專利名稱：用于調(diào)控牛羊圍產(chǎn)期能量代謝障礙的微生物飼料添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于調(diào)控牛羊圍產(chǎn)期能量代謝障礙的微生物飼料添加劑，屬于飼料添加劑生產(chǎn) 領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
牛、羊的圍產(chǎn)期是指妊娠后期(產(chǎn)前2 3周)至泌乳初期(產(chǎn)后2 3周)。由于反芻動物曰糧 中大部分糖在瘤胃發(fā)酵過程中形成揮發(fā)性脂肪酸，只有少量葡萄糖在消化道中被吸收，并且圍產(chǎn)期 母畜經(jīng)歷妊娠、分娩等一系列劇烈的生理變化，極易導(dǎo)致能量攝入不足與消耗增多，血糖濃度下降， 從而導(dǎo)致能量代謝障礙。如奶牛發(fā)生產(chǎn)乳熱、酮病和脂肪肝，奶羊發(fā)生妊娠毒血癥、酮病等。以奶 牛酮病為例，有資料報道，我國奶牛酮病的發(fā)病率占泌乳牛的15.0% 30.0%，美國為5.0%，英國 為12.0 % ，印度為14.69 %，而日本高達(dá)43. 1 %。因此，圍產(chǎn)期能量代謝障礙嚴(yán)重影響了牛、羊 養(yǎng)殖業(yè)。
糖異生作用是指甘油、乳酸和某些氨基酸等非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樘窃蚱咸烟堑倪^程。圍產(chǎn)期的糖 異生作用對牛羊有重要的意義，是調(diào)節(jié)能量代謝障礙的重要途徑。早在20世紀(jì)70年代就有人提出甘 油可以作為生糖物質(zhì)添加到反芻動物的日糧中，當(dāng)前尋找新能源的迫切需要也使甘油成為一種實(shí)用 性的能源。研究發(fā)現(xiàn)，給圍產(chǎn)期奶牛飼喂甘油可以提高血糖，調(diào)節(jié)血液代謝，提高泌乳性能，降低 酮體含量,調(diào)節(jié)能量平衡。甘油的生產(chǎn)方法主要有三種: 一是從天然油脂皂化或水解的副產(chǎn)品中獲得， 即油脂皂化水解法；二是以石油化工產(chǎn)品為原料通過環(huán)氧氯丙烷法、丙烯醛法、環(huán)氧丙烷過醛酸法 合成甘油，即化學(xué)合成法；三是以淀粉、糖類或農(nóng)副產(chǎn)品為原料經(jīng)微生物作用發(fā)酵生產(chǎn)甘油，即發(fā) 酵法。近年來，前兩種方法由于油脂價格上漲，肥皂生產(chǎn)的減少，化學(xué)合成的成本高，甘油提取工 藝復(fù)雜等原因?qū)е赂视托枨蠊?yīng)不足，價格上升。另外工業(yè)甘油的毒性較大，含砷及重金屬物質(zhì)， 導(dǎo)致甘油未普遍應(yīng)用于反芻動物飼料添加劑領(lǐng)域。而發(fā)酵法生產(chǎn)甘油恰恰克服了工業(yè)生產(chǎn)甘油的缺 點(diǎn)。近年來，隨著生物技術(shù)、微生物菌種、發(fā)酵工藝和提取分離等各方面技術(shù)的進(jìn)展，發(fā)酵甘油生 產(chǎn)具有很好的發(fā)展前景。選取特定的益生菌做為菌種，以淀粉、糖類或農(nóng)副產(chǎn)品為原料進(jìn)行發(fā)酵生 產(chǎn)甘油，然后用于反芻動物飼料添加劑領(lǐng)域，其優(yōu)點(diǎn)在于原料來源豐富，設(shè)備要求簡單，安全無 污染，發(fā)酵后不需提取甘油，大大降低了生產(chǎn)成本。目前，尚未有發(fā)酵法生產(chǎn)甘油直接用于詞料添 加劑領(lǐng)域的報道。
硒是一種動物所必須的微量元素，是一種多功能的生命營養(yǎng)元素。研究表明，硒對動物具有抗 氧化，提高機(jī)體免疫力，提高抗病能力，調(diào)節(jié)機(jī)體代謝，提高繁殖機(jī)能，抗腫瘤，拮抗有毒元素等 多種功能。硒一般通過日常飲食進(jìn)入動物機(jī)體內(nèi)，飼料中微量元素硒缺乏或結(jié)構(gòu)不合理都會引起機(jī) 體缺乏硒，而我國飼料中的硒多從土壤中獲得，因此機(jī)體硒狀況與土壤中硒含量密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計， 全世界有40多個國家和地區(qū)缺硒，我國是個缺硒大國，有72%的國土面積存在著硒缺乏。圍產(chǎn)期 的奶牛處于應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制，疾病的易感性增加。研究認(rèn)為，奶牛圍產(chǎn)期容易發(fā)生的 乳房炎、子宮炎、胎衣滯留、酮病、脂肪肝等均與機(jī)體妊娠后期和分娩刺激等所致的氧化應(yīng)激有關(guān)。 Sw^7fo報道，奶牛妊娠末期、分娩及泌乳早期的代謝需要均可使體內(nèi)活性氧(wac"ve0x7ge"wec/es, i CW)的產(chǎn)生增加，大大超過了正常水平，而使動物處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。正常情況下，體內(nèi)/ OS不 斷產(chǎn)生，也不斷被抗氧化系統(tǒng)清除，從而始終保持一種動態(tài)平衡狀態(tài)。i OS對許多生物分子具有強(qiáng) 氧化性，除可造成蛋白質(zhì)、DNA和核苷酸損傷外，主要引起生物膜的脂質(zhì)過氧化作用。硒的最主要 的功能是抗氧化性，它參與機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)，圍產(chǎn)期缺乏硒可降低機(jī)體的免疫功能。谷胱甘 肽過氧化物酶(0 /-/，力是哺乳動物體內(nèi)第一個被公認(rèn)的含硒酶，具有極強(qiáng)的抗氧化作用，催化還原型谷胱甘肽(GSi/)還原體內(nèi)有害的過氧化物0 (90//)，包括過氧化氫0/00//)，使之轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的羥基化合物，從而保護(hù)生物膜免受過氧化物的氧化損傷。
為了在飼料中強(qiáng)化硒，防治缺硒癥狀發(fā)生，人們開發(fā)了多種硒營養(yǎng)補(bǔ)充劑。目前補(bǔ)硒的方法主要是在飼料中添加無機(jī)硒，但大量研究表明亞硒酸鈉等無機(jī)硒的利用率較低，動物排泄的硒造成土壤和環(huán)境污染的危險較大，這些己經(jīng)引起人們對使用無機(jī)硒的疑慮；而有機(jī)硒毒性小，吸收率高，生物利用率高，在滿足動物生長發(fā)育所需的添加量的范圍內(nèi)對環(huán)境基本沒有污染。生物有機(jī)化是獲得有機(jī)營養(yǎng)元素的簡便而經(jīng)濟(jì)的途徑，有利于實(shí)際生產(chǎn)中大量應(yīng)用。硒的生物有機(jī)化主要是在植物中和微生物體內(nèi)進(jìn)行的。研究表明，在人和動物體內(nèi)，大部分的硒是以含硒蛋白及硒酶的生物活性形式發(fā)揮作用的，硒在這些蛋白質(zhì)及硒酶的氨基酸中取代硫的位置，形成硒蛋氨酸、硒胱氨酸、硒半胱氨酸等。通過生物轉(zhuǎn)化獲得的有機(jī)硒因與其在人和動物體內(nèi)存在的形式相同或相近，所以吸收利用率更高。
益生菌(profoo&s)又名促生素、生菌劑、原生菌、微生物制劑、活菌制劑，是指"當(dāng)攝入一定量時能對宿主的健康有作用的微生物活體"。益生菌主要包括乳酸菌類、雙歧桿菌類、芽孢桿菌類、光合細(xì)菌類和酵母類。圍產(chǎn)期母畜經(jīng)歷妊娠、分娩等一系列劇烈的生理變化，飲食改變，往往會造成動物機(jī)體腸道內(nèi)有益菌數(shù)量下降，導(dǎo)致腸道微生物生態(tài)失調(diào)，引起菌群易位，誘發(fā)內(nèi)源感染，造成機(jī)體病變，通過外源補(bǔ)充益生菌，可維持腸道菌群平衡，提高機(jī)體免疫力，降低疾病的易感性。
綜上所述，以特定的益生菌為菌種，以淀粉、糖類或農(nóng)副產(chǎn)品為原料，通過發(fā)酵法將原料轉(zhuǎn)化為甘油，并將無機(jī)態(tài)的硒轉(zhuǎn)變成有機(jī)態(tài)的硒，用適當(dāng)?shù)奈絼┪?，得到一種富含甘油和有機(jī)硒的用于調(diào)控牛羊圍產(chǎn)期能量代謝障礙的微生物飼料添加劑，可以同時發(fā)揮甘油、有機(jī)硒和益生菌的三重功效，這顯然能有效地改善機(jī)體的內(nèi)生環(huán)境，補(bǔ)充能量，調(diào)節(jié)能量代謝障礙，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，抵抗腫瘤，拮抗病原微生物，從而達(dá)到預(yù)防疾病的作用。因此富含甘油和有機(jī)硒的復(fù)合益生菌制劑作為安全、多功能的飼料添加劑必將在醫(yī)藥、飼料添加劑領(lǐng)域發(fā)揮巨大作用
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種簡單、低成本生產(chǎn)的用于調(diào)控牛、羊圍產(chǎn)期能量代謝障礙的微生物飼料添加劑，該產(chǎn)品同時發(fā)揮甘油、有機(jī)硒和益生菌三重功效。技術(shù)方案
用于調(diào)控牛、羊圍產(chǎn)期能量代謝障礙的微生物飼料添加劑，具體生產(chǎn)方法包括以下步驟
1) 菌種克魯斯假絲酵母(Ca"cfefo /bro")、產(chǎn)朊假絲酵母(Oro&fa w"fo)、嗜熱鏈球菌(Sr卬tococc^ 77^mopMws);均為衛(wèi)生部允許使用的益生菌菌種。
2) 菌劑生產(chǎn)培養(yǎng)基質(zhì)量體積比
15%~25%葡萄糖、0. 5%~2%酵母浸膏、0. 1%~0. 3%尿素、0. H0. 3%玉米漿干粉、0. 3^0. 4%磷酸二氫鉀、4%~6%氯化鈉，其余為水。
3) 斜面活化培養(yǎng)基
克魯斯假絲酵母活化培養(yǎng)基(CM(9357): 40g葡萄糖、2g尿素、4g酵母浸膏、20g瓊脂，1000ral水，PH4.5， 115。C高壓蒸汽滅菌15min，備用。
產(chǎn)朊假絲酵母、嗜熱鏈球菌活化培養(yǎng)基(ZPZO: 20g葡萄糖、5g酵母浸膏、10g蛋白胨、20g瓊脂、1000ml水，初始pH6. 7， 115'C高壓蒸汽滅菌15min，備用。
4) 液體活化培養(yǎng)基斜面活化培養(yǎng)基中不加瓊脂。
5) 無機(jī)硒源配置含硒量0.2 2mg/ml的亞硒酸鈉溶液，100 125。C高壓蒸汽滅菌20 30min，備用。
46) 吸附劑玉米粉。
7) 菌種的活化與種子液的獲得
將保存在4'C的克魯斯假絲酵母接種于固體培養(yǎng)基上，于20 30。C培養(yǎng)30~40h;如此連 續(xù)轉(zhuǎn)接3 5次，再接種于CM0357液體培養(yǎng)基中，于20~3(TC, 150 r/rain，搖床培養(yǎng)24 36h，得 克魯斯假絲酵母種子液，其cfu達(dá)到107ml以上；將保存在4。C的產(chǎn)朊假絲酵母接種于YPD固體培 養(yǎng)基上，于20 3(TC培養(yǎng)30~40h，如此連續(xù)轉(zhuǎn)接3~5次，再接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于20~30°C ， 150 r/min，搖床培養(yǎng)24~36h，得產(chǎn)朊假絲酵母種子液，其cfu達(dá)到109/ml以上；將保存在4。C的 嗜熱鏈球菌接種于YPD固體培養(yǎng)基上，于36 45'C培養(yǎng)36~48h;如此連續(xù)轉(zhuǎn)接3~5次，再接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，于36 45'C，培養(yǎng)24 36h，得嗜熱鏈球菌種子液，其cfu達(dá)到K)7ml以上。
8) 生產(chǎn)
取生產(chǎn)培養(yǎng)基配料葡萄糖15~25kg、酵母浸膏0. 1~1. Og、尿素100~300g、玉米漿干粉100~300g、 磷酸二氫鉀300~400g和氯化鈉4~6kg，將其溶解在水中，使總體積達(dá)到100L，然后加入到150L發(fā) 酵罐中，115 12(TC高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至40 50'C，將無機(jī)硒源加入到菌劑生產(chǎn)培養(yǎng)基中， 使培養(yǎng)基中硒濃度為2~10mg/kg;再將克魯斯假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和嗜熱鏈球菌種子液按體積 比13:1:2接種于菌劑生產(chǎn)培養(yǎng)基中，總接種量體積比為6%~11%，培養(yǎng)溫度為20~4(TC，通氣量為 0.05m7h，搖床轉(zhuǎn)速70r/min，罐壓為0. 04Mpa，培養(yǎng)時間為96~132h;
9) 產(chǎn)品獲得
培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液與適量的玉米粉混合，35 4(TC烘干，即得到一種富含甘油和有機(jī)硒的復(fù) 合益生菌產(chǎn)品。
有益效果
試驗(yàn)表明，圍產(chǎn)期飼喂本發(fā)明不同劑量富含甘油和有機(jī)硒的復(fù)合益生菌產(chǎn)品，產(chǎn)品處理組血漿
葡萄糖濃度高于對照組，血槳游離脂肪酸和e-羥丁酸濃度及尿酮濃度低于對照組。隨著日糧添加產(chǎn)
品的增加，中劑量組血漿葡萄糖濃度和H組顯著高于對照組(P〈0.05);中劑量組和高劑量組血漿游 離脂肪酸濃度顯著低于對照組(P<0.05)，高劑量組血漿P-羥丁酸濃度顯著低于對照組(P〈0.05); 中劑量和高劑量組尿酮濃度顯著低于對照組(P<0.05)。
本發(fā)明利用益生菌可將糖轉(zhuǎn)化為甘油，無機(jī)態(tài)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的原理，生產(chǎn)出富含甘油和有機(jī) 硒的復(fù)合益生菌產(chǎn)品，能同時發(fā)揮甘油、有機(jī)硒和益生菌三重功效，能為反芻動物補(bǔ)充能量，調(diào)控 能量代謝障礙，調(diào)節(jié)腸道菌群，拮抗病原微生物，增進(jìn)食欲，提高機(jī)體免疫力和抗病力，提高生產(chǎn) 性能，是一種安全、無殘留、效價高的新型飼料添加劑。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l
(1) 菌種
克魯斯假絲酵母(C朋d血>b7 e/):購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株代號為 C7CC1722。
產(chǎn)朊假絲酵母(Ca"cZ/cfo",/fo):購自中國科學(xué)院微生物研究所微生物菌種保藏中心，菌株代號 為AS2. 1180。
嗜熱鏈球菌(SfreptococcM 7T!emzopMMS):購自中國科學(xué)院微生物研究所微生物菌種保藏中心， 菌株代號為AS1.2471。
(2) 菌種活化與種子液的獲得
斜面活化培養(yǎng)基質(zhì)量比克魯斯假絲酵母活化培養(yǎng)基(CM0357): 40g葡萄糖、2g尿素、4g酵 母浸膏、20g瓊脂，1000ml水，pH4.5， 115。C高壓蒸汽滅菌15min，備用；產(chǎn)朊假絲酵母、嗜熱鏈球菌活化培養(yǎng)基(rP￡>): 20g葡萄糖、5g酵母浸膏、10g蛋白胨、20g瓊脂、1000ml水，p朋.7，115。C高壓蒸汽滅菌15min，備用。
將保存在4'C的克魯斯假絲酵母接種于CM0357固體培養(yǎng)基上,于3(TC，培養(yǎng)30h;如此連續(xù)轉(zhuǎn)接3 5次，再接種于CM0357液體培養(yǎng)基中，于30。C， 150 r/min，搖床培養(yǎng)24h ，得克魯斯假絲酵母種子液，其rfu達(dá)到3. 24X 107ml (菌種液A)。
將保存在4'C的產(chǎn)朊假絲酵母接種于1TD固體培養(yǎng)基上,于28'C，培養(yǎng)32h;如此連續(xù)轉(zhuǎn)接3 5次，再接種于:KPD液體培養(yǎng)基中，于28。C， 150 r/rain，搖床培養(yǎng)24h ，得產(chǎn)朊假絲酵母種子液，其cfu達(dá)到4. 46X107ml (菌種液B)。
將保存在4'C的嗜熱鏈球菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，于42°C，培養(yǎng)48h;如此連續(xù)轉(zhuǎn)接3 5次，再接種于液體活化培養(yǎng)基中，于42°C ，培養(yǎng)24h ，得嗜熱鏈球菌種子液，其cfu達(dá)到8. 25 X 107ml(菌種液C)。
(3) 生產(chǎn)培養(yǎng)基配料
培養(yǎng)基配料葡萄糖20kg、酵母浸膏200g、尿素200g、玉米漿干粉200g、磷酸二氫鉀350g、氯化鈉4kg。
制備無機(jī)硒源制備Se濃度為1. 0 mg/ml的亞硒酸鈉溶液0. 5L， 12rC高壓蒸汽滅菌30min，
備用o
吸附劑50kg玉米粉
(4) 生產(chǎn)
將上述菌劑生產(chǎn)培養(yǎng)基配料溶解在水中，使其總體積達(dá)到IOOL，然后加入到5/07^^/-55//5(1500發(fā)酵罐中，115。C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至40~50°C ，加入含硒量為1. Omg/ml的亞硒酸鈉溶液0. 5L，接入菌種液A6.5L、菌種液B0.5L、菌種液C1L，溫度為33°C，通氣量為0.05mVh，轉(zhuǎn)數(shù)為70r/min，罐壓為0. 04Mpa，培養(yǎng)時間為120h,得到發(fā)酵液。
將上述發(fā)酵液與50kg玉米粉混勻，38。C左右烘干，得到富含甘油和有機(jī)硒的復(fù)合益生菌制劑。上述獲得的富含甘油和有機(jī)硒的復(fù)合益生菌制劑的量為61.95kg，克魯斯假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、嗜熱鏈球菌的數(shù)量分別達(dá)7. 75X 108cfu/g、 2,69X108cfu/g、 6. 45X 109cfu /g,甘油含量為108. 55g/kg，有機(jī)硒的含量為6. 79mg/kg，硒的總含量為8. 06mg/kg，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率約為84. 2%。
實(shí)施例2
(1)菌種
克魯斯假絲酵母(Qrofefe :購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株代號為
C7CC1722。
產(chǎn)朊假絲酵母(OTO//cfaW/fo):購自中國科學(xué)院微生物研究所微生物菌種保藏中心，菌株代號為AS2. 1180。
嗜熱鏈球菌(&^ptococc^ rfemopM^):購自中國科學(xué)院微生物研究所微生物菌種保藏中心，菌株代號為AS1.2471。
(2)菌種活化與種子液的獲得
斜面活化培養(yǎng)基質(zhì)量比克魯斯假絲酵母活化培養(yǎng)基(GW0357): 40g葡萄糖、2g尿素、4g酵母浸膏、20g瓊脂，1000ml水，pH4. 5， 115。C高壓蒸汽滅菌15min,備用；產(chǎn)朊假絲酵母、嗜熱鏈球菌活化培養(yǎng)基(ZPD): 20g葡萄糖、5g酵母浸膏、10g蛋白胨、20g瓊脂、1000ml水，p朋.7，115'C高壓蒸汽滅菌15min，備用。
將保存在4'C的克魯斯假絲酵母接種于CtW9357固體培養(yǎng)基上，于30°C，培養(yǎng)30h;如此連續(xù)轉(zhuǎn)
6接3 5次,再接種于C^r0357液體培養(yǎng)基中，于30'C， 150 r/min，搖床培養(yǎng)24h ，得克魯斯假絲 酵母種子液，其cfu達(dá)到3. 24X 107ml (菌種液A)。
將保存在4'C的產(chǎn)朊假絲酵母接種于1TD固體培養(yǎng)基上，于28°C ，培養(yǎng)32h;如此連續(xù)轉(zhuǎn)接3 5次，再接種于JT"液體培養(yǎng)基中，于28'C， 150r/min，搖床培養(yǎng)24h ,得產(chǎn)朊假絲酵母種子液， 其cf u達(dá)到4. 46 X 107ml (菌種液B)。
將保存在4'C的嗜熱鏈球菌接種于斜面活化培養(yǎng)基上，于42°C，培養(yǎng)48h;如此連續(xù)轉(zhuǎn)接3 5 次,再接種亍液體活化培養(yǎng)基中，于42'C，培養(yǎng)24h ，得嗜熱鏈球菌種子液，其cfu達(dá)到8. 25X 107ml (菌種液C)。
(3) 發(fā)酵所需配料
培養(yǎng)基配料葡萄糖20kg、酵母浸膏200g、尿素200g、玉米漿干粉200g、磷酸二氫鉀350g、 氯化鈉4kg，其余為水。
制備無機(jī)硒源制備Se濃度為0. 8mg/ml的亞硒酸鈉溶液0. 5L， 121'C高壓蒸汽滅菌30min，備用。
吸附劑50kg玉米粉
(4) 生產(chǎn)
將菌劑生產(chǎn)培養(yǎng)基配料溶解在水中，使其體積達(dá)到IOOL，然后加入到JS/6>r￡C7/-5S//S(150L) 發(fā)酵罐中，115。C高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至40~50°C,加入含硒量為0. 8mg/ml的亞硒酸鈉溶液
0. 5.，接入菌種液A6.5L、菌種液B0.5L、菌種液C1L，溫度為33°C,通氣量為0. 05mVh，轉(zhuǎn)數(shù)為 70r/min，罐壓為0. 04Mpa，培養(yǎng)時間為120h，得到發(fā)酵液。
將上述發(fā)酵液與50kg玉米粉混勻，38r左右烘干，得到富含甘油和有機(jī)硒的復(fù)合益生菌制劑。 上述獲得的富含甘油和有機(jī)硒的復(fù)合益生菌制劑的量為61.98kg，克魯斯假絲酵母、產(chǎn)朊假絲 酵母、嗜熱鏈球菌的數(shù)量分別達(dá)7 . 77X 108cfu/g、 2. 72X10Vfu /g、 6. 53X 109cfu/g，甘油含量為 115. 77g/kg，有機(jī)硒的含量為5. 70mg/kg,硒的總含量為6. 45mg/kg,有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率約為88. 4%。
添加了上述富含甘油和有機(jī)硒的復(fù)合益生菌制劑的詞料產(chǎn)品進(jìn)行試驗(yàn)時的試驗(yàn)動物選取、處理 及試驗(yàn)結(jié)果，包括
1. 試驗(yàn)動物及分組
12頭經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛，體況、年齡、胎次、預(yù)產(chǎn)期、產(chǎn)奶量相近，隨機(jī)分成4組，每組3頭奶 牛，即對照組(不添加產(chǎn)品組)、L組(低劑量組，添加約含甘油30g的產(chǎn)品276. 4g/頭 天)、M (中 劑量組，添加約含甘油60g的產(chǎn)品552. 7g /頭 天)、H組(高劑量組，添加約含甘油90g的產(chǎn)品 829. lg /頭 天)，預(yù)試驗(yàn)7天，正式試驗(yàn)從產(chǎn)前14天至產(chǎn)后21天。
對照組喂給基礎(chǔ)日糧；1^組喂給基礎(chǔ)日糧+產(chǎn)品276.4g/頭'天(約含有甘油30g， Se 2.6 mg 和益生菌2.07X 109cfu) -276. 4g玉米粉；M組喂給基礎(chǔ)日糧+產(chǎn)品552. 7g/頭 天(約含有甘油 60g， Se5. lmg和益生菌4. 14X10Vfu) -552.7g玉米粉)；H組喂給基礎(chǔ)日糧+產(chǎn)品829. lg/頭 天 (約含有甘油90g， Se7.6 mg和6.21XI(fcfu) -829. lg玉米粉。在每天下午喂牛時，把產(chǎn)品拌入 混合精料，單獨(dú)投喂。
2. 試驗(yàn)方法
血漿葡萄糖(G/"co^)濃度采用S^wa葡萄糖氧化酶試劑盒的方法進(jìn)行測定；游離脂肪酸 OVo"-e他r訴"/a吵w'血A^M)濃度采用南京建成生物工程研究所的游離脂肪酸試劑盒的方法測 定；e -羥丁酸(yff-/y^rac>^^rafe, 濃度采用S/gma試劑盒310-A的方法測定；尿樣采用5ayer C￡
/W/:raX 500型尿液分析儀及配套試紙、半定量法測定尿酮(f7h'脫fetowes)濃度。
所有奶牛分別于試驗(yàn)第O、 21 (產(chǎn)后第7d)、 28 (產(chǎn)后第14d)、 35 (產(chǎn)后第21d) d采集血液樣品。所有奶牛分別于產(chǎn)后第7、 14、 21d采集尿樣。 3.試驗(yàn)結(jié)果
由表l可知圍產(chǎn)期飼喂不同劑量富含甘油和有機(jī)硒的復(fù)合益生菌產(chǎn)品，產(chǎn)品處理組血漿葡萄糖濃 度高于對照組，血漿游離脂肪酸和3 -羥丁酸濃度及尿酮濃度低于對照組。隨著日糧添加產(chǎn)品的增加， M組血漿葡萄糖濃度和H組顯著高于對照組(P<0. 05); M組和H組血漿游離脂肪酸濃度顯著低于對照組 (P〈0.05)， H組血漿e-羥丁酸濃度顯著低于對照組(P〈0.05); M和H組尿酮濃度顯著低于對照組 (P<0. 05)。
試驗(yàn)表明，在圍產(chǎn)期飼喂富含甘油和有機(jī)硒的復(fù)合益生菌產(chǎn)品可以有效地調(diào)控奶牛圍產(chǎn)期能量 代謝障礙。該產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)在于原料來源豐富，設(shè)備要求簡單，較工業(yè)化生產(chǎn)安全無污染，發(fā)酵后 不需提取甘油，大大降低了生產(chǎn)成本。該產(chǎn)品具有甘油、有機(jī)硒和益生菌三重功效，能給反芻動物 改善機(jī)體的內(nèi)生環(huán)境，調(diào)節(jié)能量代謝，調(diào)節(jié)腸道菌群，拮抗病原微生物，增進(jìn)食欲，提高機(jī)體免疫 力和抗病力，是一種安全、無殘留、效價高的新型飼料添加劑。
表1富含甘油和有機(jī)硒的復(fù)合益生菌產(chǎn)品對圍產(chǎn)期奶牛血漿代謝產(chǎn)物和尿酮含量的影響
項目
產(chǎn)品添加量/ (g. d—1 )
0
276.4
552.
829. 1
血糖(mg. dL—') 0d
產(chǎn)后7d 產(chǎn)后14d 產(chǎn)后21d Overall
69. 43±1.34aA 49. 35±1.68bB 54. 32±1.94M 57. 69±1.84bA 57. 70 ±8. 54b
游離脂肪酸/ ("Eq.L—1 )
產(chǎn)后7d 產(chǎn)后14d 產(chǎn)后21d Overall
P-羥丁酸Omol.L—0 產(chǎn)后7d 產(chǎn)后14d 產(chǎn)后21d Overall 尿酮(mg/.dL—》 產(chǎn)后7d 產(chǎn)后14d 產(chǎn)后21d Overall
478. 33 ±17, 32aA 371. 24±16. 54』 280. 45 ±18. 74aC 376. 67±99. 05a
913. 52±46. 76" 841.25±48. 38必 759. 54 ±45. 64" 838. 10 ±77. 04a
17. 73 ±1.04" 16. 87 ±1, 37''
15. 34±1.24d
16. 65土1.2T
68.92 ±1.41" 52. 16±1.75abB 56. 41土1.52越 60. 86±1. 64abA 59. 59 ±7. 16ab
464. 35 ±16. 35abA 363. 56 ±17. 76abB 270. 47 ±19. 45aC 366. 13±96. 97ab
898. 35 ±50. 67aM 825. 83 ±47. 86abB
740. 76 ±43. 68abC 821. 65 ±78. 88ab
15. 75±1.23abA 14. 88±1. llbAB
13. 55 ±1. 37
14. 73±1. llb
69. 54 ±1. 33" 55.63士1.6738 60. 37 ±1. 73aAB 63. 13±1, 6, 62. 17±5. 81a
455. 46 ±18. 75bA 358. 18±17. 12bB 266. 83±18. 71b' 360. 16 ±94. 33b
885. 74 ±47. 98" 800. 38 ±49. 74* 731. 98 ±48. 37rf 806. 03 ±77. 04a
13.37±1.29bA 10. 39 ±1.43" 8. 12 ±1. 18cC 10. 63±2. 63c
68. 97±1. 41s" 56. 47±1.90aB 61. 93 ±1.86^ 64. 95 ±1. 78aA 63. 08±5. 27a
452. 38 ±17. 52bA 350. 13 ±19. 76bB 260. 79 ±17. 87b' 354. 43±95. 87b
870. 12 ±49. 42bA 780. 45±52. 19bB 722.45±47. 75bf 791. 01±74b
12. 23 ±1. 32bA 9. 13±1.39cB 7. 21 ±1.06" 9. 52±2. 53c
同行肩注不同小寫字母表示差異顯著(P〈0.05)，同列肩注不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05),
8
權(quán)利要求
1、一種用于調(diào)控牛羊圍產(chǎn)期能量代謝障礙的微生物飼料添加劑，其生產(chǎn)方法包括以下步驟1)菌種克魯斯假絲酵母(Candida krusei)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus Thermophilus)；2)菌劑生產(chǎn)培養(yǎng)基質(zhì)量體積比15％～25％葡萄糖、0.1％～1％酵母浸膏、0.1％～0.3％尿素、0.1％～0.3％玉米漿干粉、0.3％～0.4％磷酸二氫鉀、4％～6％氯化鈉，其余為水；3)斜面活化培養(yǎng)基克魯斯假絲酵母活化CM0357培養(yǎng)基40g葡萄糖、2g尿素、4g酵母浸膏、20g瓊脂，1000ml水，pH4.5，115℃高壓蒸汽滅菌15min，備用；產(chǎn)朊假絲酵母、嗜熱鏈球菌活化YPD培養(yǎng)基20g葡萄糖、5g酵母浸膏、10g蛋白胨、20g瓊脂、1000ml水，初始pH 6.7，115℃高壓蒸汽滅菌15min，備用；4)液體活化培養(yǎng)基斜面活化培養(yǎng)基中不加瓊脂；5)無機(jī)硒源配制含硒量0.2～2mg/ml的亞硒酸鈉水溶液，100～125℃高壓蒸汽滅菌20～30min，備用；6)吸附劑玉米粉；7)菌種的活化與種子液的獲得將保存在4℃的克魯斯假絲酵母接種于CM0357固體培養(yǎng)基上，于20～30℃培養(yǎng)30～40h；如此連續(xù)轉(zhuǎn)接3～5次，再接種于CM0357液體培養(yǎng)基中，于20～30℃，150r/min，搖床培養(yǎng)24～36h，得克魯斯假絲酵母種子液，其cfu達(dá)到109/ml以上；將保存在4℃的產(chǎn)朊假絲酵母接種于YPD固體培養(yǎng)基上，于20～30℃培養(yǎng)30～40h，如此連續(xù)轉(zhuǎn)接3～5次，再接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于20～30℃，150r/min，搖床培養(yǎng)24～36h，得產(chǎn)朊假絲酵母種子液，其cfu達(dá)到109/ml以上；將保存在4℃的嗜熱鏈球菌接種于YPD固體培養(yǎng)基上，于36～45℃培養(yǎng)36～48h；如此連續(xù)轉(zhuǎn)接3～5次，再接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于36～45℃，培養(yǎng)24～36h，得嗜熱鏈球菌種子液，其cfu達(dá)到1010/ml以上；8)生產(chǎn)取生產(chǎn)培養(yǎng)基配料葡萄糖15～25kg、酵母浸膏0.1～1.0g、尿素100～300g、玉米漿干粉100～300g、磷酸二氫鉀300～400g和氯化鈉4～6kg，將其溶解在水中，使總體積達(dá)到100L，然后加入到150L發(fā)酵罐中，115～120℃高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至40～50℃，將無機(jī)硒源加入到菌劑生產(chǎn)培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中硒濃度為2～10mg/kg；再將克魯斯假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和嗜熱鏈球菌種子液按體積比13∶1∶2接種于菌劑生產(chǎn)培養(yǎng)基中，總接種量體積比為6％～11％，培養(yǎng)溫度為20～40℃，通氣量為0.05m3/h，搖床轉(zhuǎn)速70r/min，罐壓為0.04Mpa，培養(yǎng)時間為96～132h；9)產(chǎn)品獲得培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液與50kg的玉米粉混合，35～40℃烘干，即得到一種富含甘油和有機(jī)硒的復(fù)合益生菌產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于調(diào)控牛羊圍產(chǎn)期能量代謝障礙的微生物飼料添加劑，屬于飼料添加劑生產(chǎn)領(lǐng)域。將無機(jī)硒源加入到菌劑生產(chǎn)培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中硒濃度為2～10mg/kg，將克魯斯假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和嗜熱鏈球菌種子液按13∶1∶2接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液與適量的玉米粉混合，35～40℃烘干即得。本發(fā)明利用益生菌可將糖轉(zhuǎn)化為甘油，無機(jī)態(tài)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的原理，生產(chǎn)出富含甘油和有機(jī)硒的復(fù)合益生菌產(chǎn)品，能同時發(fā)揮甘油、有機(jī)硒和益生菌三重功效，能為反芻動物補(bǔ)充能量，調(diào)控能量代謝障礙，調(diào)節(jié)腸道菌群，拮抗病原微生物，增進(jìn)食欲，提高機(jī)體免疫力和抗病力，提高生產(chǎn)性能，是一種安全、無殘留、效價高的新型飼料添加劑。
文檔編號A23K1/16GK101658243SQ200910034990
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月17日
發(fā)明者冉林武, 張克春, 朱永興, 李靈恩, 潘翠玲, 趙春燕, 黃克和 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)