發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于檢測穩(wěn)定在固體載體材料上的癡呆和阿爾茨海默病相關(guān)生物標(biāo)記的方法。

發(fā)明背景

癡呆當(dāng)前影響全球四千四百萬個體。到2050年該數(shù)字將會上升至一億三千五百萬。當(dāng)前全球費(fèi)用為$600bn。對阿爾茨海默病治療的研究飽受失敗。2002到2012年之間，超過99%的旨在預(yù)防或逆轉(zhuǎn)該疾病的試驗(yàn)失敗。所有的失敗均歸于已經(jīng)太晚時才治療患者，因?yàn)榘Y狀在疾病開始后約十年出現(xiàn)。因此較早鑒定患者是癡呆研究的優(yōu)先考慮之一。

近來，研究者在血液中鑒定了一組可預(yù)測癡呆起始的血漿蛋白，并且已經(jīng)提出這些生物標(biāo)記可用于鑒定個體，用于發(fā)展新癡呆藥物的血液檢驗(yàn)/或試驗(yàn)。將452個健康人的血液中的蛋白質(zhì)與來自220個具有輕度認(rèn)知缺損的人和476個具有阿爾茨海默病的人的蛋白質(zhì)比較。由此，研究者能夠以87%準(zhǔn)確度告訴哪些具有輕度認(rèn)知缺損的患者將會繼續(xù)發(fā)展阿爾茨海默病。該結(jié)果將允許候選者的早期鑒定，從而增加未來臨床試驗(yàn)的成功機(jī)會。這些生物標(biāo)記還代表鑒定將最終發(fā)展為阿爾茨海默病的人以及因此可較早進(jìn)入臨床試驗(yàn)的人的潛在手段。早期治療將增加陽性藥物作用以及因此治療的潛能。

存在對改善的樣品儲存和檢測的需求，以促進(jìn)鑒定處于癡呆或發(fā)展阿爾茨海默病風(fēng)險中的人。

發(fā)明概述

本發(fā)明描述一種促進(jìn)生物標(biāo)記檢測和定量的新方法，其支持檢測與癡呆和阿爾茨海默病相關(guān)的生物標(biāo)記。將血液、血漿或其它相關(guān)生物樣品類型收集在固體載體上，將生物標(biāo)記例如蛋白質(zhì)、rna和dna穩(wěn)定并檢測。這些生物標(biāo)記在固體載體上保持穩(wěn)定，并且可在長期儲存后檢測。

在一個方面，提供用于檢測源自體液的一種或多種生物標(biāo)記的方法，包括對來自體液樣品的生物標(biāo)記進(jìn)行一種或多種測定，其中樣品先前保存在固體載體上；其中生物標(biāo)記的變化提供腦中生物學(xué)事件的指示。

在另一個方面，提供用于鑒定人處于癡呆或阿爾茨海默病風(fēng)險中的方法，包括：使用本發(fā)明某些方面的方法檢測一種或多種生物標(biāo)記；和基于檢測結(jié)果預(yù)測人是否處于癡呆或阿爾茨海默病風(fēng)險中。

在另一個方面，提供用于監(jiān)測人的癡呆或阿爾茨海默病發(fā)病或進(jìn)展的方法，包括：隨時間從人獲取并保存許多生物樣品到固體載體上；使用本發(fā)明某些方面的方法從一些保存樣品檢測一種或多種生物標(biāo)記；和基于檢測的生物標(biāo)記隨時間的變化預(yù)測癡呆或阿爾茨海默病的發(fā)病或進(jìn)展。

在另一個方面，提供用于評估潛在藥劑的有效性的方法，包括：隨時間從患有癡呆或阿爾茨海默病的人獲取并保存許多生物樣品到固體載體上，同時人使用潛在的藥劑治療；使用本發(fā)明某些方面的方法從一些保存樣品檢測一種或多種生物標(biāo)記；和預(yù)測所述藥劑是否有效治療患有癡呆或阿爾茨海默病的人。

本發(fā)明進(jìn)一步的細(xì)節(jié)和優(yōu)點(diǎn)將會從下列說明和權(quán)利要求顯現(xiàn)。

附圖簡述

圖1顯示模式蛋白(il-2)從固體載體的測量。

圖2顯示模式酶(dna酶)從固體載體的測量。

圖3顯示模式酶(rna酶)從固體載體的測量。

圖4顯示500bp基因組dna片段從用肝素處理并保存在不同固體載體上的人血液直接擴(kuò)增的結(jié)果。

圖5顯示1kb、3.8kb和7.5kb基因組dna擴(kuò)增子從用edta處理并保存在不同固體載體上的人血液直接pcr的結(jié)果。

圖6顯示在用edta處理并保存在903和fta基因卡(ftageneccard)樣品收集卡上的來自若干哺乳動物物種的血液上進(jìn)行的直接pcr的結(jié)果。

圖7顯示從wt和nos3缺失的基因敲除小鼠二者衍生的dna擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖8顯示來自若干組織源(藍(lán)/亮和紅/暗柱指不同的固體材料)的gadph的相對表達(dá)水平。

發(fā)明詳述

多種技術(shù)為基因組學(xué)和蛋白組學(xué)分析提供機(jī)會，其可用于評估血液和其它組織樣品中改變的基因和蛋白質(zhì)靶表達(dá)。將例如血液和/或腦脊液中的生物標(biāo)記收集/儲存在固體載體上，隨后可進(jìn)行簡單直接或穿孔(punch-in)技術(shù)，其中將固體載體上的樣品直接加入檢測試劑中并經(jīng)受生物標(biāo)記檢測方法，例如，但不限于，免疫測定和核酸擴(kuò)增/檢測技術(shù)，無需先前純化目的生物標(biāo)記或分析物。

本發(fā)明人已經(jīng)綜述了幾種基因組和蛋白質(zhì)組生物標(biāo)記和/或其它目的分析物對于其與腦中事件的關(guān)聯(lián)的重要性，并建議將這些標(biāo)記收集在固體載體例如whatman/gehealthcare提供的那些上。

因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測源自體液的一種或多種生物標(biāo)記的方法，所述方法包括對來自體液樣品的生物標(biāo)記進(jìn)行一種或多種測定，其中樣品先前保存在固體載體上；其中生物標(biāo)記的變化提供腦中生物學(xué)事件的指示。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種測定包括核酸分子測定，或基于蛋白質(zhì)的測定，或基于抗體的測定，或基于酶的測定。在某些實(shí)施方案中，所述變化可為生物標(biāo)記水平的增加或減少。變化也可為缺乏對照或正常個體中存在的生物標(biāo)記，反之亦然。變化也可為基因組水平的變化(即，單核苷酸多態(tài)性、插入、缺失或基因組水平的其它突變或多態(tài)性)。

在某些實(shí)施方案中，所述體液為血液或腦脊液。

科學(xué)文獻(xiàn)的搜索已經(jīng)鑒定約25種癡呆或阿爾茨海默病相關(guān)蛋白和核酸生物標(biāo)記。盡管這些生物標(biāo)記的表達(dá)可使用基于蛋白質(zhì)、抗體、酶或rna的基因表達(dá)測定檢測，但基因組突變可在dna水平檢測。與癡呆和阿爾茨海默病相關(guān)的生物標(biāo)記的列表在下表1中描述。

表1：與腦中某些生物學(xué)事件有關(guān)的生物標(biāo)記

用于檢測蛋白質(zhì)和核酸生物標(biāo)記的測定方法為已知的。這樣的測定可選自：使用rt-pcr、聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、定量pcr(qpcr)、等溫?cái)U(kuò)增、免疫-pcr、微陣列測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、免疫學(xué)技術(shù)、凝膠電泳(2de)、毛細(xì)管電泳(tofms)、高效液相色譜(hplc)、質(zhì)譜(ms)、火焰光度法、原子吸收分光光度法和可見光分光光度法的基因表達(dá)或蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析。

在某些實(shí)施方案中，樣品先前保存在固體載體上。生物樣品可簡單施加到固體載體并讓其在環(huán)境溫度下干燥用于保存。

在某些實(shí)施方案中，所述固體載體為纖維性的，例如纖維素纖維材料或玻璃纖維/微纖維材料。

在某些實(shí)施方案中，所述固體載體為多孔聚合物，例如多孔膜材料例如聚酯、聚醚砜(pes)、聚酰胺(nylon)、聚丙烯、聚四氟乙烯(ptfe)、聚碳酸酯、硝酸纖維素、醋酸纖維素、藻酸鹽或氧化鋁。

在某些其它實(shí)施方案中，載體表面用化學(xué)品浸漬，所述化學(xué)品包括：弱堿、螯合劑、陰離子表面活性劑和/或離液劑例如硫氰酸胍。

在某些其它實(shí)施方案中，所述固體載體為，但不限于，fta紙、fta洗脫紙、whatman903紙或藻酸鹽包覆的載體。

本文中fta(包括ftamicrocards、ftaindicating和ftaclassic)為用穩(wěn)定化學(xué)品，例如弱堿、螯合劑和陰離子表面活性劑處理的纖維素纖維紙，借此載體表面用穩(wěn)定化學(xué)品浸漬。以這種方式生物樣品材料可作為干燥物質(zhì)在固體載體上儲存許多月甚至許多年，從而允許在環(huán)境溫度下轉(zhuǎn)運(yùn)固體載體(若需要)至實(shí)驗(yàn)室的時間。然后簡單回收是可能的，通過例如從固體載體純化生物樣品材料?；蛘撸瑯悠房墒褂弥苯踊蛳礈斓拇┛追桨柑幚?。將樣品儲存在固體載體上還使得能夠通過按照需要移除部分樣品并檢驗(yàn)該部分，隨時間再檢驗(yàn)樣品。

fta洗脫(ftaelute)在本文中描述相似的紙，但用離液劑例如硫氰酸胍包覆。在本文中whatman903描述未包覆的纖維素纖維紙。

wo2012113911、wo2012113907、wo2012113906和wo2013165870中描述了某些固體載體，其各自的公開內(nèi)容通過引用以其整體結(jié)合。

上文描述的固體載體意在以總體平坦配置使用，但替代地，可例如在卷形物(roll)上使用。

在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種測定從自包含樣品的固體載體切除的穿孔物(punch)直接進(jìn)行。因此，所述測定可從穿孔物直接進(jìn)行，所述穿孔物自生物樣品(即，血液)已經(jīng)施加于其上的固體載體切除。包含樣品的穿孔物可直接加入測定反應(yīng)中。任選地，可進(jìn)行簡單“穿孔(punch-ins)”加入，其中在加入反應(yīng)前，將切除的穿孔物(固體載體加樣品)洗滌以去除任何潛在的抑制性化學(xué)品。

在某些實(shí)施方案中，將生物標(biāo)記從固體載體分離和/或純化，然后檢測。用于從干燥在固體載體上的樣品純化蛋白質(zhì)和核酸分子的方法為已知的。

在一些實(shí)施方案，可測定超過一種生物標(biāo)記。例如，可檢測2、3、4或5種生物標(biāo)記以評估腦中的目的生物學(xué)事件。在一些實(shí)施方案中，可檢測表1中的所有生物標(biāo)記以評估目的生物學(xué)事件。生物標(biāo)記可使用不同的測定檢測，包括上文對于蛋白質(zhì)和核酸生物標(biāo)記的檢測所描述的那些方法。

在某些實(shí)施方案中，測定可為多重的。因此，超過一種生物標(biāo)記可在單個反應(yīng)中檢測。

在某些實(shí)施方案中，一種或多種測定使用凍干試劑進(jìn)行。凍干試劑例如gehealthcare’sillustraready-to-go(rtg)產(chǎn)品為眾所周知的。這些試劑可包含引物以分析特定的核酸例如rna、dna等，或包含抗體以檢測特定的目的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記。

在某些實(shí)施方案中，一種或多種測定在環(huán)糊精存在下進(jìn)行。環(huán)糊精用作包覆在某些固體載體外部的洗滌劑的螯合劑，因此可進(jìn)行改善的dna擴(kuò)增測定，包括直接擴(kuò)增測定。

在某些實(shí)施方案中，生物標(biāo)記在檢測后定量。

在某些實(shí)施方案中，樣品先前保存在固體載體上并室溫儲存。保存在固體載體上的生物樣品可穩(wěn)定很長一段時間，參見，例如，gehealthcarelifesciencesapplicationnote29-0082-33aa。

在某些方面，提供用于鑒定人處于癡呆或阿爾茨海默病風(fēng)險中的方法，包括：通過本發(fā)明某些實(shí)施方案的方法檢測一種或多種生物標(biāo)記；和基于檢測結(jié)果預(yù)測人是否處于癡呆或阿爾茨海默病風(fēng)險中。在某些實(shí)施方案中，將檢測結(jié)果與來自有或無癡呆或阿爾茨海默病風(fēng)險的人的對照比較。

在某些方面，提供用于監(jiān)測人的癡呆或阿爾茨海默病發(fā)病或進(jìn)展的方法。所述方法包括隨時間從人獲取并保存許多生物樣品到固體載體上；根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案從一些保存樣品檢測一種或多種生物標(biāo)記；和基于檢測的生物標(biāo)記隨時間的變化預(yù)測癡呆或阿爾茨海默病的發(fā)病或進(jìn)展。

在某些實(shí)施方案中，檢測步驟使用一些保存樣品的部分進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，檢測步驟隨時間使用保存樣品的部分重復(fù)。

在某些實(shí)施方案中，用于監(jiān)測人的癡呆或阿爾茨海默病發(fā)病或進(jìn)展的方法進(jìn)一步包括比較檢測的生物標(biāo)記結(jié)果與來自有或無癡呆或阿爾茨海默病風(fēng)險的人的對照。

在某些方面，提供用于評估潛在藥劑的有效性的方法。所述方法包括隨時間從患有癡呆或阿爾茨海默病的人獲取并保存許多生物樣品到固體載體上，同時人使用潛在的藥劑治療；根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案從一些保存樣品檢測一種或多種生物標(biāo)記；和預(yù)測所述藥劑是否有效治療患有癡呆或阿爾茨海默病的人。

在某些實(shí)施方案中，檢測步驟使用一些保存樣品的部分進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，檢測步驟隨時間使用保存樣品的部分重復(fù)。

在某些實(shí)施方案中，用于評估潛在藥劑的有效性的方法進(jìn)一步包括比較檢測結(jié)果與來自有或無癡呆或阿爾茨海默病的人的對照。

實(shí)施例：

下列實(shí)施例僅意在說明本發(fā)明的方法和實(shí)施方案，并且因此不應(yīng)解釋為給權(quán)利要求強(qiáng)加限制。

實(shí)施例1：從固體載體直接測量白介素

使重組il-2±載體(r&dsystems;分別為cat.202-il-cf-10μg;批次ae4309112和cat.202-il-10μg;批次ae4309081)以50pg或100pg/μl溶于血液(tcsbiosciences)。將等分試樣(1μl，包含50(b)或100(a)pgil-2)施加到gehealthcare903濾紙。

使這些樣品在環(huán)境溫度和濕度干燥過夜。使用適當(dāng)大小的打孔器(punch)，從各紙類型提取出3mm直徑的穿孔圓盤(puncheddisk)。利用來自完全配置的il-2quantikineelisa試劑盒(r&dsystems,cat.d2050,批次273275)的試劑直接分析單個圓盤的il-2。直接測定以“在孔中的穿孔物(punchinwell)”進(jìn)行，即，在此穿孔出部分903濾紙，并沉積在常規(guī)多孔板的反應(yīng)孔中。

在完成測定時，在450nm監(jiān)測光密度。通過將值與已知il-2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較而測定il-2的回收?；厥章曙@示于圖1中，表明可回收有效量的蛋白質(zhì)，然后使蛋白質(zhì)沉積到固體載體上。

表2：當(dāng)前可用的基于elisa的試劑盒

表1中的許多生物標(biāo)記可使用市售可得的elisa試劑盒檢測，如表2中說明的。

因此，來自生物樣品例如血液或腦脊液的蛋白質(zhì)在固體載體上穩(wěn)定并且可使用現(xiàn)有蛋白質(zhì)檢測方法檢測和定量。

實(shí)施例2：從轉(zhuǎn)移至固體載體的細(xì)胞或酶的模式酶檢測

根據(jù)制造商說明書，利用完全配置dna酶和rna酶contamination試劑盒(dnase&rnaasealertqcsystems,目錄編號am1970&am1966,lifetechnologies)，進(jìn)行蛋白質(zhì)和酶檢驗(yàn)。

a.雙脫氧核糖核酸酶(dna酶)

在第一系列試驗(yàn)中，將0.125-0.5udna酶以10μl體積施加到fta和903紙。如下概括的測量dna酶和rna酶活性(數(shù)據(jù)未顯示)。

在第二系列試驗(yàn)中，從已如上以10μl體積施加到fta和903紙的10⁶個人胚胎干細(xì)胞(gehealthcare;細(xì)胞系ref:wcb307gehc28)取1.2mm穿孔物(punch)。如下概括的測量dna酶和rna酶活性。

在第三系列試驗(yàn)中，從已以10μl體積施加到fta和903紙的10⁶個人胚胎干細(xì)胞(gehealthcare;細(xì)胞系ref:wcb307gehc28)(包含加到這些細(xì)胞的0.5udna酶或10μurna酶)取1.2mm穿孔物。

使用可裂解熒光標(biāo)記dna酶底物，如下進(jìn)行dna酶活性檢測。將各穿孔物彈射到96孔板的單獨(dú)孔。使經(jīng)凍干dna酶alert底物溶于te緩沖液(1ml)，并分配(10μl)到96孔板的檢驗(yàn)孔。加入10xdna酶alert緩沖液(10μl)和無核酸酶的水(80μl)，并在37℃孵育檢驗(yàn)溶液(100μl)60分鐘。dna酶alertqcsystem底物為在由dna酶裂解時發(fā)射粉紅色熒光的經(jīng)修飾dna寡核苷酸。對于此測定，熒光在tecanultra(激發(fā)/發(fā)射535/595nm，使用介質(zhì)增益)上測量。包含dna酶活性的溶液產(chǎn)生粉紅色熒光，而沒有dna酶活性的溶液不發(fā)熒光。因此，較高水平dna酶相當(dāng)于光輸出量增加。陰性對照由無核酸酶的水(80μl)代替樣品組成?？捎?03或fta紙作為固體載體，以速率依賴性方式檢測和定量dna酶活性。圖2表明可在fta化學(xué)處理的濾紙(fta)和903未處理的濾紙(903)上實(shí)現(xiàn)dna酶和酶活性的恢復(fù)。

b.核糖核酸酶(rna酶)

使用可裂解熒光標(biāo)記的rna酶底物，如下進(jìn)行rna酶檢測。將各穿孔物彈射到96孔板的單獨(dú)孔。使經(jīng)凍干rna酶alert底物溶于te緩沖液(1ml)，并分配(10μl)到96孔板的檢驗(yàn)孔。加入10xrna酶alert緩沖液(10μl)和無核酸酶的水(80μl)，并在37℃孵育檢驗(yàn)溶液(100μl)60分鐘。rna酶alertqcsystem底物為在由rna酶裂解時發(fā)射綠色熒光的經(jīng)修飾rna寡核苷酸。對于此測定，熒光在tecanultra(激發(fā)/發(fā)射485/535nm，使用介質(zhì)增益)上測量。包含rna酶的溶液產(chǎn)生綠色熒光，而沒有rna酶活性的溶液不發(fā)熒光。因此，較高水平rna酶相當(dāng)于光輸出量增加。陰性對照由無核酸酶的水(80μl)代替樣品組成。rna酶活性可使用903或fta紙以速率依賴性方式檢測和定量(圖3)。

因此，來自生物樣品的酶可在固體載體上干燥并保持穩(wěn)定。酶活性的檢測和酶的定量可使用現(xiàn)有方法進(jìn)行。

實(shí)施例3：從保存在whatmanfta和903卡上的血液直接pcr

thermoscientificphusion血液直接pcr試劑盒顯示支持直接從儲存在一系列固體載體上的血液樣品擴(kuò)增dna，固體載體包括whatman903、fta和fta洗脫卡(chum和andre2013;thermofisherscientific)。fta和fta洗脫卡為基于化學(xué)品包覆紙的卡的實(shí)例，而903卡未化學(xué)包覆。在直接擴(kuò)增工作流程中，不需要先前的dna提取或純化步驟，并且僅將卡加入pcr反應(yīng)混合物中。

樣品制備：按照制造商的說明書將新鮮血液或用肝素(1.4iu/ml)、k2edta(1.8mg/ml)或檸檬酸鈉(109mm)保存的血液施加到whatman903卡、fta洗脫卡或fta基因卡并干燥。對于直接pcr，從卡中的樣品穿孔出1mm直徑圓盤，并以下列pcr反應(yīng)體積使用：whatman903：10-50μl，fta洗脫卡：25-50μl和fta基因卡：50μl。

當(dāng)使用更大的穿孔物或更小的反應(yīng)體積時，將穿孔物用20μl水在50℃洗滌3分鐘。去除水之后，將pcr組分直接加至漂洗過的穿孔物。使用的參數(shù)和試劑在下表3、4和5中列出。

表3.pcr反應(yīng)混合物

表4.pcr熱循環(huán)方案。當(dāng)引物tm值為69-72℃時使用2步方案

表5.用于擴(kuò)增示例性目的基因的引物

圖4顯示從用肝素處理的和保存在不同卡上的人血直接擴(kuò)增500bp基因組dna片段的結(jié)果。反應(yīng)自漂洗或直接放入50、25或10μl體積pcr反應(yīng)中的1mm穿孔物進(jìn)行。使用材料和方法中描述的2步pcr方案。

圖5顯示1kb、3.8kb和7.5kbgdna擴(kuò)增子從用edta處理并保存在不同卡上的人血液直接pcr的結(jié)果。反應(yīng)在50μl反應(yīng)中從1mm穿孔物進(jìn)行(對于7.5kb片段，將fta基因卡穿孔物通過用于水漂洗洗滌。對于1kb和7.5kb片段使用2步方案，對于3.8kb擴(kuò)增子使用3步方案。

圖6顯示在用edta處理并保存在903和fta基因卡上的來自若干哺乳動物物種的血液上進(jìn)行的直接pcr的結(jié)果。反應(yīng)使用phusion血液直接pcr試劑盒中包含的通用對照引物和20μl反應(yīng)體積從1mm穿孔物進(jìn)行(將fta基因卡漂洗)。m大小標(biāo)記,-陰性對照，+陽性對照(純化的人基因組dna)。

pcr研究證實(shí)dna可從儲存在不同濾紙卡上的血液直接擴(kuò)增。

從903卡衍生的樣品幾乎不顯示抑制，并且1mm穿孔物可以以低至10μl的反應(yīng)體積使用。fta洗脫和fta卡顯示不同水平的抑制。fta洗脫略微抑制直接pcr反應(yīng)；1mm圓盤在25-50μl反應(yīng)中良好起作用，但當(dāng)放置入10μl反應(yīng)中時，pcr受到完全抑制。fta基因卡顯示最大水平的抑制。無任何預(yù)處理，fta基因卡的1mm穿孔物僅在50μl反應(yīng)體積中良好起作用。對于較小的反應(yīng)體積，非常簡單的洗滌方案足以從fta洗脫和fta基因卡二者去除抑制劑。用水洗滌卡穿孔物3分鐘后，樣品具有足夠純度以用于直接pcr反應(yīng)，其采用phusion血液直接pcr試劑盒以所檢驗(yàn)的所有反應(yīng)體積進(jìn)行。

將來自903卡的穿孔物和來自fta洗脫和fta基因卡的漂洗的穿孔物(均為1mm直徑)用于具有對1kb、3.8kb和7.5kb擴(kuò)增子特異的引物的50μl反應(yīng)體積中。在所有情況下，pcr反應(yīng)產(chǎn)生適當(dāng)大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。

phusion血液直接pcr試劑盒與來自多個物種的血液兼容。sox21基因上游的高度保守的237bp區(qū)域(a.woolfe,m.goodson,plosbiol.3,e7;2004)成功從干燥在903和fta基因卡上的許多脊椎動物物種的血液擴(kuò)增。

實(shí)施例4：使用施加到固體載體材料上的生物樣品基因分型

許多癌癥與基因重排有關(guān)。尤因肉瘤斷裂點(diǎn)區(qū)1(ewsr1)在許多肉瘤中易位。最近，其重排已經(jīng)在唾液腺透明樣化透明細(xì)胞癌中描述(shahaa等人2013amjsurgpathol.37:571-8ewsr1geneticrearrangementsinsalivaryglandtumors:aspecificandverycommonfeatureofhyalinizingclearcellcarcinoma(唾液腺腫瘤中的ewsr1基因重排：透明樣化透明細(xì)胞癌的特異性的和非常常見的特征))。本研究說明本文獻(xiàn)中所述固體載體材料和想法對潛在地篩查復(fù)雜的哺乳動物基因組中的這種基因重排的潛能。

dna樣品收集、儲存和檢測

將來自c57bl/6小鼠和nos3缺失小鼠(129/b6背景)的鼠組織施加到一系列基于不同紙的固體載體上。將小鼠安樂死并解剖以收集器官(血液、心臟、腦、肺、肝和腎)。將器官“夾”在兩個紙層之間。壓力經(jīng)由無菌吸移管施加以將組織包埋在每一纖維素基質(zhì)中。對于組織勻漿，將大約5mg組織使用塑料杜恩斯勻漿器在1.5ml微量離心管中處理，然后施加到適當(dāng)?shù)募埢|(zhì)。施加后讓所有樣品空氣干燥2小時，然后儲存在具有干燥劑的密封小袋中。在一些情況下樣品在處理前儲存多達(dá)2月。

dna基因分型和定量

使用harris一次性微型打孔器(1.2mm或3mm直徑)分別從紙卡以穿孔圓盤的形式切除干燥的組織樣品。將樣品圓盤從干燥樣品的中心切除并放置在潔凈的無dna酶的1.5ml微量離心管中。

nos3缺失或基因敲除小鼠通過用內(nèi)皮一氧化氮合酶(enos)外顯子10-特異性正向引物(5’-atttcctgtcccctgccttg–3’)、enosneo特異性正向引物(5’-ttgctacccgtgatattgct-3’)和enos外顯子12-特異性反向引物(5’-ggccagtctcagagccatac-3’)pcr擴(kuò)增基因組dna鑒定。

靶dna使用mjresearch熱循環(huán)儀，用最初10min變性步驟接著94℃35sec，65℃1min和72℃1min36個循環(huán)，接著最后72℃延伸5min擴(kuò)增。所得的pcr產(chǎn)物使用experion毛細(xì)管電泳系統(tǒng)可視化。小鼠dna定量使用用于小鼠樣品的primerdesign基因組dna定量試劑盒(gdna-mo-q-dd)按照制造商的說明書實(shí)現(xiàn)。將個體野生型(wt)和nos3缺失的組織樣品分開施加到不同的紙卡。為了例示從儲存在紙基質(zhì)上的dna區(qū)分基因型變異體的能力，某一區(qū)域的pcr擴(kuò)增在wt和轉(zhuǎn)基因(nos3缺失，基因敲除)小鼠上進(jìn)行。

圖7顯示pcr擴(kuò)增子，其與nos基因座有關(guān)，使用從來自紙卡的組織分離的dna作為擴(kuò)增模板。泳道1-5為從wt小鼠組織(分別心臟、肝、腦、肺和腎)分離的dna。泳道6-10為從nos小鼠組織(分別心臟、肝、腦、肺和腎)擴(kuò)增的dna。

表6：從儲存在各種固體載體材料上的組織分離的dna的擴(kuò)增的概述(nd=未測定)

在表6中，記錄了從儲存在各種固體載體材料上的組織分離的dna的成功擴(kuò)增。dna從1.2mm穿孔物分離?！?”表示存在擴(kuò)增子。

圖7和表6(上方)顯示分別從wt和nos3缺失基因敲除小鼠二者衍生的dna擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明對于兩種樣品源，正確大小的dna擴(kuò)增子從自施加到固體紙載體基質(zhì)的所有器官/組織源分離的dna產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)表明1.2mmharris微型打孔器可從存儲在固體紙載體上的組織切除足夠的dna以區(qū)分兩種遺傳變異體。

實(shí)施例5.rna收集、純化和定量

如所述的，將組織樣品施加到固體載體紙卡，切除樣品穿孔物，并如下所述用gehealthcareillustra?rnaspin試劑盒分離rna。利用市售mrna定量試劑盒，在abi7900實(shí)時pcr系統(tǒng)上進(jìn)行rna定量。

使用harris3mm一次性微型打孔器，從經(jīng)干燥樣品點(diǎn)的中心切除穿孔物，并放入潔凈無rna酶的1.5ml微量離心管。使illustra緩沖液ra1(350μl)與3.5μlβ-巰基乙醇混合，并將溶液加到圓盤。用20號針將圓盤勻漿化。將所得勻漿轉(zhuǎn)移到rnaspinmini過濾柱，用于隨后去除殘余物質(zhì)。使柱在11,000xg離心1min，并棄去rnaspinmini濾器。勻漿化的裂解液包含rna，將此濾液轉(zhuǎn)移到新的無rna酶的1.5ml微量離心管。

將乙醇(70%;350μl)加到勻漿化的裂解液，并通過渦旋2x5sec脈沖而混合。對于各制備，將裂解液上下吸移2–3次，并施加到放入2ml微量離心管的rnamini-離心柱。使管在8000xg離心30sec，棄去穿流物(flowthrough)。將rna離心柱轉(zhuǎn)移到新收集管。

加入illustramdb緩沖液(350μl)，使管在11000xg離心1min。再一次棄去穿流物，將柱返回到收集管。根據(jù)制造商說明書制備dna酶反應(yīng)混合物，并加到在rna離心柱內(nèi)包含的濾器的表面。在室溫進(jìn)行這種dna酶孵育15min。

將洗滌緩沖液ra2(200μl)施加到rnamini-離心柱，并使柱在11000xg離心1min。再一次棄去穿流物，將柱返回到收集管。

將緩沖液ra3600μl施加到rnamini-離心柱，并使柱在11000xg離心1min，棄去穿流物，將柱返回到收集管。也用緩沖液ra3(250μl)進(jìn)行另外的柱洗滌。為了使膜完全干燥，使柱在11000xg離心2min，最后將柱放入無核酸酶的1.5ml微量離心管。

將無rna酶的水(40μl)施加到柱，使柱在11000xg離心1min。經(jīng)純化rna在下游應(yīng)用立即使用，或在-80℃儲存直至使用。

為了確定在長期儲存后來自多種組織的rna的完整性，對從紙卡上儲存的小鼠組織樣品分離的rna進(jìn)行實(shí)時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)。這些在干燥劑存在下儲存2個月。mrna定量根據(jù)制造商說明書進(jìn)行，使用i)abitaqman嚙齒動物gapdh對照試劑盒(part#4308313)，ii)invitrogen實(shí)時luxmrna引物組，用于鼠hprt、gapdh和β-肌動蛋白基因(分別為cat.105m-02、100m-02和101m-02)，或iii)組織特異基因引物組，來自appliedbio-systems。

圖8顯示使用abitaqman嚙齒動物gapdh對照試劑盒，來自數(shù)種組織源的gadph的相對表達(dá)水平。通過與從小鼠rna標(biāo)準(zhǔn)樣品的定量滴定曲線產(chǎn)生的已知值比較，測定從施加兩種不同固體載體卡的樣品得到的rna水平。從兩種紙類型分離的rna檢測到可比gapdhrna水平。

編碼hprt、gapdh和β-肌動蛋白的鼠mrna的絕對定量用適當(dāng)?shù)膇nvitrogen實(shí)時lux引物組進(jìn)行。通過與從小鼠rna標(biāo)準(zhǔn)樣品的定量滴定曲線產(chǎn)生的已知值比較，測定從施加兩種不同固體載體卡的樣品得到的rna水平。與rna分離相關(guān)的數(shù)據(jù)在圖8中描述，并且證明載體材料能夠支持儲存和穩(wěn)定化來自多個組織類型的rna。

盡管已經(jīng)顯示和描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員將會顯而易見的是，可做出變化和修飾而不脫離本發(fā)明的教導(dǎo)。前述說明和附圖中闡述的情況僅經(jīng)由舉例的方式提供，而非作為限制。本發(fā)明的實(shí)際范圍意在當(dāng)基于現(xiàn)有技術(shù)以適當(dāng)?shù)慕嵌瓤创龝r在所附權(quán)利要求中定義。