一種鄰苯二甲酸二甲酯模擬抗體的篩選方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二甲酯模擬抗體的篩選方法及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，該模擬抗體是利用核糖體展示技術(shù)從Lipocalin模擬抗體庫(kù)中篩選出來(lái)的，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行了可溶性功能表達(dá)。本發(fā)明還涉及應(yīng)用核糖體展示技術(shù)篩選鄰苯二甲酸二甲酯模擬抗體的方法。本發(fā)明篩選出的鄰苯二甲酸二甲酯模擬抗體可以應(yīng)用于鄰苯二甲酸二甲酯超標(biāo)檢測(cè)與研制鄰苯二甲酸二甲酯殘留快速檢測(cè)試劑盒。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種鄰苯二甲酸二甲醒模擬抗體的篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鄰苯二甲酸二甲醋模擬抗體的篩選方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，用 于制備特異識(shí)別鄰苯二甲酸二甲醋的模擬抗，該模擬抗體還可W用于研制快速檢測(cè)鄰苯二 甲酸二甲醋殘留的免疫檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 鄰苯二甲酸二甲醋（dimethyl地thalate，W下簡(jiǎn)稱(chēng)DMP)為無(wú)色透明微黃色油狀 液體，稍有芳香味，沸點(diǎn)為283. 7C的增塑劑。能與己醇、己離等一般有機(jī)溶劑混溶，不溶于 水和石油離。其分子式為〔1化。〇4,摩爾質(zhì)量為194. 19g/mol。鄰苯二甲酸二甲醋化合物是 世界上廣泛使用的人工合成有機(jī)物，易于富集，不易生物降解。由于產(chǎn)量的增加和廣泛的使 用，導(dǎo)致在我國(guó)食品、大氣、天然水體和±壤中都發(fā)現(xiàn)有它們的存在，已成為全球分布最廣 泛的污染物之一，分別被美國(guó)環(huán)保局和中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站確定為優(yōu)先控制的污染物。因此 需要建立一套快速簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法。
[0003] 核糖體展示技術(shù)（ribosome display,畑）是一種簡(jiǎn)便有效的新型體外篩選和分子 進(jìn)化功能性蛋白質(zhì)的生物文庫(kù)技術(shù)，它將可擴(kuò)增的基因組信息DNA或RNA與可選擇的蛋白 質(zhì)聯(lián)系在一起。RD技術(shù)中mRNA缺乏終止密碼子并經(jīng)過(guò)適當(dāng)修飾，在體外翻譯過(guò)程中核糖 體會(huì)停留在mRNA的3'末端，mRNA與翻譯產(chǎn)物均不從核糖體上解離下來(lái)，形成十分穩(wěn)定的 "mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)"H元復(fù)合物，該種H元復(fù)合體形式將蛋白質(zhì)和mRNA信息連接到一 起，應(yīng)用RD可進(jìn)行特殊功能的膚和蛋白質(zhì)篩選。
[0004] Lipocalin是從低等生物（細(xì)菌）到高等哺乳類(lèi)動(dòng)物都含有的一組胞外親脂蛋白 的總稱(chēng)，是廣泛存在于自然界功能多樣的小分子蛋白質(zhì)家族，從低等生物（細(xì)菌）到高等哺 乳類(lèi)動(dòng)物（包括人類(lèi)）均發(fā)現(xiàn)其蹤跡。盡管脂質(zhì)運(yùn)載蛋白在不同生物中發(fā)揮著不同的生理 學(xué)功能，但運(yùn)輸和膽存低溶解度物質(zhì)或化學(xué)敏感性物質(zhì)，如芳香素、維生素、類(lèi)固醇類(lèi)激素、 多種二級(jí)代謝產(chǎn)物和信息素是它們最典型的生物學(xué)功能。由于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族的高級(jí)結(jié) 構(gòu)特征與抗體類(lèi)似，且脂質(zhì)運(yùn)載蛋白又具備一些抗體所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)，因此，W Lipocalin為 骨架構(gòu)建的突變文庫(kù)得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。盡管Lipocalin在一級(jí)結(jié)構(gòu)上存在多樣 性，但其二級(jí)結(jié)構(gòu)與四級(jí)結(jié)構(gòu)卻梅人的相似：由8條反相平行的目折疊片與一個(gè)a螺旋 扭曲形成一個(gè)桶狀結(jié)構(gòu)，形成了 "Lipocalin支架"結(jié)構(gòu)，含有一個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)，桶的開(kāi)口 端由連接目條帶的多個(gè)Loop組成，是整個(gè)分子比較柔初的部分，且氨基酸成員為極性氨基 酸，Loop環(huán)是其隨機(jī)突變的區(qū)域。研究表明，通過(guò)改造Lipocalin骨架作為特異性配體可 W結(jié)合特定祀標(biāo)，亦即通過(guò)設(shè)計(jì)Lipocalin的支架可模擬抗體與小分子結(jié)合，該些經(jīng)過(guò)設(shè) 計(jì)模擬的Lipocalin突變體具有類(lèi)似抗體的結(jié)合特異性，因此可W成為模擬抗體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的是提供一種潛在的檢測(cè)用鄰苯二甲酸二甲醋模擬抗體。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的提供一種鄰苯二甲酸二甲醋模擬抗體的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0008] 本發(fā)明提供的鄰苯二甲酸二甲醋模擬抗體是從核糖體展示Lipocalin模擬抗體 庫(kù)中篩選獲得的并進(jìn)行了可溶性功能表達(dá)。
[0009] 本發(fā)明提供的鄰苯二甲酸二甲醋模擬抗體的制備方法為：
[0010] 1. Lipocalin模擬抗體庫(kù)的擴(kuò)增
[0011] 選擇膽汁H帰結(jié)合蛋白化ilin binding protein, tibp)作為L(zhǎng)ipocalin庫(kù)的模 板，設(shè)計(jì)隨機(jī)突變位點(diǎn)，W合成的BBP基因序列為模板，由設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行重疊引物延伸 PCR擴(kuò)增來(lái)合成Lipocalin模擬抗體庫(kù)片段，約52化。再通過(guò)PCR方法添加大小為10化P 核糖體展示元件T (包括T7啟動(dòng)子，5'莖環(huán)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)）和大小為298bp間隔序列 P(瞻菌體P蛋白部分序列），含3'莖環(huán)，作為間隔序列，分別經(jīng)序列測(cè)定，與理論序列完全 一致，最終構(gòu)建成功的核糖體展示Lipocalin模擬抗體庫(kù)，該庫(kù)轉(zhuǎn)錄后的RNA分子包括一個(gè) 5' -loop和3' -loop莖環(huán)結(jié)構(gòu)，一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，隨機(jī)突變的Lipocalin庫(kù)，C末端間 隔序列等，全長(zhǎng)約95化P。
[0012] 其中突變庫(kù)的模板可W是其他Lipocalin分子，優(yōu)選化P。
[0013] 2.抗鄰苯二甲酸二甲醋模擬抗體的篩選
[0014] 在為微孔板上包被DMP-0VA和DMP-BSA作為抗原進(jìn)行交替篩選。將構(gòu)建的核糖 體展示Lipocalin模擬抗體庫(kù)通過(guò)體外翻譯系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄翻譯后，加入到篩選孔中賠育，通過(guò) 改變Mg"濃度將篩選得到的模擬抗體-核糖體-mRNA H聯(lián)體解離，得到相應(yīng)的mRNA，經(jīng)過(guò) RT-PCR獲得篩選后的DNA文庫(kù)。得到的DNA文庫(kù)與核糖體展示元件T啟動(dòng)子和P蛋白連 接。然后重復(fù)體外轉(zhuǎn)錄-體外翻譯-親和篩選-RT-PCR擴(kuò)增過(guò)程，得到反復(fù)篩選幾輪的模 擬抗體DNA文庫(kù)。經(jīng)過(guò)五輪核糖體展示篩選后，mRNA經(jīng)過(guò)紫外分光光度法測(cè)定，結(jié)果顯示 吸光度明顯增加，模擬抗體文庫(kù)中抗原陽(yáng)性的模擬抗體序列明顯富集。
[0015] Mg化濃度根據(jù)篩選條件的嚴(yán)謹(jǐn)性不同進(jìn)行調(diào)整。
[0016] 3.鄰苯二甲酸二甲醋模擬抗體的可溶性功能表達(dá)
[0017] 將五輪篩選后對(duì)模擬抗體文庫(kù)進(jìn)行序列鑒定，挑選出無(wú)致死突變的20個(gè)克隆子， 將該基因與pTIG-Trx連接成表達(dá)載體，在大腸桿菌化21 0E3)中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和 Western Blotting鑒定，在20邸a處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，確定表達(dá)產(chǎn)物 存在于破碎菌體后的上清液中，W空質(zhì)粒宿主菌為對(duì)照，DMP-0VA為包被原DMP為競(jìng)爭(zhēng)小分 子，競(jìng)爭(zhēng)ELSIA檢測(cè)誘導(dǎo)上清的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性，有競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性的進(jìn)一步大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá) 并純化。
[0018] 模擬抗體的表達(dá)可W采用原核表達(dá)載體如地V220，pET系列載體，優(yōu)選pTIG-Trx。
[0019] 標(biāo)簽蛋白可W為麥芽糖結(jié)合蛋白、6X組氨酸標(biāo)簽等，優(yōu)選6X組氨酸標(biāo)簽。
[0020] 4.鄰苯二甲酸二甲醋模擬抗體的純化與鑒定
[0021] 利用anti-6X化S tag親和層析柱對(duì)表達(dá)的特異結(jié)合物進(jìn)行了純化，使目的條帶 得到了明顯的濃縮和分離，競(jìng)爭(zhēng)化ISA分析純化后產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性。sra法檢測(cè)所獲模 擬抗體的親和力。
[0022] 本發(fā)明可W提供一種測(cè)定環(huán)境和食品中鄰苯二甲酸二甲醋殘留的檢測(cè)試劑盒中 的最關(guān)鍵檢測(cè)試劑一特異結(jié)合模擬抗體。本發(fā)明所制備的鄰苯二甲酸二甲醋模擬抗體的 優(yōu)勢(shì)在于；（1)利用DMP-0VA和DMP-BSA交替篩選可W克服載體蛋白BSA和OVA對(duì)模擬抗 體的干擾（2)所獲得的Lipocalin-DMP序列清楚，便于基因工程操作，易于在大腸桿菌中可 W大量功能表達(dá)；（3)分子量小，，為將來(lái)的進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[002引圖ILipocalin模擬抗體庫(kù)的瓊脂糖凝膠電泳圖，M為DNA marker, 1為核糖體展 示Lipocalin模擬抗體全庫(kù)DNA，2為陰性對(duì)照。
[0024] 圖2輪篩選后每輪產(chǎn)物的產(chǎn)量分析，A為篩選后五輪的RT-PCR產(chǎn)物圖，1-5 ;第1-5 輪篩選，6為陰性對(duì)照；B為篩選后五輪產(chǎn)物在紫外下mRNA吸光度，1-5 ;第1-5輪篩選。
[00巧]圖化ipocalin-DMP誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定，其中A圖誘導(dǎo)產(chǎn)物破碎后上清的 SDS-PAGE電泳圖，B圖為蛋白純化后的SDS-PAGE電泳圖，C圖為相應(yīng)的Western-blotting 圖；1、2為L(zhǎng)ipocalin-DMP上清，3為空質(zhì)粒陰性對(duì)照，5、6為純化后蛋白，7、8為相應(yīng)的 Western-blotting后的蛋白條帶，M為蛋白Marker。
[0026] 圖4直接化ISA分析模擬抗體Lipocalin-DMP的結(jié)合活性。
[0027] 圖5間接競(jìng)爭(zhēng)化ISA分析模擬抗體Lipocalin-DMP的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性。
[002引圖6SPR分析模擬抗體Lipocalin-DMP的結(jié)合動(dòng)力學(xué)常數(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0029] W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試劑與材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可 從常規(guī)試劑公司購(gòu)買(mǎi)得到。
[0030] 實(shí)施例1核糖體展示Lipocal in模擬抗體的擴(kuò)增 [003U 1.弓I物合成
[0032] 根據(jù)bbp序列及構(gòu)建Lipocalin抗體庫(kù)需要改變的突變位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)合成引物，隨 機(jī)核酸編碼區(qū)設(shè)計(jì)成NNK(N為G、C、A、T ;K為G和T)，同時(shí)設(shè)計(jì)與核糖體展示元件相連的引 物，主要引物如下表所示。
[003引表1寡核巧酸引物
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種鄰苯二甲酸二甲酯模擬抗體的制備方法，主要由以下步驟組成： (1) 核糖體展示Lipocalins模擬抗體庫(kù)的構(gòu)建 選擇膽汁三烯結(jié)合蛋白（bilin binding protein, bbp)作為L(zhǎng)ipocalins庫(kù)的模板， 設(shè)計(jì)隨機(jī)突變位點(diǎn)，以合成的BBP基因序列為模板，Lipocalins模擬抗體庫(kù)片段約522bp。 通過(guò)PCR方法添加啟動(dòng)子、間隔序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等核糖體展示所需要的元件，最終構(gòu)建成功 的核糖體展示Lipocalins模擬抗體庫(kù)，全長(zhǎng)約950bp。該庫(kù)轉(zhuǎn)錄后的RNA分子包括一個(gè) 5' -loop和3' -loop莖環(huán)結(jié)構(gòu)，一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，隨機(jī)突變的Lipocalins庫(kù)，C末端間 隔序列等。； (2) 抗鄰苯二甲酸二甲酯模擬抗體的篩選 將構(gòu)建的核糖體展示Lipocalins模擬抗體庫(kù)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄翻譯后，用DMP-BSA和 DMP-0VA作為抗原交替篩選鄰苯二甲酸二甲酯模擬抗體，通過(guò)降低Mg2+濃度將篩選得到的 模擬抗體-核糖體-mRNA三聯(lián)體解離，得到相應(yīng)的mRNA，經(jīng)過(guò)RT-PCR得到篩選后的DNA文 庫(kù)；然后重復(fù)體外轉(zhuǎn)錄-體外翻譯-親和篩選-RT-PCR擴(kuò)增過(guò)程，得到反復(fù)篩選幾輪的模擬 抗體DNA文庫(kù)；經(jīng)過(guò)五輪核糖體展示篩選后，得到的mRNA經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定，結(jié)果顯示 吸光度明顯增加，且RT-PCR擴(kuò)增得到的DNA條帶亮度明顯增加，說(shuō)明篩選后的抗體文庫(kù)中 抗原陽(yáng)性的抗體得到了富集。 (3) 鄰苯二甲酸二甲酯模擬抗體的可溶性功能表達(dá) 將五輪篩選后對(duì)模擬抗體文庫(kù)進(jìn)行序列鑒定，隨機(jī)挑選20個(gè)克隆子，將該基因與 pTIG-TRX連接成表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot鑒 定，在20KDa處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，確定表達(dá)產(chǎn)物存在于破碎菌體后的 上清液中，以空質(zhì)粒宿主菌為對(duì)照，DMP-BSA和DMP-0VA為包被原，DMP為競(jìng)爭(zhēng)小分子，競(jìng)爭(zhēng) ELSIA檢測(cè)誘導(dǎo)上清的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性，有競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性的進(jìn)一步大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)并純化； (4) 鄰苯二甲酸二甲酯模擬抗體的純化與鑒定 利用Anti-Histag親和層析柱對(duì)表達(dá)的特異結(jié)合物進(jìn)行了純化，使目的條帶得到了明 顯的濃縮和分離，競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析純化后產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性；SPR法檢測(cè)所獲模擬抗體的 親和力。
2. 權(quán)利要求1所述隨機(jī)突變庫(kù)的模板可以是其他lipocalin分子，優(yōu)選bbp。
3. 權(quán)利要求1所述篩選方法中的包被原可以選用DMP-BSA，還可以選用DMP-0VA進(jìn)行 篩選，優(yōu)選交叉篩選。
【文檔編號(hào)】C07K16/44GK104513315SQ201310450947
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】寧保安, 高志賢, 彭媛, 白家磊, 趙麗, 劉建青, 孫思明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所