一種檢測鄰苯二甲酸單甲酯的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測鄰苯二甲酸單甲酯的方法及試劑盒，屬于生物檢測領(lǐng)域。本發(fā)明通過化學(xué)方法合成了MMP人工抗原，再用MMP人工抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合篩選得到分泌MMP單克隆抗體的雜交瘤細胞株；再以合成的MMP人工抗原作為包被抗原、MMP單克隆抗體作為一抗創(chuàng)建了檢測MMP的間接競爭ELISA方法和試劑盒，可用于樣品中的MMP測定，該方法具有操作簡單、費用低廉、快速靈敏等優(yōu)點。
【專利說明】一種檢測鄰苯二甲酸單甲酯的方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及一種快速、高效、廉價檢測鄰苯二甲酸單甲酯 (MMP)含量的免疫學(xué)方法及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸單甲醋（Monomethyl phthate)，簡稱MMP，分子式為C9H8O4,分子量為 180,鄰苯二甲酸酯類化合物（PAEs)，是鄰苯二甲酸二甲酯的最終代謝產(chǎn)物。研宄發(fā)現(xiàn)，PAEs 為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有生殖毒性、致癌、致畸等遺傳毒性，因而各國均加強了對該物質(zhì) 的檢測力度。動物實驗表明：當(dāng)動物口服鄰苯二甲酸二丁酯（DBP)48h之內(nèi)，有大約80%的 DBP代謝到尿液中，主要產(chǎn)物為鄰苯二甲酸單丁酯（MBP)，比例為88%，代謝物主要以結(jié)合 態(tài)形式存在。有研宄者對30人的尿液進行檢測發(fā)現(xiàn)尿液中的鄰苯二甲酸單酯平均含量大 小依次為鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（MEHP) >鄰苯二甲酸單甲酯（MMP) >鄰苯二甲酸單 乙酯（MEP) >鄰苯二甲酸單丁酯（MBP) >鄰苯二甲酸單丁卞酯（MBzP)，其中某一機體內(nèi)MMP 含量高達1808. 9 μ g/L。
[0003] 目前，PAEs常用的檢測方法有液相色譜法、氣相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用等，這 些方法均能在一定濃度范圍內(nèi)實現(xiàn)對MMP的檢測，但是使用上述這些方法進行檢測時大多 要對樣品進行處理，且檢測的過程復(fù)雜，費時費事，成本較高，靈敏度較低。因此本技術(shù)通過 制備MMP的單克隆抗體使用間接競爭ELISA方法實現(xiàn)對MMP含量進行快速高效大批量的檢 測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種分泌MMP單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發(fā)明的目的 還在于提供一種檢測MMP的間接競爭ELISA方法及試劑盒。
[0005] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0006] 一種分泌MMP單克隆抗體的雜交瘤細胞株，通過包含如下步驟的方法制備得到： [0007] (1)取用MMP人工抗原免疫BALB/c小鼠的脾細胞與SP2/0細胞懸液混合。
[0008] (2)離心棄上清，在聚乙二醇（PEG)作用下進行細胞融合，然后用DMEM培養(yǎng)基來終 止反應(yīng)，重復(fù)該步驟。
[0009] (3)離心棄上清，加入HAT培養(yǎng)基，鋪至細胞板中進行培養(yǎng)。
[0010] ⑷融合后第7天觀察，標(biāo)出有融合細胞的孔，記錄位置和克隆數(shù)，補加 HAT培養(yǎng) 基；2周后，全量換液，待細胞長至板底1/10時做檢測。
[0011] (5)選擇效價最高的并且對MMP具有特異性的陽性細胞進行克隆，克隆化結(jié)束后， 建株得到分泌MMP單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0012] 步驟（1)中所述的MMP人工抗原優(yōu)選通過包含如下步驟的方法合成：用5mL DMF 完全溶解72mg(4mmol)MMP，再加入120mg N-羥基丁二酰亞胺（NHS)和160mg N，K -二環(huán) 己基碳二亞胺（DCC)，常溫下攪拌12h。離心機轉(zhuǎn)速5000g離心5min收集上清。往上清中 加入IOmL含有120mg BSA的0. 2mol/L pH 9. O硼酸鹽緩沖液。在磁力攪拌器上攪拌5h。 將所得反應(yīng)液用低溫冷凍離心機l〇〇〇〇g離心5min，得到不純凈的人工抗原MMCP-BSA，再用 葡聚糖凝膠過濾得到純凈的人工抗原MMCP-BSA。
[0013] -種檢測MMP的間接競爭ELISA方法，包括如下步驟：
[0014] (1)試劑1用試劑2稀釋至2 μ g/mL，100 μ L/孔包被酶標(biāo)板，空白對照孔加100 μ L 試劑2,4°C過夜。
[0015] (2)用試劑3進行洗滌操作，每孔200 μ L洗滌90s，倒出孔內(nèi)液體，拍干，洗滌3次 后往酶標(biāo)板中加入試劑4, 250 μ L/孔，37°C溫育lh。
[0016] (3)用試劑3洗滌后，加入不同濃度的MMP標(biāo)準(zhǔn)品和試劑6各50 μ L，另外加幾孔 用50 μ L試劑5溶解的檢測樣品和50 μ L試劑6,再設(shè)幾孔陽性對照（50 μ L試劑5+50 μ L 試劑6)，37°C溫育Ih。
[0017] (4)用試劑3洗滌后，每孔加入100 yL試劑7, 37°C溫育Ih。
[0018] (5)用試劑3洗滌后，加入新鮮配制的試劑8,100 μ L/孔，室溫避光30min。
[0019] (6)每孔加50 μ L試劑9,終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定492nm處的吸光值。
[0020] (7)以MMP標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)（X)，對應(yīng)的抑制率I (%)為縱坐標(biāo)（y)，做得 y = bln (X)+a直線，抑制率I (%)通過如下公式計算得到：
[0021]

【權(quán)利要求】
1. 一種分泌鄰苯二甲酸單甲酯單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于通過包含如下 步驟的方法制備得到： (1) 取用MMP人工抗原免疫BALB/c小鼠的脾細胞與SP2/0細胞懸液混合； (2) 離心棄上清，在聚乙二醇作用下進行細胞融合，然后用DMEM培養(yǎng)基來終止反應(yīng)，重 復(fù)該步驟； (3) 離心棄上清，加入HAT培養(yǎng)基，鋪至細胞板中進行培養(yǎng)； (4) 融合后第7天觀察，標(biāo)出有融合細胞的孔，記錄位置和克隆數(shù)，補加HAT培養(yǎng)基；2 周后，全量換液，待細胞長至板底1/10時做檢測； (5) 選擇效價最高的并且對MMP具有特異性的陽性細胞進行克隆，克隆化結(jié)束后，建株 得到分泌MMP單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分泌鄰苯二甲酸單甲酯單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特 征在于：步驟（1)中所述的MMP人工抗原通過包含如下步驟的方法合成：用5mLDMF溶解 4mmolMMP，再加入120mgNHS和160mgDCC，攪拌12h;5000g離心5min收集上清，往上清 中加入10mL含有120mgBSA的0. 2mol/LpH9. 0硼酸鹽緩沖液，攪拌5h;將所得反應(yīng)液 10000g離心5min，得到不純凈的人工抗原MMCP-BSA，再用葡聚糖凝膠過濾得到純凈的人工 抗原MMCP-BSA。
3. -種檢測鄰苯二甲酸單甲酯的間接競爭ELISA方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 試劑1用試劑2稀釋至2yg/mL，100yL/孔包被酶標(biāo)板，空白對照孔加100yL試 劑2,4°C過夜； (2) 用試劑3進行洗滌操作，每孔200yL洗滌90s，倒出孔內(nèi)液體，拍干，洗滌3次后往 酶標(biāo)板中加入試劑4,250yL/孔，37°C溫育lh; (3) 用試劑3洗滌后，按如下處理加樣：1)MMP標(biāo)準(zhǔn)品：用試劑5梯度稀釋的不同濃度的 MMP標(biāo)準(zhǔn)品50yL，2)檢測樣品：用試劑5溶解的檢測樣品50yL，3)陽性對照：50yL試劑 5 ;各處理分別再加入50yL試劑6,37°C溫育lh; (4) 用試劑3洗滌后，每孔加入100yL試劑7,37°C溫育lh; (5) 用試劑3洗滌后，加入新鮮配制的試劑8,100yL/孔，室溫避光30min; (6) 每孔加50yL試劑9,終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定492nm處的吸光值； (7) 以MMP標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)（x)，對應(yīng)的抑制率I(% 為縱坐標(biāo)（y)，做得一 條y=bln(x)+a直線，抑制率I(% )通過如下公式計算得到：
式中：A為陽性對照孔的吸光值，化為含有濃度i的MMP孔的吸光值，A^為空白對照孔 的吸光值； 根據(jù)檢測樣品的吸光值計算抑制率y，代入直線即可得出檢測樣品中MMP的濃度； 上述步驟中試劑1-9分別為： 試劑1 :人工抗原MMCP-BSA; 試劑2 :0? 05mol/LpH9. 6碳酸鹽緩沖液； 試劑 3 :含 0? 05%Tween-20 的PBS; 試劑4:1 %卵清蛋白； 試劑5 :含1 %牛血清白蛋白的PBS; 試劑6 :MMP單克隆抗體； 試劑7:HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG; 試劑8 :OPD顯色液； 試劑 9 :2mol/LH2S04。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測鄰苯二甲酸單甲酯的間接競爭ELISA方法，其特征在于： 所述的MMP單克隆抗體通過包含如下步驟的方法制備得到：將1-2X106個以MMCP-BSA作為 MMP人工抗原通過權(quán)利要求1所述的方法制備的雜交瘤細胞用〇.Olmol/LpH7. 4PBS漂洗2 次，將細胞吹下，200g離心5min棄上清，再用0. 4mLPBS懸浮細胞沉淀，注射到已提前用石 蠟處理過的BALB/c小鼠腹腔內(nèi)；10-12天后無菌操作收集小鼠腹水，200g離心5min，上清 中含有單克隆抗體；通過二氧化硅吸附法除去腹水中的小顆粒物質(zhì)、殘渣和脂肪滴；辛酸/ 硫酸銨沉淀法純化腹水，在PBS中透析4-5天，得到純化腹水，獲得MMP單克隆抗體。
5. -種檢測鄰苯二甲酸單甲酯的間接競爭ELISA試劑盒，其特征在于：包含權(quán)利要求3 中所述的試劑1-9和MMP標(biāo)準(zhǔn)品。
【文檔編號】G01N33/577GK104480073SQ201410688100
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】可塵娟, 李慧, 袁均林, 丁書茂, 楊旭, 李睿, 陳明清 申請人:華中師范大學(xué)