基于蛋白核小球藻的環(huán)境污染物時(shí)間毒性微板分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于蛋白核小球藻的環(huán)境污染物時(shí)間毒性微板分析方法，以淡水綠藻中的蛋白核小球藻為受試生物，以96孔透明微板為載體，在傳統(tǒng)化合物濃度-效應(yīng)關(guān)系中引入時(shí)間因素，通過測定部分環(huán)境污染物對蛋白核小球藻的時(shí)間依賴性毒性，發(fā)現(xiàn)所有測定的污染物均具有明顯的時(shí)間依賴特征，再利用最小二乘樣條函數(shù)逼近法構(gòu)建濃度-時(shí)間-效應(yīng)曲面，了解污染物隨濃度和時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)毒性效應(yīng)。本發(fā)明克服傳統(tǒng)毒性分析方法中只分析污染物對暴露生物在某一暴露時(shí)間終點(diǎn)的累積效應(yīng)的不足，有助于全面的了解污染物的毒性效應(yīng)，而且能更深入的了解污染物的毒理作用機(jī)制與途徑，更能體現(xiàn)實(shí)際環(huán)境中污染物暴露的現(xiàn)象和信息。
【專利說明】基于蛋白核小球藻的環(huán)境污染物時(shí)間毒性微板分析方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境污染物毒性檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種基于蛋白核小球藻的環(huán) 境污染物時(shí)間毒性微板分析方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，人類的生產(chǎn)和生活不間斷地排放著大量的種類繁多的污染物進(jìn)入環(huán)境，對 生態(tài)環(huán)境和生物體產(chǎn)生著持續(xù)的毒害作用。因而，污染物毒性的檢測除考慮濃度因素外，更 應(yīng)該著眼于污染物對暴露生物隨著時(shí)間而變化的動(dòng)態(tài)效應(yīng)，即同時(shí)觀察濃度和時(shí)間兩個(gè)因 素在污染物對生物體毒性變化過程中起的重要作用。
[0003] 環(huán)境中的污染物對水生生物的毒性效應(yīng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，同時(shí)因其在環(huán)境 中代謝轉(zhuǎn)化等因素的也會(huì)影響污染物對生物的毒性效應(yīng)，而基于污染物對暴露生物在某一 特殊時(shí)間終點(diǎn)的毒性效應(yīng)如短期效應(yīng)和長期效應(yīng)只是某一時(shí)間段的累積效應(yīng)，不易觀測到 污染物對生物體在整個(gè)暴露期間毒性效應(yīng)發(fā)生的變化，更不易觀測到污染物對暴露生物的 真實(shí)的毒性作用規(guī)律和作用機(jī)制。因此，檢測環(huán)境污染物對暴露生物隨時(shí)間而變化的動(dòng)態(tài) 效應(yīng)規(guī)律與作用機(jī)制，不僅有助于全面的了解污染物的毒性效應(yīng)，而且能更深入的了解污 染物的毒理作用機(jī)制與途徑，更能體現(xiàn)實(shí)際環(huán)境中污染物暴露的現(xiàn)象和信息。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提出了一種基于蛋白核小球藻的環(huán)境污染物時(shí)間毒性微板分析方法，相對 于傳統(tǒng)毒性分析方法，強(qiáng)調(diào)了時(shí)間因素，克服傳統(tǒng)毒性分析方法中只分析污染物對暴露生 物在某一暴露時(shí)間終點(diǎn)的累積效應(yīng)的不足，有助于全面的了解污染物的毒性效應(yīng)，而且能 更深入的了解污染物的毒理作用機(jī)制與途徑，更能體現(xiàn)實(shí)際環(huán)境中污染物暴露的現(xiàn)象和信 肩、。
[0005] 本發(fā)明提出的一種基于蛋白核小球藻的環(huán)境污染物時(shí)間毒性微板分析方法，包括 如下步驟：
[0006] Sl、培養(yǎng)得到OD69tl = 0· 25-0. 35的蛋白核小球藻液；
[0007] S2、取m個(gè)8行X 12列的96孔透明微板；在任一個(gè)微板中，選取最外圍的36個(gè)微 孔并定義為第一微孔，在36個(gè)第一微孔中分別加入200 μ L蒸餾水，在外圍之內(nèi)選取12個(gè) 微孔并定義為第二微孔，在12個(gè)第二微孔中分別加入100 μ L蒸餾水和100 μ L由Sl得到 的蛋白核小球藻液，將剩余48個(gè)微孔定義為第三微孔，將48個(gè)第三微孔均分為12組并分 別標(biāo)記為j = 1、2、…、12,向第j組的4個(gè)第三微孔中分別加入100 μ L濃度為Cj的受試 樣品溶液和100 μ L由Sl得到的蛋白核小球藻液；
[0008] 其中，Cj = f^1 .Cq,式中j為各組相應(yīng)的標(biāo)號，j = 1、2、…、12，CQ為受試樣品的 儲(chǔ)備液濃度，f為受試樣品的稀釋因子，而f可由公式f = (cycH)1/(Iri)推導(dǎo)得到，式中(^為 受試樣品的最低效應(yīng)濃度，C h為受試樣品的最高效應(yīng)濃度，η為受試樣品溶液濃度梯度的數(shù) 目，即η = 12 ;
[0009] S3、將m個(gè)微板置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)Tx時(shí)，測定每個(gè)微板上第三微 孔的j組在Tx時(shí)的OD 69tl平均值并記為ODjla, x，并測定每個(gè)微板上第二微孔在Tx時(shí)的OD69tl 平均值并記為〇〇3!自,!￡，其中1'!￡ = 011、丨11、2丨11、牡11、6也、?、961^為正整數(shù)；
[0010] S4、根據(jù)公式μτ = (ODj組,x-〇Dj組,d) /ODj組,x計(jì)算得到濃度為Cj的受試樣品處 理蛋白核小球藻在T時(shí)的平均生長速率μ p，根據(jù)公式Uckt= (0D 空白，x_〇D空白，η) /OD空白，χ 計(jì)算得到第二微孔中蛋白核小球藻在T時(shí)的平均生長速率μ μ，式中X > 2 ;
[0011] 以受試樣品對蛋白核小球藻的生長速率μ P的抑制率Ey為毒性效應(yīng)，通過公式 Ej,T = (1-μ ρ/μ μ) X 100%計(jì)算在培養(yǎng)時(shí)間為Tx時(shí)濃度為&的受試樣品的毒性，得到受 試樣品的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，對所述濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性最小二乘擬合得到濃度-效 應(yīng)函數(shù)，利用濃度-效應(yīng)函數(shù)的反函數(shù)進(jìn)而計(jì)算得到不同受試樣品溶液濃度下的效應(yīng)值。
[0012] S2中，m -般取3,以保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)再現(xiàn)性和成本、效率達(dá)到平衡。
[0013] S2中，在36個(gè)第一微孔中分別加入200μ L蒸餾水，可有效的克服實(shí)驗(yàn)中的邊緣效 應(yīng)，大幅降低誤差。
[0014] S2中的Ch為通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定暴露96小時(shí)后最高受試樣品溶液濃度，即對微板上 蛋白核小球藻的生長抑制率（即最高抑制率）達(dá)到50?100%的受試樣品溶液濃度。
[0015] S2中的Q為通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定暴露96小時(shí)后最低受試樣品溶液濃度，即對微板上 蛋白核小球藻的生長抑制率（即低抑制率）為-5%?+5%的受試樣品溶液濃度。
[0016] 優(yōu)選地，Sl中，所述培養(yǎng)得到OD69tl = 0. 25-0. 35的蛋白核小球藻液具體如下：在 新鮮的培養(yǎng)基中接入蛋白核小球藻的藻種，使接種后蛋白核小球藻的OD69tl = 0. 15±0. 01， 置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，光照培養(yǎng)箱的溫度為25± I °C，光照培養(yǎng)箱的光照度為 50001ux，得到OD69tl = 0. 25-0. 35的蛋白核小球藻液。
[0017] 培養(yǎng)過程中可能會(huì)因?yàn)榄h(huán)境等因素使得培養(yǎng)箱內(nèi)部溫度會(huì)稍高于或低于25°C，如 果稍高于或低于25度，培養(yǎng)箱會(huì)自動(dòng)降溫或升溫至25°C，但幅度不會(huì)超過1°C。
[0018] 優(yōu)選地，S2中，在任一個(gè)微板中，第二微孔為第6列和第7列所在列與第2行、第3 行、第4行、第5行、第6行、第7行所在列相交的微孔，使得第二微孔位于每塊微板的中央， 可大大降低本發(fā)明的誤差。
[0019] 優(yōu)選地，S2中，在任一個(gè)微板中，第三微孔中第j組的四個(gè)微孔為任一行與第2列、 第3列、第8列和第9列相交的微孔，或?yàn)槿我恍信c第4列、第5列、第10列和第11列相交 的微孔，使第三微孔中的第j組均分布在第二微孔的兩側(cè)，大大降低了本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)誤差， 而且大幅提高本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的再現(xiàn)性。
[0020] 優(yōu)選地，S3中，光照培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為：光照培養(yǎng)箱的溫度為25 ±1°C，光照培 養(yǎng)箱的光照度為50001UX。
[0021] 經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)可知蛋白核小球藻的紫外-可吸收光譜圖如圖2所示，蛋白核小球藻 在波長為690nm光照環(huán)境下的OD值達(dá)到峰值，便于檢測。
[0022] 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中對蛋白核小球藻進(jìn)行培養(yǎng)得到的生長速率和時(shí)間的數(shù)據(jù)在直角坐 標(biāo)系中進(jìn)行曲線擬合，如圖3所示，可以得出蛋白核小球藻在培養(yǎng)72h時(shí)達(dá)到最高值，即蛋 白核小球藻在〇_72h時(shí)一直處于對數(shù)增長期；繼續(xù)培養(yǎng)，蛋白核小球藻的生長速率下降，當(dāng) 培養(yǎng)至96h時(shí)，蛋白核小球藻的生長速率與蛋白核小球藻的初始生長速率相同，即蛋白核 小球藻在72-96h時(shí)處于靜止期，如繼續(xù)培養(yǎng)，則蛋白核小球藻進(jìn)入衰落期，從而確定本發(fā) 明在S3中對蛋白核小球藻檢測時(shí)間為0-96h。
[0023] 本發(fā)明可以測定部分抗生素、離子液體、重金屬及其混合物的時(shí)間毒性。本發(fā)明與 常規(guī)96小時(shí)的微板毒性分析法測定數(shù)據(jù)對比，發(fā)現(xiàn)這些化合物及其混合物的濃度-效應(yīng)曲 線（CRC)隨著時(shí)間的延長，毒性在逐漸增加，但增加的速率不同?；旌衔锏亩拘韵嗷プ饔靡?guī) 律也隨著混合物的組分和暴露時(shí)間發(fā)生很大的變化，有的混合物隨著暴露時(shí)間的延長，協(xié) 同或拮抗作用逐漸增強(qiáng)，而有的混合物毒性相互作用隨著時(shí)間甚至發(fā)生了作用類型的變化 如從協(xié)同逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檗卓够驈霓卓怪饾u轉(zhuǎn)變?yōu)閰f(xié)同。本發(fā)明可以更為合理的評價(jià)污染物的 毒性和揭示環(huán)境污染物毒性作用規(guī)律與機(jī)制。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明提出的一種基于蛋白核小球藻的環(huán)境污染物時(shí)間毒性微板分析方 法中96孔透明微板分組示意圖，其中1為第一微孔，2為第二微孔，j = 1、2、"·、12為第三 微孔。
[0025] 圖2為蛋白核小球藻的紫外-可見吸收光譜圖。
[0026] 圖3為蛋白核小球藻在微孔板上的同步生長速率圖。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面，通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 采用本發(fā)明測定抗生素硫酸鏈霉素的時(shí)間毒性，包括以下步驟：
[0030] S1、在新鮮的培養(yǎng)基中接入蛋白核小球藻的藻種，使接種后蛋白核小球藻的OD69tl =0. 14,置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，光照培養(yǎng)箱的溫度為25±1°C，光照培養(yǎng)箱的光照度 為50001UX，得到OD69tl = 0· 35的蛋白核小球藻液；
[0031] S2、參照圖1，圖1為本發(fā)明提出的一種基于蛋白核小球藻的環(huán)境污染物時(shí)間毒性 微板分析方法中96孔透明微板分組示意圖，取3個(gè)8行X 12列的96孔透明微板；在任一 個(gè)微板中，選取最外圍的36個(gè)微孔并定義為第一微孔，在36個(gè)第一微孔中分別加入200 μ L 蒸餾水，選取第6列和第7列所在列與第2行、第3行、第4行、第5行、第6行、第7行所在 列相交形成的12個(gè)微孔定義為第二微孔，在12個(gè)第二微孔中分別加入100 μ L蒸餾水和 100 μ L由Sl得到的蛋白核小球藻液，將剩余48個(gè)微孔定義為第三微孔，將48個(gè)第三微孔 均分為12組并分別標(biāo)記為j = 1、2、…、12,向第j組的4個(gè)第三微孔中分別加入100 μ L 濃度為G的硫酸鏈霉素溶液和100μ L由SI得到的蛋白核小球藻液，其中第三微孔中第j 組的四個(gè)微孔為任一行與第2列、第3列、第8列和第9列相交的微孔，或?yàn)槿我恍信c第4 列、第5列、第10列和第11列相交的微孔；
[0032] 其中，Cj =戶+ 1 ·(；，式中j為各組相應(yīng)的標(biāo)號，j = 1、2、…、12，CQ為硫酸鏈霉素 的儲(chǔ)備液濃度，f為硫酸鏈霉素的稀釋因子，而f可由公式f = (Q/CH)1/(Iri)推導(dǎo)得到，式中 Q為硫酸鏈霉素的最低效應(yīng)濃度，Ch為硫酸鏈霉素的最高效應(yīng)濃度，η為硫酸鏈霉素溶液濃 度梯度的數(shù)目，即η = 12,通過暴露96小時(shí)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，得到硫酸鏈霉素溶液的儲(chǔ)備液濃度Ctl 為7. 02 X ΙθΛιοΙ/L，稀釋因子f為0. 6,從而確定硫酸鏈霉素溶液的12個(gè)濃度梯度；
[0033] S3、將3個(gè)微板置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，光照培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為：光照培養(yǎng) 箱的溫度為25土 1°C，光照培養(yǎng)箱的光照度為50001ux，在培養(yǎng)Tx時(shí)，測定每個(gè)微板上第三 微孔的j組在Tx時(shí)的OD69tl平均值并記為ODjla,x，并測定每個(gè)微板上第二微孔在T x時(shí)的OD69tl 平均值并記為OD空自,x，其中Tx = 0h、12h、24h、48h、72h、96h，X為正整數(shù)；
[0034] S4、根據(jù)公式μ j, T = (ODj組,x-〇Dj組,d) /ODj組,x計(jì)算得到濃度為Cj的硫酸鏈霉素 處理蛋白核小球藻在T時(shí)的平均生長速率μ」, τ，根據(jù)公式μ。,T= (0D空白,X-0D空白,^1VOD空 θ,χ計(jì)算得到第二微孔中蛋白核小球藻在T時(shí)的平均生長速率μ M，式中X > 2 ;
[0035] 以硫酸鏈霉素對蛋白核小球藻的生長速率μ」,τ的抑制率Ej, τ為毒性效應(yīng)，通過公 式Ep = (1-μρ/μ &τ) X 100%計(jì)算在培養(yǎng)時(shí)間為Tx時(shí)濃度為&的硫酸鏈霉素的毒性，得 到硫酸鏈霉素的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，對所述濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性最小二乘擬合得到濃 度-效應(yīng)函數(shù)，利用濃度-效應(yīng)函數(shù)的反函數(shù)進(jìn)而計(jì)算得到不同硫酸鏈霉素溶液濃度下的 效應(yīng)值即效應(yīng)濃度，如半數(shù)效應(yīng)濃度（EC 5tl)，參照函數(shù)擬合的確定系數(shù)，以擬合值與實(shí)驗(yàn)值 相關(guān)性最大，即擬合值與實(shí)際測試值均方根誤差最小者為最優(yōu)函數(shù)關(guān)系。
[0036] 硫酸鏈霉素溶液各濃度在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)對蛋白核小球藻生長抑制率E的原始數(shù) 據(jù)如表1所示。
[0037] 表1硫酸鏈霉素的時(shí)間-毒性數(shù)據(jù)
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于蛋白核小球藻的環(huán)境污染物時(shí)間毒性微板分析方法，其特征在于，包括如 下步驟： 51、 培養(yǎng)得到〇D69Q = 0? 25-0. 35的蛋白核小球藻液； 52、 取m個(gè)8行X 12列的96孔透明微板；在任一個(gè)微板中，選取最外圍的36個(gè)微孔并 定義為第一微孔，在36個(gè)第一微孔中分別加入200 ii L蒸餾水，在外圍之內(nèi)選取12個(gè)微孔 并定義為第二微孔，在12個(gè)第二微孔中分別加入100 y L蒸餾水和100 ii L由S1得到的蛋 白核小球藻液，將剩余48個(gè)微孔定義為第三微孔，將48個(gè)第三微孔均分為12組并分別標(biāo) 記為j = 1、2、…、12,向第j組的4個(gè)第三微孔中分別加入100ii L濃度為Cj的受試樣品 溶液和100 ii L由S1得到的蛋白核小球藻液； 其中，Cj = f^1 ?〇!，式中j為各組相應(yīng)的標(biāo)號，j = 1、2、…、12，CQ為受試樣品的儲(chǔ)備 液濃度，f為受試樣品的稀釋因子，而f?可由公式f = (cycH)1/(Iri)推導(dǎo)得到，式中Q為受試 樣品的最低效應(yīng)濃度，CHS受試樣品的最高效應(yīng)濃度，n為受試樣品溶液濃度梯度的數(shù)目， 即 n = 12 ; 53、 將m個(gè)微板置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)Tx時(shí)，測定每個(gè)微板上第三微孔的 j組在Tx時(shí)的0D_平均值并記為0DjS, x，并測定每個(gè)微板上第二微孔在Tx時(shí)的0D_平均 值并記為0D空白,x，其中Tx = 0h、t h、2t h、4t h、6t h、…、96h，x為正整數(shù)； 54、 根據(jù)公式y(tǒng)T = (〇Dj x-〇Dj h) A?」x計(jì)算得到濃度為Cj的受試樣品處理蛋 白核小球藻在T時(shí)的平均生長速率，根據(jù)公式y(tǒng) u = (0D 空白，x_〇D空白，x-j /0D空白，x 計(jì)算 得到第二微孔中蛋白核小球藻在T時(shí)的平均生長速率y ^，式中x > 2 ; 以受試樣品對蛋白核小球藻的生長速率T的抑制率& T為毒性效應(yīng)，通過公式Ej, T=(1-h,T/ii u) X 100%計(jì)算在培養(yǎng)時(shí)間為Tx時(shí)濃度為q的受試樣品的毒性，得到受試樣 品的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，對所述濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性最小二乘擬合得到濃度-效應(yīng)函 數(shù)，利用濃度-效應(yīng)函數(shù)的反函數(shù)進(jìn)而計(jì)算得到不同受試樣品溶液濃度下的效應(yīng)值。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于蛋白核小球藻的環(huán)境污染物時(shí)間毒性微板分析方法，其特 征在于，S1中，所述培養(yǎng)得到0D_ = 0. 25-0. 35的蛋白核小球藻液具體如下：在新鮮的培 養(yǎng)基中接入蛋白核小球藻的藻種，使接種后蛋白核小球藻的〇D_ = 0. 15±0. 01，置于光照 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，光照培養(yǎng)箱的溫度為25 土 1°C，光照培養(yǎng)箱的光照度為50001UX，得到 0D69Q = 0? 25-0. 35的蛋白核小球藻液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述基于蛋白核小球藻的環(huán)境污染物時(shí)間毒性微板分析方法， 其特征在于，S2中，在任一個(gè)微板中，第二微孔為第6列和第7列所在列與第2行、第3行、 第4行、第5行、第6行、第7行所在列相交的微孔。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述基于蛋白核小球藻的環(huán)境污染物時(shí)間毒性微板分析方 法，其特征在于，S2中，在任一個(gè)微板中，第三微孔中第j組的四個(gè)微孔為任一行與第2列、 第3列、第8列和第9列相交的微孔，或?yàn)槿我恍信c第4列、第5列、第10列和第11列相交 的微孔。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述基于蛋白核小球藻的環(huán)境污染物時(shí)間毒性微板分析 方法，其特征在于，S3中，光照培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為：光照培養(yǎng)箱的溫度為25± 1 °C，光照培 養(yǎng)箱的光照度為50001UX。
【文檔編號】G01N21/31GK104390920SQ201410704971
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】張瑾, 陳瓊, 朱曙光, 凌琪, 劉磊 申請人:安徽建筑大學(xué)