一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe3O4CPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe3O4CPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，屬于新型功能材料、生物傳感檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。基于Fe3O4CPd比表面積大，催化效率高等特點，顯著提高了免疫傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性，對腫瘤的早期診斷具有重要的意義。
【專利說明】—種基于羧基化多壁碳納米管與Fe304@C@Pd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OOgPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器。具體是米用核殼Fe3O4OCOPd,制備一種檢測乳腺癌標志物的夾心型電化學(xué)免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]免疫傳感器是將免疫學(xué)方法與分析化學(xué)方法相結(jié)合的一種生物傳感器，通過抗原與抗體之間的特性性結(jié)合，使得它具有高靈敏性、高選擇性、分析快速和操作簡便等優(yōu)點。電化學(xué)免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、結(jié)構(gòu)簡單、操作簡便、易于小型化、可連續(xù)、快速自動化檢測分析等優(yōu)點，因此本發(fā)明一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OCIgPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器，實現(xiàn)了對乳腺癌標志物的檢測。
[0003]本發(fā)明將羧基化多壁碳納米管引入到電化學(xué)免疫傳感器的制備中，利用其生物相容性及大的比表面積，實現(xiàn)抗體在電極表面的有效固定；利用其優(yōu)異的電子傳遞能力，起到增強電化學(xué)信號的作用。通過EDC和NHS對羧基的活化作用，實現(xiàn)了抗體在電極表面的固定JfFe3O4OClgPd引入傳感器的制備中，構(gòu)建了一種超靈敏的夾心型電化學(xué)免疫傳感器。在不使用酶的情況下，F(xiàn)e3O4OClgPd對雙氧水H2O2有良好的催化能力，并在檢測過程中產(chǎn)生良好的電化學(xué)信號，有效地降低了傳感器的檢出限，可用于多種乳腺癌標志物的分析。該方法具有成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速等優(yōu)點，而且制備過程較為簡單，有效克服了目前乳腺癌標志物檢測方法的不足。
[0004]申請?zhí)枮镃N200810031756.7的專利涉及到Fe3O4磁性納米顆粒的酶免疫傳感器；CN201110391104.6的專利涉及到Fe3O4磁性納米顆粒電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器；CN201210088850.2的專利涉及到Fe3O4磁性納米顆粒與功能化的多壁碳納米管的復(fù)合膜的免疫傳感器；CN201210378644.5的專利涉及到Fe3O4磁性納米顆粒負載金和酶的化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。本發(fā)明在Fe3O4磁性納米顆粒表面包覆一層碳后再進行鈀納米粒子的負載，形成一種核殼的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明在沒有使用酶的情況下，利用鈀納米粒子對H2O2的催化作用實現(xiàn)信號的放大作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的一在于，提供了一種靈敏度高、特異性強、重現(xiàn)性好、操作簡便的免疫傳感器；
本發(fā)明的目的二在于實現(xiàn)了對乳腺癌標志物的靈敏檢測。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的。本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟。
[0007]1.一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe304@C@Pd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器的制備方法 (1)將直徑為3?5mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將4?6μ?,Γ3 mg/mL羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液滴涂在電極表面，滴加Γ6μ?、含有0.Γ0.4 mo I/L EDC和0.1 mo I/L NHS的混合溶液至電極表面，待電極微干；
(3)滴加4飛μ?、6?14Pg/mL的乳腺癌標志物捕獲抗體Ab1溶液至電極表面，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(4)滴加4飛PL、質(zhì)量分數(shù)為0.19Γ0.3%的牛血清白蛋白BSA溶液至電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(5)滴加4飛μ?、0.5 pg/mL"lO ng/mL的一系列不同濃度的乳腺癌標志物標準溶液至電極表面，超純水沖洗，4 0C冰箱中晾干；
(6)滴加4飛μ?,Γ3mg/mL的檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液至電極表面，置于4 °C冰箱中晾干，制得一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OOgPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器。
[0008]2.檢測抗體孵化物Fe3O4OCIgPd-Ab2溶液的制備
(1)羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液的制備
將廣3 mg羧基化多壁碳納米管加入到I mL、0.1%的殼聚糖溶液中，超聲分散1(Γ20min，將溶液保存在4 °C下備用；所述0.1%的殼聚糖溶液，是將I g的殼聚糖溶于10 mL、0.02 mol/L的稀鹽酸溶液制得；
(2)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的制備
1)鈀納米顆粒溶液的制備
將0.2(H).30 mmol Na2PdCl4和0.15?0.35 mmol檸檬酸三鈉，溶于20 mL超純水中，立即加入0.6 mL.0.0r0.03 mol/LNaBH4溶液，持續(xù)攪拌25?35 S，溶液變?yōu)樽睾谏?，制得鈀納米顆粒溶液；
2)Fe3O4磁性微球的制備
將0.75?1.85 g FeCl3.6H20溶解于75 mL乙二醇中，磁力攪拌0.5?I h，得到亮黃色的溶液，加入2.6?4.6 g的乙酸鈉，攪拌0.5?1 h，將得到的溶液移至200 mL聚四氟乙烯襯里的高壓反應(yīng)釜中，在18(Γ220 1:高壓反應(yīng)釜中密封加熱12?24 h，冷卻至室溫，將制得的黑色磁微球用磁鐵收集，依次用乙醇和超純水沖洗6次，在45飛5 1:真空條件下干燥12 h，制得Fe3O4磁性微球；
3)Fe3O4OC磁性微球的制備
將0.15?0.25 g的Fe3O4磁性微球加入到150?240 mL、0.08?0.12 mol/L HNO3溶液中，超聲處理1(T15 min,超純水沖洗，處理后的Fe3O4磁性微球與0.4^0.6 mol/L葡萄糖溶液共混，分散并超聲處理1(T15 min，得到的懸浮液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，在180 °C下加熱5?7h，冷卻至室溫，用磁鐵分離，超純水沖洗6次，50 1:真空條件下干燥12 h，制得Fe3O4OC磁性微球；
4)檢測抗體標記物Fe3O4OClgPd磁性微球的制備
將8?12 mg的Fe3O4OC磁微球分散于20 mL、含有1.0X 1(Γ2?3.0X 1(T2 mol/L三羥甲基氨基甲烷和2.ΟΧΙΟ—2 mol/L NaCl的質(zhì)量分數(shù)為0.10%?0.30%聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽I3DDA的水溶液中，攪拌40 min，剩余的聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA用磁鐵移除；吸收了聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA的微球用超純水沖洗3飛次，將此微球分散于12?18 mL鈀納米顆粒溶液中，攪拌40 min，利用磁鐵將上清液分離，所得固體用超純水沖洗3次，在50 1:真空條件下干燥12 h，制得檢測抗體標記物Fe3O4OOgPd磁性微球；
5)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的制備
將I mL、8?12 Pg/mL的乳腺癌標志物檢測抗體Ab2溶液，加入到2 mg檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球中，4 °C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h ;利用磁鐵分離得到固體，向該固體中加入I mL、pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，制得核殼檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液，4 °C下保存?zhèn)溆谩?br> [0009]3.乳腺癌標志物的檢測
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、pH=5.0?8.5磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；
(2)用計時電流法對乳腺癌標志物進行檢測，輸入電壓為-0.4 V，取樣間隔0.1 S，運行時間250 s ；
(3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL ρΗ=5.(Γ8.5磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL,5^10 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。
[0010]上述所述乳腺癌標志物選自下列之一:CA153、CEA、CA549、hCG、降鈣素、鐵蛋白。
[0011]本發(fā)明的有益成果
(I)本發(fā)明采用的基底材料為羧基化多壁碳納米管，其與多壁碳納米管相比較，其保留了多壁碳納米管較大的表面積和較好的導(dǎo)電性，以及良好的生物相容性和穩(wěn)定性，另外，其表面還有大量的羧基官能團，能夠增加抗體在其表面的負載量和在水中的分散性，增加了傳感器靈敏度和穩(wěn)定性。
[0012](2)將殼聚糖應(yīng)用到電化學(xué)免疫傳感器的制備當中，利用其優(yōu)異的成膜性能，防止了羧基化多壁碳納米管從電極表面上脫落，同時利用殼聚糖具有很好的生物相容性和低毒性，有利于抗體在電極表面的固定。
[0013](3 )Fe304@C為立體球狀結(jié)構(gòu)，具有亞微米尺寸，其大的表面積能夠增加鈀在其表面的負載量，進而增加檢測抗體的負載量，使傳感器實現(xiàn)了對腫瘤標志物的超靈敏檢測。
[0014](4)將Fe304@C@Pd與腫瘤標志物檢測抗體直接孵化，利用貴金屬優(yōu)異的生物相容性和較高的催化性能，在檢測抗體的標記中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的檢測誤差，簡化了檢測抗體標記物的制作步驟，顯著提高了電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。
[0015](5)本發(fā)明利用抗原、抗體的免疫反應(yīng)，提高了檢測方法的特異性。
[0016](6)本發(fā)明制備的電化學(xué)免疫傳感器用于多種腫瘤標志物的檢測，響應(yīng)時間短，檢測限低，線性范圍寬，可以實現(xiàn)簡單、快速、高靈敏和特異性檢測，對乳腺癌標志物檢測限最低可達 0.033 pg/mLo

【具體實施方式】
[0017]實施例1 一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OCIgPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器的制備方法
(I)將直徑為3?5 mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈； (2)將4μ?、1 mg/mL羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液滴涂在電極表面，滴加4 μ?、含有0.1 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS的混合溶液至電極表面，待電極微干；
(3)滴加4μ?、6 Pg/mL的乳腺癌標志物捕獲抗體Ab1溶液至電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；
(4)滴加4PL、質(zhì)量分數(shù)為0.1%的牛血清白蛋白BSA溶液至電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(5)滴加4μ?、0.5 pg/mL"lO ng/mL的一系列不同濃度的乳腺癌標志物標準溶液至電極表面，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(6)滴加4μ?、1 mg/mL的檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液至電極表面，置于4 V冰箱中晾干，制得一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OOgPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器。
[0018]實施例2 —種基于羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OCIgPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器的制備方法
(1)將直徑為3?5mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將5μ?、2 mg/mL羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液滴涂在電極表面，滴加5 μ?、含有0.2 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS的混合溶液至電極表面，待電極微干；
(3)滴加5μ?、10 Pg/mL的乳腺癌標志物捕獲抗體Ab1溶液至電極表面，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(4)滴加5PL、質(zhì)量分數(shù)為0.2%的牛血清白蛋白BSA溶液至電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(5)滴加5μ?、0.5 pg/mL"lO ng/mL的一系列不同濃度的乳腺癌標志物標準溶液至電極表面，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(6)滴加5μ?、2 mg/mL的檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液至電極表面，置于4 V冰箱中晾干，制得一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OOgPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器。
[0019]實施例3 —種基于羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OCIgPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器的制備方法
(1)將直徑為3?5mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將6μ?、3 mg/mL羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液滴涂在電極表面，滴加6 μ?、含有0.4 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS的混合溶液至電極表面，待電極微干；
(3)滴加6μ?、14 Pg/mL的乳腺癌標志物捕獲抗體Ab1溶液至電極表面，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(4)滴加6PL、質(zhì)量分數(shù)為0.3%的牛血清白蛋白BSA溶液至電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(5)滴加6μ?、0.5 pg/mL"lO ng/mL的一系列不同濃度的乳腺癌標志物標準溶液至電極表面，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干；
(6)滴加6μ?、3 mg/mL的檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液至電極表面，置于4 V冰箱中晾干，制得一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe3O4OOgPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器。
[0020]實施例4檢測抗體孵化物Fe3O4OCIgPd-Ab2溶液的制備
(1)羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液的制備
將I mg羧基化多壁碳納米管加入到I mL、0.1%的殼聚糖溶液中，超聲分散10 min，將溶液保存在4 °C下備用；所述0.1%的殼聚糖溶液，是將I g的殼聚糖溶于10 mL、0.02 mo I/L的稀鹽酸溶液制得；
(2)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的制備
1)鈀納米顆粒溶液的制備
將0.20 mmol Na2PdCl4和0.15mmoI檸檬酸三鈉，溶于20 mL超純水中，立即加入0.6mL、0.0lmoVLNaBH4溶液，持續(xù)攪拌25s，溶液變?yōu)樽睾谏?，制得鈀納米顆粒溶液；
2)Fe3O4磁性微球的制備
將0.75 g FeCl3.6H20溶解于75 mL乙二醇中，磁力攪拌0.5 h，得到亮黃色的溶液，加入2.6g的乙酸鈉，攪拌0.5 h，將得到的溶液移至200 mL聚四氟乙烯襯里的高壓反應(yīng)釜中，在180°C高壓反應(yīng)釜中密封加熱12 h，冷卻至室溫，將制得的黑色磁微球用磁鐵收集，依次用乙醇和超純水沖洗6次，在45°C真空條件下干燥12 h，制得Fe3O4磁性微球；
3)Fe3O4OC磁性微球的制備
將0.15g的Fe3O4磁性微球加入到150 mL、0.08 mol/L HNO3溶液中，超聲處理10 min,超純水沖洗，處理后的Fe3O4磁性微球與0.4 mol/L葡萄糖溶液共混，分散并超聲處理10min，得到的懸浮液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，在180 °C下加熱5h，冷卻至室溫，用磁鐵分離，超純水沖洗6次，50 1:真空條件下干燥12 h，制得Fe3O4OC磁性微球；
4)檢測抗體標記物Fe3O4OClgPd磁性微球的制備
將8 mg的Fe3O4OC磁微球分散于20 mL、含有1.0X 10_2 mol/L三羥甲基氨基甲烷和2.0X10—2 mol/L NaCl的質(zhì)量分數(shù)為0.10%聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA的水溶液中，攪拌40 min，剩余的聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA用磁鐵移除；吸收了聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽I3DDA的微球用超純水沖洗3次，將此微球分散于12 mL鈀納米顆粒溶液中，攪拌40 min,利用磁鐵將上清液分離，所得固體用超純水沖洗3次，在50 1:真空條件下干燥12 h,制得檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球；
5)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的制備
將I mL、8Pg/mL的乳腺癌標志物檢測抗體Ab2溶液，加入到2 mg檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球中，4 °C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h ;利用磁鐵分離得到固體，向該固體中加入I mL、pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，制得核殼檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液，4 °C下保存?zhèn)溆谩?br> [0021]實施例5檢測抗體孵化物Fe3O4OCIgPd-Ab2溶液的制備
(1)羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液的制備
將2 mg羧基化多壁碳納米管加入到I mL、0.1%的殼聚糖溶液中，超聲分散15min，將溶液保存在4 °C下備用；所述0.1%的殼聚糖溶液，是將I g的殼聚糖溶于10 mL、0.02 mol/L的稀鹽酸溶液制得；
(2)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的制備
I)鈀納米顆粒溶液的制備
將0.25 mmol Na2PdCl4和0.25 mmol檸檬酸三鈉，溶于20 mL超純水中，立即加入0.6mL、0.02 mol/LNaBH4溶液，持續(xù)攪拌30 s，溶液變?yōu)樽睾谏?，制得鈀納米顆粒溶液；
2)Fe3O4磁性微球的制備
將1.50 g FeCl3.6H20溶解于75 mL乙二醇中，磁力攪拌0.75 h，得到亮黃色的溶液，加入3.6 g的乙酸鈉，攪拌0.8 h，將得到的溶液移至200 mL聚四氟乙烯襯里的高壓反應(yīng)釜中，在200°C高壓反應(yīng)釜中密封加熱18 h，冷卻至室溫，將制得的黑色磁微球用磁鐵收集，依次用乙醇和超純水沖洗6次，在50 1:真空條件下干燥12 h，制得Fe3O4磁性微球；
3)Fe3O4OC磁性微球的制備
將0.20 g的Fe3O4磁性微球加入到200 mL、0.10 mol/L HNO3溶液中，超聲處理12min，超純水沖洗，處理后的Fe3O4磁性微球與0.5 mol/L葡萄糖溶液共混，分散并超聲處理12min，得到的懸浮液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，在180 °C下加熱6 h，冷卻至室溫，用磁鐵分離，超純水沖洗6次，50 1:真空條件下干燥12 h，制得Fe3O4OC磁性微球；
4)檢測抗體標記物Fe3O4OClgPd磁性微球的制備
將10 mg的Fe3O4OC磁微球分散于20 mL、含有2.0X 10_2 mol/L三羥甲基氨基甲烷和2.0X 10_2 mol/L NaCl的質(zhì)量分數(shù)為0.20%聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽I3DDA的水溶液中，攪拌40 min，剩余的聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA用磁鐵移除；吸收了聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽I3DDA的微球用超純水沖洗4次，將此微球分散于15mL鈀納米顆粒溶液中，攪拌40 min,利用磁鐵將上清液分離，所得固體用超純水沖洗3次，在50 1:真空條件下干燥12 h,制得檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球；
5)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的制備
將I mUlOPg/mL的乳腺癌標志物檢測抗體Ab2溶液，加入到2 mg檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球中，4 °C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h ;利用磁鐵分離得到固體，向該固體中加入I mL、pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，制得核殼檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液，4 °C下保存?zhèn)溆谩?br> [0022]實施例6檢測抗體孵化物Fe3O4OCIgPd-Ab2溶液的制備
(1)羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液的制備
將3 mg羧基化多壁碳納米管加入到I mL、0.1%的殼聚糖溶液中，超聲分散20 min，將溶液保存在4 °C下備用；所述0.1%的殼聚糖溶液，是將I g的殼聚糖溶于10 mL、0.02 mol/L的稀鹽酸溶液制得；
(2)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的制備
1)鈀納米顆粒溶液的制備
將0.30 mmol Na2PdCl4和0.35 mmol檸檬酸三鈉，溶于20 mL超純水中，立即加入0.6mL、0.03 mol/LNaBH4溶液，持續(xù)攪拌35 S，溶液變?yōu)樽睾谏?，制得鈀納米顆粒溶液；
2)Fe3O4磁性微球的制備
將1.85 g FeCl3.6H20溶解于75 mL乙二醇中，磁力攪拌I h，得到亮黃色的溶液，力口入4.6 g的乙酸鈉，攪拌I h，將得到的溶液移至200 mL聚四氟乙烯襯里的高壓反應(yīng)釜中，在220 1:高壓反應(yīng)釜中密封加熱24 h，冷卻至室溫，將制得的黑色磁微球用磁鐵收集，依次用乙醇和超純水沖洗6次，在55 1:真空條件下干燥12 h，制得Fe3O4磁性微球；
3)Fe3O4OC磁性微球的制備
將0.25 g的Fe3O4磁性微球加入到240 mL、0.12 mol/L HNO3溶液中，超聲處理15 min,超純水沖洗，處理后的Fe3O4磁性微球與0.6 mol/L葡萄糖溶液共混,分散并超聲處理15min，得到的懸浮液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，在180 °C下加熱7 h，冷卻至室溫，用磁鐵分離，超純水沖洗6次，50 1:真空條件下干燥12 h，制得Fe3O4OC磁性微球；
4)檢測抗體標記物Fe3O4OClgPd磁性微球的制備
將12 mg的Fe3O4OC磁微球分散于20 mL、含有3.0X 10_2 mol/L三羥甲基氨基甲烷和2.0X 10_2 mol/L NaCl的質(zhì)量分數(shù)為0.30%聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽I3DDA的水溶液中，攪拌40 min，剩余的聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA用磁鐵移除；吸收了聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽I3DDA的微球用超純水沖洗6次，將此微球分散于18 mL鈀納米顆粒溶液中，攪拌40 min,利用磁鐵將上清液分離，所得固體用超純水沖洗3次，在50 1:真空條件下干燥12 h,制得檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球；
5)檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液的制備
將I mL、12 Pg/mL的乳腺癌標志物檢測抗體Ab2溶液，加入到2 mg檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球中，4 °C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h ;利用磁鐵分離得到固體，向該固體中加入I mL、pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，制得核殼檢測抗體孵化物Fe3O4OClgPd-Ab2溶液，4 °C下保存?zhèn)溆谩?br> [0023]實施例7 CEA的檢測步驟
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、pH=5.0?8.5磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；
(2)用計時電流法對CEA進行檢測，輸入電壓為-0.4 V，取樣間隔0.1 S，運行時間250
s ；
(3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL ρΗ=5.(Γ8.5磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL,5^10 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化；
(4)線性范圍為0.50 pg/mL?10 ng/mL ;對CA153檢測限可達0.16 pg/mL。
[0024]實施例8 CA153的檢測步驟
按照實施例7 (I)?(3)的步驟進行測定，得到CA153的線性范圍為0.45 pg/mL?10ng/mL ;對 CA153 檢測限可達 0.12 pg/mL。
[0025]實施例9CA549的檢測步驟
按照實施例7 (I)?(3)的步驟進行測定，得到CA549的線性范圍為0.30 pg/mL?10ng/mL ；CA549 檢測限可達 0.11 pg/mL。
[0026]實施例10 hCG的檢測步驟
按照實施例7 (1Γ (3)的步驟進行測定，得到hCG的線性范圍為0.10 pg/πιΠθ ng/mL ;hCG 檢測限可達 0.033 pg/mL。
[0027]實施例11降鈣素的檢測步驟
按照實施例7 (I)?(3)的步驟進行測定，得到降鈣素的線性范圍為0.50 pg/πιΠθng/mL ;降|丐素檢測限可達0.15 pg/mL。
[0028]實施例12鐵蛋白的檢測步驟
按照實施例7 (I)?(3)的步驟進行測定，得到鐵蛋白的線性范圍為0.50 pg/πιΠθng/mL ;鐵蛋白檢測限可達0.16 pg/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe304@C@Pd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下: (1)將直徑為3?5mm的玻碳電極用A1203拋光粉打磨，超純水清洗干凈； (2)將4?6μ?,Γ3 mg/mL羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液滴涂在電極表面，滴加Γ6μ?、含有0.Γ0.4 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS的混合溶液至電極表面，待電極微干； (3)滴加4飛μ?、6?14Pg/mL的乳腺癌標志物捕獲抗體溶液至電極表面，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干； (4)滴加4飛PL、質(zhì)量分數(shù)為0.19Γ0.3%的牛血清白蛋白BSA溶液至電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干； (5)滴加4飛μ?、0.5 pg/mL"lO ng/mL的一系列不同濃度的乳腺癌標志物標準溶液至電極表面，超純水沖洗，4 °C冰箱中晾干； (6)滴加4飛μ?,Γ3mg/mL的檢測抗體孵化物Fe304@C(gPd-Ab2溶液至電極表面，置于4 °C冰箱中晾干，制得一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe304@C(gPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe304@C@Pd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器的制備方法，所述檢測抗體孵化物Fe304@C@Pd-Ab2溶液，其特征在于，制備步驟如下: (1)羧基化多壁碳納米管的殼聚糖溶液的制備 將廣3 mg羧基化多壁碳納米管加入到1 mL、0.1%的殼聚糖溶液中，超聲分散1(Γ20min，將溶液保存在4 °C下備用；所述0.1%的殼聚糖溶液，是將1 g的殼聚糖溶于10 mL、0.02 mol/L的稀鹽酸溶液制得； (2)檢測抗體孵化物Fe304@C@Pd-Ab2溶液的制備 1)鈀納米顆粒溶液的制備 將0.2(H).30 mmol Na2PdCl4和0.15?0.35 mmol檸檬酸三鈉，溶于20 mL超純水中，立即加入0.6 mL.0.0r0.03 mol/LNaBH4溶液，持續(xù)攪拌25?35 s，溶液變?yōu)樽睾谏?，制得鈀納米顆粒溶液； 2)Fe304磁性微球的制備 將0.75?1.85 g FeCl3.6H20溶解于75 mL乙二醇中，磁力攪拌0.5?1 h，得到亮黃色的溶液，加入2.6?4.6 g的乙酸鈉，攪拌0.5?1 h，將得到的溶液移至200 mL聚四氟乙烯襯里的高壓反應(yīng)釜中，在18(Γ220 1:高壓反應(yīng)釜中密封加熱12?24 h，冷卻至室溫，將制得的黑色磁微球用磁鐵收集，依次用乙醇和超純水沖洗6次，在45飛5 1:真空條件下干燥12 h，制得Fe304磁性微球； 3)Fe304iC磁性微球的制備 將0.15?0.25 g的Fe304磁性微球加入到150?240 mL、0.08?0.12 mol/L ΗΝ03溶液中，超聲處理1(T15 min,超純水沖洗，處理后的Fe304磁性微球與0.4^0.6 mol/L葡萄糖溶液共混，分散并超聲處理1(T15 min，得到的懸浮液轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜中，在180 °C下加熱5?7h，冷卻至室溫，用磁鐵分離，超純水沖洗6次，50 1:真空條件下干燥12 h，制得Fe304@C磁性微球； 4)檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球的制備 將8?12 mg的Fe304@C磁微球分散于20 mL、含有1.0X 1(Γ2?3.0X 1(T2 mol/L三羥甲基氨基甲烷和2.ΟΧΙΟ—2 mol/L NaCl的質(zhì)量分數(shù)為0.10%?0.30%聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA的水溶液中，攪拌40 min，剩余的聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA用磁鐵移除；吸收了聚二烯丙烯基二甲基胺鹽酸鹽TODA的微球用超純水沖洗3飛次，將此微球分散于12?18 mL鈀納米顆粒溶液中，攪拌40 min，利用磁鐵將上清液分離，所得固體用超純水沖洗3次，在50 1:真空條件下干燥12 h，制得檢測抗體標記物Fe304@C(gPd磁性微球； 5)檢測抗體孵化物Fe304@C(gPd-Ab2溶液的制備 將1 mL、8?12 Pg/mL的乳腺癌標志物檢測抗體Ab2溶液，加入到2 mg檢測抗體標記物Fe304@C@Pd磁性微球中，4 °C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h ;利用磁鐵分離得到固體，向該固體中加入1 mL、pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，制得核殼檢測抗體孵化物Fe304@C(gPd-Ab2溶液，4 °C下保存?zhèn)溆谩?br> 3.如權(quán)利要求1所述的制備方法制備的一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe304@C@Pd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器，其特征在于，用于乳腺癌標志物的檢測，檢測步驟如下: (1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、pH=5.0?8.5磷酸鹽緩沖溶液中進行測試； (2)用計時電流法對乳腺癌標志物進行檢測，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 s，運行時間250 s ； (3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL ρΗ=5.(Γ8.5磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL,5^10 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。
4.如權(quán)利要求1?3所述的一種基于羧基化多壁碳納米管與Fe304@C(gPd構(gòu)建的乳腺癌標志物免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述乳腺癌標志物選自下列之一:CA153、CEA、CA549、hCG、降鈣素、鐵蛋白。
【文檔編號】G01N33/543GK104407141SQ201410742743
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】紀磊, 杜斌, 閆濤, 王曉東, 魏琴, 李月云, 馬洪敏, 曹偉, 龐雪輝, 吳丹, 范大偉, 胡麗華 申請人:濟南大學(xué)