自身免疫性疾病如自身免疫性肝病、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡，還可以出現(xiàn)在非自身免疫性疾病如腫瘤等疾病中。最近的一項小樣本研究發(fā)現(xiàn)，alpha-enolase(α-ENO1，烯醇化酶)在肝纖維化早中期能夠激發(fā)機體的自身免疫反應(yīng)，其自身抗體水平在肝纖維化的診斷中具有潛在的價值。

在國家自然科學(xué)基金面上項目“肝細胞癌早期診斷血清自身抗體標(biāo)志物的篩選與分析”(項目編號81071973)和“人肝癌轉(zhuǎn)移特異性標(biāo)志物的篩選及驗證”(項目編30572128)、以及留學(xué)人員擇優(yōu)資助北京市重點項目“肝癌早期診斷血清自身抗體標(biāo)志物的篩選與臨床考核”(項目編號：20110323)的資助下，我們通過大樣本研究對肝硬化、慢性肝炎及健康人血清的蛋白芯片高通量檢測篩選出是一種肝硬化特異自體抗原蛋白，肝硬化患者血清中自身抗體水平顯著高于慢性肝炎(P＜0.001)，具有很好的區(qū)分肝硬化與慢性乙肝的能力，AUC值達0.874。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測試劑盒，該試劑盒能夠定量檢測血清中ACY1抗體水平，可用于區(qū)分乙肝和肝硬化，將有助于肝硬化的篩查及早期診斷。

本發(fā)明的檢測試劑盒采用酶聯(lián)免疫法測定，抗體檢測反應(yīng)板為包被有ACY1抗原蛋白的酶標(biāo)96孔板，待測血清中的ACY1抗體能夠與反應(yīng)孔中的ACY1蛋白特異性結(jié)合而吸附于反應(yīng)孔內(nèi)，加入HRP標(biāo)記的兔抗人IgG二抗孵育，充分洗滌后加入顯色底物，終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測定各反應(yīng)孔的吸光度OD值，其OD值與ACY1抗體水平呈正比。過標(biāo)準(zhǔn)品的檢測繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并對各血清標(biāo)本中的ACY1抗體水平進行定量。

本發(fā)明所述檢測試劑盒的制備包括如下步驟：

1.重組ACY1抗原蛋白的制備：本課題組制備的ACY1抗原蛋白為帶有His標(biāo)簽的His-ACY1融合蛋白。采用pET21a載體構(gòu)建的人ACY1重組表達載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌，提取質(zhì)粒并鑒定重組表達體基因序列。將測序正確的重組表達體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌并誘導(dǎo)其表達His-ACY1融合蛋白，收集菌體并處理得到菌液上清，利用Ni-NTA親和層析柱純化得到His-ACY1抗原蛋白。

2.檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品的選定：本課題組在前期工作基礎(chǔ)上，已通過蛋白芯片技術(shù)定量檢測篩選出一批高水平表達ACY1抗體的血清標(biāo)本，可以作為本檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品進行質(zhì)量控制和抗體定量。

3.制備酶標(biāo)反應(yīng)板：用棋盤法確定酶標(biāo)板的最佳包被濃度，各反應(yīng)孔內(nèi)加入最佳濃度的ACY1抗原蛋白100ul，37℃孵育2h后，4℃過夜后甩掉蛋白溶液，用洗滌液PBS-T(0.01mol/LPBS，pH 7.2-7.4，0.05％Tween 20)洗板1次。然后各反應(yīng)孔內(nèi)加入10％的NBS封閉液200ul以封閉反應(yīng)孔內(nèi)未結(jié)合的空白位點，37℃孵育2h后甩掉封閉液，甩干后于室溫晾干過夜，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明提供的檢測試劑盒的優(yōu)勢之處在于：提供了一種新的肝硬化篩查及早期診斷方法。

附圖說明：

圖1：pET21a-ACY1表達質(zhì)粒的酶切驗證。1為pET21a-ACY1，2為pET21a-ACY1 NdeI和XhoI雙酶切產(chǎn)物，M為DNA Marker。

圖2：人ACY1原核表達載體測序鑒定。

圖3：BL21(DE3)菌株在0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)下融合蛋白的表達情況，其中2為表達菌體裂解上清，3為表達菌體裂解沉淀，4為未誘導(dǎo)對照。1為ProteinRuler II Marker。

圖4：大腸桿菌誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的Western-Blot結(jié)果。為BL21(DE3)菌株的融合蛋白表達 情況。

圖5：融合蛋白純化結(jié)果。

圖6：融合蛋白純化產(chǎn)物的Western-Blot結(jié)果。驗證是否為相關(guān)融合蛋白純化產(chǎn)物。

具體實施方式

實施例1ACY1重組蛋白的制備

一、材料

DNA marker(1k-10k)彩虹預(yù)染蛋白marker(14-120KD)均購自北京天根生化科技有限公司；化學(xué)發(fā)光蛋白Marker ProteinRuler II Marker(20-90KD)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌BL21(DE3)為本實驗室保存；異丙基硫代盧-D-半乳糖苷(IPTG)為Amresco產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG購自美國Earthox公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

二、人ACY1原核表達載體的構(gòu)建及鑒定

本課題組重組表達的蛋白為ACY1蛋白，并在其C端加上了組氨酸His標(biāo)簽，共包含408個氨基酸，分子量為45.885KD。

1.人ACY1原核表達載體的構(gòu)建

本課題組通過對1224bp ACY1基因序列進行密碼子優(yōu)化并人工合成，其中5’端添加NdeI酶切位點序列，3’端添加XhoI酶切位點序列。將合成的ACY1基因序列克隆入pET21a載體(表達蛋白C端將帶有His標(biāo)簽)，酶切及測序鑒定成功后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞。取5ul轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)內(nèi)，涂布于LB(含Amp抗生素)平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

2.人ACY1原核表達載體的鑒定

對人ACY1原核表達載體進行酶切及測序鑒定，結(jié)果見附圖1及附圖2。其基因序列與GeneBank上公布的基因序列一致。

三、His-ACY1融合蛋白大腸桿菌菌株誘導(dǎo)表達

1.BL21(DE3)菌株融合蛋白的誘導(dǎo)表達

測序正確地重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細胞內(nèi)，挑取單個菌落放入3ml液體LB培養(yǎng)基(含Amp)內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按7％的比例將上述菌液加入到100ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3.5h，測得OD600值為0.5，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，在16℃振蕩培養(yǎng)15h。對照組不加IPTG誘導(dǎo)，同樣在16℃振蕩培養(yǎng)15h。收集菌液到1.5ml離心管中，8000rpm/min離心3min后收集表達菌體經(jīng)超聲裂解后，4℃12000rpm離心10分鐘取上清進行SDS-PAGE電泳驗證蛋白表達情況。加入上樣緩沖液煮沸10min，進行12％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色觀察融合蛋白的表達情況，結(jié)果見附圖3

2.表達產(chǎn)物的Western-Blot鑒定

將重組菌菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，然后進行蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上(300mA，1h)；膜用含5％脫脂奶粉的Tris緩沖鹽-吐溫緩沖液(TBST)室溫緩搖封閉1h；然后用TBST緩沖液洗滌3次后，用含ACY1抗體的TBST溶液4℃孵育反應(yīng)過夜；用TBST緩沖液洗膜3次后加入1∶8000的HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG，室溫下緩搖孵育1h，TBST緩沖液洗膜3次，在吸水紙上瀝干緩沖液后將膜浸入化學(xué)發(fā)光液中，30s后于顯像儀下呈像，結(jié)果見附圖4。

四、HIS-ACY1融合蛋白的純化

1.Ni-NTA親和層析柱純化His-ACY1融合蛋白

挑取含重組質(zhì)粒的BL21(DE3)單菌落置3ml液體LB培養(yǎng)基(含Amp)中37℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日，按7％的比例將上述菌液加入到1000ml液體LB培養(yǎng)基(含Amp)中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5，加入IPTG使終濃度為1.0mmol/L，16℃振蕩培養(yǎng)6h，按上述同樣方法收集菌體，用緩沖液PBS(PH 7.0)懸浮菌體，進行超聲破碎60min，12000rpm/min離心去沉淀。將上清液分為3組，分別加入到經(jīng)PBS(PH 7.0)預(yù)平衡的Ni-NTA親和層析柱，用5倍柱體積的PBS(PH 7.0)充分洗滌后，以250mmol/L的咪唑洗脫，收集洗脫液，進行12％SDS-PAGE電泳，并對產(chǎn)物進行Western-Blot驗證。結(jié)果見附圖5及附圖6。

2.His融合蛋白產(chǎn)品的制備

將上述咪唑洗脫液再經(jīng)過透析處理，最終制備的蛋白濃度為0.5mg/ml。

實施例2酶標(biāo)板的制備

一、材料

96孔酶標(biāo)板購自美國Thermo公司；重組ACY1抗原蛋白為本實驗室制備；NBS購自購自美國Thermo公司；TMB顯色液及終止液均購自北京索萊寶科技有限公司；HRP標(biāo)記的兔抗人IgG購自美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

二、檢測試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品的制備

本課題組在前期研究過程中，已通過蛋白芯片技術(shù)定量檢測了一批肝癌患者血清ACY1抗體水平，將其中篩選出的含有高水平ACY1抗體的血清(蛋白芯片檢測信號值大于6000)的20例血清標(biāo)本混合，作為本檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品。

三、酶標(biāo)板包被濃度的確定

1.酶標(biāo)板的包被

采用棋盤法確定酶標(biāo)板的最佳包被濃度。用CB(0.05mol/L，pH 9.16)稀釋ACY1蛋白至不同濃度(0.625-2.5ug/ml)進行包被，每個濃度重復(fù)兩列，各反應(yīng)孔加入上述蛋白100ul置于37℃恒溫箱孵育2h，后于4℃冰箱過夜；然后甩掉液體，各反應(yīng)孔加入400ul洗滌液PBS-T(0.01mol/L PBS，pH 7.2-7.4，0.05％Tween 20)洗滌1次，在實驗臺上適度晃動酶標(biāo)板后甩掉 洗滌液，在吸水紙上拍干酶標(biāo)板。

2.酶標(biāo)板的封閉

向上述酶標(biāo)板的各反應(yīng)孔中加入10％的NBS封閉液200ul，37℃孵育2小時后甩掉封閉液，甩干后與室溫過夜晾干。

3.酶標(biāo)板檢測

各反應(yīng)孔中加入樣本稀釋液(10％NBS-PBS)100ul，各反應(yīng)孔內(nèi)加入樣品10ul，將酶標(biāo)板置于37℃恒溫箱孵育1h。甩掉液體后洗板6次。然后各反應(yīng)孔加1∶8000的HRP-兔抗人IgG100ul，于37℃恒溫箱孵育30min后洗板6次。配置TMB顯色液(等體積A液+B液)，各反應(yīng)孔內(nèi)加入顯色液100ul，避光條件下37℃恒溫箱反應(yīng)10min，然后各反應(yīng)孔加入終止液50ul以終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450nm、630nm條件下測定各反應(yīng)孔的OD值。