本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域和生物化學(xué)領(lǐng)域，是一種基于氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行血清樣本中葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物分析的方法。

背景技術(shù)：

葡萄糖是糖在血液中的運(yùn)輸形式，在機(jī)體糖代謝中占據(jù)主要地位，是維持生命活動(dòng)的重要物質(zhì)。葡萄糖通過(guò)糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)楸岵a(chǎn)生能量，丙酮酸在有氧條件下經(jīng)過(guò)三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化徹底氧化形成CO₂和H₂O，產(chǎn)生大量自由能；而在無(wú)氧條件下則轉(zhuǎn)化為乳酸。葡萄糖經(jīng)糖酵解到徹底氧化不僅為機(jī)體提供大量自由能，而且為一些物質(zhì)合成提供前體物質(zhì)，其代謝異常與癌癥、心血管疾病、代謝綜合征、糖尿病等多種疾病密切相關(guān)。因此建立簡(jiǎn)單、穩(wěn)健、高靈敏的葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物的分析方法將為與其代謝相關(guān)的生理和病理研究提供幫助。

葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物在血中濃度差異非常大，根據(jù)HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hmdb.ca/)中給出的濃度含量范圍，相關(guān)代謝物的濃度最大相差4個(gè)數(shù)量級(jí)，對(duì)其分析造成了很大困難。近年來(lái)出現(xiàn)多種技術(shù)用于葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物的分析。Luo等報(bào)道了基于液質(zhì)聯(lián)用的靶向分析方法，但存在靈敏度及覆蓋度等問(wèn)題；Ye等報(bào)道了基于氣質(zhì)聯(lián)用的擬靶向方法，存在覆蓋度的問(wèn)題。在定量分析方面，通常對(duì)葡萄糖和三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物進(jìn)行分別分析。葡萄糖的測(cè)定主要有酶法、電化學(xué)法、光化學(xué)法等；三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的定量分析多用氣質(zhì)聯(lián)用的方法，如Calderón-Santiago等采用氯仿甲醇水雙相提取，選擇離子掃描模式檢測(cè)，但存在提取復(fù)雜、溶劑毒性大等問(wèn)題。氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，作為靶向分析強(qiáng)有力的工具，通過(guò)氣相色譜分離結(jié)合兩級(jí)質(zhì)譜的選擇離子掃描，最大限度地排除基質(zhì)干擾，具有靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)；且尚未見基于氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式分析葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有方法的不足，建立了氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物的分析方法,可一次進(jìn)樣分析得到血清中葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物的含量，用于相關(guān)疾病代謝的研究，為了解機(jī)體的生理過(guò)程及疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制等提供依據(jù)。該方法具有前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明采用的技術(shù)路線如下：

(1)將-80℃保存的血清樣本解凍，渦旋10s，準(zhǔn)確移取50μL，加入含內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液200μL，渦旋1min。甲醇溶液中內(nèi)標(biāo)濃度分別為：乳酸-3,3,3-d₃(100μg/mL)，琥珀酸-2,2,3,3-d₄(0.2μg/mL)，富馬酸-2,3-d₂(0.1μg/mL)，檸檬酸-2,2,4,4-d₄(5μg/mL)，葡萄糖-¹³C₆,1,2,3,4,5,6,6-d₇(150μg/mL)。4℃下14000rpm離心15min，取200μL上清溶液冷凍干燥。

(2)于凍干血清樣本中加入50μL甲氧胺溶液(20mg.ml，吡啶)，渦旋30s，超聲1min，37℃水浴中反應(yīng)1.5h；待反應(yīng)結(jié)束，加入40μLN-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，渦旋10s，37℃水浴中反應(yīng)1h；反應(yīng)完成后，4℃下14000rpm離心10min，取上清溶液用于分析。

(3)氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀器用于樣本分析。

氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm,Agilent Technologies,USA)。柱溫采用程序升溫，70℃保持1min，5℃/min升至190℃，15℃/min升至310℃，后平衡5min。進(jìn)樣口溫度300℃，進(jìn)樣體積1μL，分流比1:5。氦氣(99.9995％,China)作為載氣，流速1.2mL/min，恒流模式；

質(zhì)譜條件：EI源，-70eV，傳輸線和離子源溫度分別是280℃和230℃。溶劑延遲時(shí)間5.5min。碰撞氣為氮?dú)?，流?.5mL/min；淬滅氣為氦氣，流速為2.25mL/min。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，對(duì)于低含量代謝物，選擇豐度高的母離子，對(duì)其進(jìn)行子離子掃描并優(yōu)化碰撞能，選擇S/N最大且特異性好的離子對(duì)作為定量離子對(duì)，并輔以定性離子對(duì)；對(duì)于高含量代謝物(乳酸、葡萄糖)，選擇豐度低的母離子，子離子掃描并優(yōu)化碰撞能，選擇低豐度的離子對(duì)作為定量離子對(duì)，并輔以定性離子對(duì)。附表1為優(yōu)化后得到的代謝物定量離子對(duì)、定性離子對(duì)，及其相應(yīng)的碰撞能信息。

(4)質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Masshunter Quantitative Analysis Software導(dǎo)出，采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)代謝物進(jìn)行定量分析。

本方法采用甲醇一步提取，相對(duì)于氯仿甲醇水雙相提取，該方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、且溶劑毒性??；并采用氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)，抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高，對(duì)于低含量代謝物檢測(cè)限在0.17-2.13ng/mL；通過(guò)離子對(duì)選擇及碰撞能優(yōu)化，可以實(shí)現(xiàn)高低含量代謝物同時(shí)檢測(cè)分析。

附圖說(shuō)明

圖1為正常人血清樣本中葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物和內(nèi)標(biāo)的總離子流圖。

圖2為正常人血清樣本中葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物和內(nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)提取流圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明：實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例一

基于氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)血清樣本中葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物方法的評(píng)價(jià)

參考HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hmdb.ca/)，如不同年齡人群血糖含量范圍在1100-16440μM，即198.2-2961.8μg/mL。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中代謝物的參考濃度范圍配制混標(biāo)溶液，濃度分別為丙酮酸(800.0μg/mL)，乳酸(4000μg/mL)，琥珀酸(800.0μg/mL)，富馬酸(800.0μg/mL)，蘋果酸(800.0μg/mL)，2-羥基戊二酸(800.0μg/mL)，2-酮戊二酸(800.0μg/mL)，烏頭酸(800.0μg/mL)，檸檬酸(800.0μg/mL)，異檸檬酸(800.0μg/mL)，葡萄糖(4000μg/mL)，用純水將混標(biāo)溶液分別稀釋1.33倍、1.6倍、2.67倍、4倍、8倍、40倍、80倍、400倍、800倍、4000倍、8000倍、20000倍、40000倍、100000倍、200000倍、500000倍、1000000倍、2500000倍得到不同濃度的混標(biāo)溶液。取不同濃度的混標(biāo)溶液各50μL，分別加入200μL含內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液，渦旋1min；甲醇溶液中內(nèi)標(biāo)濃度分別為：乳酸-3,3,3-d₃(100μg/mL)，琥珀酸-2,2,3,3-d₄(0.2μg/mL)，富馬酸-2,3-d₂(0.1μg/mL)，檸檬酸 -2,2,4,4-d₄(5μg/mL)，葡萄糖-¹³C₆,1,2,3,4,5,6,6-d₇(150μg/mL)。4℃下14000rpm離心15min，取200μL上清溶液冷凍干燥。

于凍干樣本中加入50μL甲氧胺溶液(20mg/ml吡啶)，渦旋30s，超聲1min，37℃水浴中反應(yīng)1.5h；待反應(yīng)結(jié)束，加入40μL N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，渦旋10s，37℃水浴中反應(yīng)1h；反應(yīng)完成后，4℃下14000rpm離心10min，取上清溶液用于氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀器分析。

氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm,Agilent Technologies,USA)；柱溫采用程序升溫，70℃保持1min，5℃/min升至190℃，15℃/min升至310℃，后平衡5min；進(jìn)樣口溫度300℃，進(jìn)樣體積1μL，分流比1:5；氦氣(99.9995％,China)作為載氣，流速1.2mL/min，恒流模式。質(zhì)譜條件：EI源，-70eV，傳輸線和離子源溫度分別是280℃和230℃。溶劑延遲時(shí)間5.5min；碰撞氣為氮?dú)猓魉?.5mL/min；淬滅氣為氦氣，流速為2.25mL/min。

對(duì)于含量低于或等于100μg/mL的代謝物，挑選響應(yīng)較高的候選母離子在不同碰撞能條件下(CE＝0-35V)進(jìn)行子離子掃描，選擇信噪比最高的離子對(duì)作為定量離子對(duì)；而對(duì)于含量高于100μg/mL的代謝物，挑選響應(yīng)較低的候選母離子在不同碰撞能條件下(CE＝0-35V)進(jìn)行子離子掃描，選擇線性范圍寬的離子對(duì)作為定量離子對(duì)，最終得到11種代謝物及其5種內(nèi)標(biāo)的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)，及其相應(yīng)的碰撞能信息見附表1。根據(jù)附表1確定的質(zhì)譜條件采用不同濃度的混標(biāo)溶液進(jìn)行方法的線性分析，得到代謝物的線性范圍及線性相關(guān)系數(shù)R²見附表1，均滿足分析要求。

考察了方法的回收率，將-80℃保存的血清樣本解凍，渦旋10s，分別準(zhǔn)確移取50μL血清樣本進(jìn)行空白和加標(biāo)回收率分析?？瞻讓?duì)照樣本采用血清加入甲醇10μL，加標(biāo)回收率樣本則在血清樣本中分別加入低、中、高濃度混標(biāo)溶液10μL，上述溶液再加入含內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液190μL，渦旋1min，考察低、中、高濃度加標(biāo)回收率?？瞻缀图訕?biāo)回收率均重復(fù)6次。中濃度混標(biāo)溶液濃度分別為：丙酮酸(17.5μg/mL)，乳酸(1100μg/mL)，琥珀酸(4.0μg/mL)，富馬酸(1.25μg/mL)，蘋果酸(3.0μg/mL)，2-羥基戊二酸(1.75μg/mL)，2-酮戊二酸(15.0μg/mL)，烏頭酸(1.75μg/mL)，檸檬酸 (80.0μg/mL)，異檸檬酸(2.5μg/mL)，葡萄糖(2000μg/mL)；低、高濃度混標(biāo)溶液的濃度分別是中濃度混標(biāo)溶液濃度的0.8倍、1.2倍。甲醇溶液中內(nèi)標(biāo)濃度分別為：乳酸-3,3,3-d₃(100μg/mL)，琥珀酸-2,2,3,3-d₄(0.2μg/mL)，富馬酸-2,3-d₂(0.1μg/mL)，檸檬酸-2,2,4,4-d₄(5μg/mL)，葡萄糖-¹³C₆,1,2,3,4,5,6,6-d₇(150μg/mL)。4℃下14000rpm離心15min，取200μL上清溶液冷凍干燥。衍生后經(jīng)過(guò)分析及計(jì)算，在低、中、高濃度的加標(biāo)回收率均在78.1-112.5％，滿足分析要求；且空白、低、中、高加標(biāo)樣品各平行6份的RSD均在10％以內(nèi)，重復(fù)性好。

將中濃度混標(biāo)溶液分別稀釋50倍、100倍、500倍、1000倍、10000倍、50000倍，各取50μL加入200μL甲醇，渦旋混勻后取200μL溶液凍干，然后衍生分析；在低濃度條件下以S/N＝3得到低含量代謝物的檢測(cè)限在0.17-2.13ng/mL范圍內(nèi)(除了乳酸、葡萄糖)見附表1，除了烏頭酸與文獻(xiàn)報(bào)道的基于氣質(zhì)聯(lián)用的選擇離子監(jiān)測(cè)方法的靈敏度相當(dāng)，其余低含量代謝物的靈敏度提高了3.7-58.3倍。

實(shí)施例二

正常人血清樣本葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物檢測(cè)

將-80℃保存的正常人血清樣本解凍，渦旋10s，準(zhǔn)確移取50μL，加入含內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液200μL，渦旋1min。甲醇溶液中內(nèi)標(biāo)濃度分別為：乳酸-3,3,3-d₃(100μg/mL)，琥珀酸-2,2,3,3-d₄(0.2μg/mL)，富馬酸-2,3-d₂(0.1μg/mL)，檸檬酸-2,2,4,4-d₄(5μg/mL)，葡萄糖-¹³C₆,1,2,3,4,5,6,6-d₇(150μg/mL)。4℃下14000rpm離心15min，取200μL上清溶液冷凍干燥。于凍干樣本中加入50μL甲氧胺溶液(20mg.ml，吡啶)，渦旋30s，超聲1min，37℃水浴中反應(yīng)1.5h；待反應(yīng)結(jié)束，加入40μL N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，渦旋10s，37℃水浴中反應(yīng)1h；反應(yīng)完成后，4℃下14000rpm離心10min，取上清進(jìn)行氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀器分析。

氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm,Agilent Technologies,USA)。柱溫采用程序升溫，70℃保持1min，5℃/min升至190℃，15℃/min升至310℃，后平衡5min。進(jìn)樣口溫度300℃，進(jìn)樣體積1μL，分流比1:5。氦氣(99.9995％,China)作為載氣，流速1.2mL/min， 恒流模式。質(zhì)譜條件：EI源，-70eV，傳輸線和離子源溫度分別是280℃和230℃。溶劑延遲時(shí)間5.5min。碰撞氣為氮?dú)猓魉?.5mL/min；淬滅氣為氦氣，流速為2.25mL/min。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。

采用上述分析方法，得到正常人血清樣本中葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物和內(nèi)標(biāo)的總離子流圖見圖1及提取離子流圖見圖2。采用內(nèi)標(biāo)法定量，正常人血清樣本中葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物的含量分別如下：丙酮酸約0.92μg/mL，乳酸約149.67μg/mL，琥珀酸約0.20μg/mL，富馬酸約0.08μg/mL，蘋果酸約0.36μg/mL，2-羥基戊二酸約0.08μg/mL，2-酮戊二酸約0.07μg/mL，烏頭酸約0.15μg/mL，檸檬酸約12.99μg/mL，異檸檬酸約0.37μg/mL，葡萄糖約737.91μg/mL。

發(fā)明效果：

本發(fā)明采用甲醇單相提取，結(jié)合三重四級(jí)桿多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物的高靈敏檢測(cè)分析。與現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道的方法相比，具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：

1.本發(fā)明采用三重四級(jí)桿多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行血樣樣本中葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物的高靈敏檢測(cè)分析，之前未見該檢測(cè)模式的文獻(xiàn)報(bào)道；

2.通過(guò)離子對(duì)的選擇及碰撞能的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了高低含量代謝物的一次進(jìn)樣同時(shí)分析；

3.采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，極大地降低了干擾，實(shí)現(xiàn)了低含量的葡萄糖能量代謝相關(guān)的重要代謝物的高靈敏檢測(cè)，除了烏頭酸與文獻(xiàn)報(bào)道的靈敏度相當(dāng)，其余代謝物相對(duì)于文獻(xiàn)報(bào)道靈敏度提高了3.7-58.3倍。

附表1

1：采用富馬酸-2,3-d₂校正；2：采用乳酸-3,3,3-d₃校正；3：采用琥珀酸-2,2,3,3-d₄校正；4：采用檸檬酸-2,2,4,4-d₄校正；5：采用葡萄糖-¹³C₆,1,2,3,4,5,6,6-d₇校正。