一種免疫層析試紙的非診斷性檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種免疫層析試紙的非診斷性檢測(cè)方法，該方法采用免疫磁性納米顆粒制備免疫層析試紙，檢測(cè)時(shí)，采用過氧化物酶底物顯色反應(yīng)進(jìn)行結(jié)果判定。利用所述免疫層析試紙的檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠，靈敏度大大提高，比一般膠體金檢測(cè)試紙靈敏度高10-100倍，操作簡(jiǎn)單，不需要檢測(cè)儀器，通過肉眼即可得到檢測(cè)結(jié)果。
【專利說明】 一種免疫層析試紙的非診斷性檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種免疫層析試劑的非診斷性檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]目前，快速檢測(cè)的技術(shù)有很多，但是能夠在很短時(shí)間內(nèi)就可判斷結(jié)果的技術(shù)卻很少，其中，免疫層析技術(shù)是一種獨(dú)特的免疫分析方式，該方法的核心技術(shù)是以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析材料上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中經(jīng)標(biāo)記物標(biāo)記的待測(cè)物與包被在層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生特異性結(jié)合而聚集顯色。它既有免疫學(xué)方法的特異性，又有簡(jiǎn)便快速不需儀器的特點(diǎn)。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)中的免疫層析試紙檢測(cè)方法大多采用膠體金標(biāo)記方法，但膠體金連接了待標(biāo)記抗體或待標(biāo)記蛋白之后，很不穩(wěn)定，很容易因電荷的變化使得抗體脫離，造成每個(gè)膠體金的標(biāo)記抗體量大大減少，從而造成靈敏度的降低；并且膠體金試劑的制備采用氯金酸，試劑成本比較高，導(dǎo)致免疫層析試紙的總體成本比較高。
[0004]目前也有采用免疫磁珠進(jìn)行免疫層析試紙的檢測(cè)，其原理是利用免疫磁珠的磁性，通過檢測(cè)磁場(chǎng)信號(hào)進(jìn)行結(jié)果的判斷，其缺點(diǎn)是必須通過檢測(cè)儀器進(jìn)行結(jié)果判斷，通過檢測(cè)儀器將磁場(chǎng)信號(hào)的生物學(xué)信號(hào)進(jìn)一步以電信號(hào)方式輸出，判斷結(jié)果，如果沒有磁性檢測(cè)儀，檢測(cè)結(jié)果得不到保證。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種免疫層析試紙的非診斷性檢測(cè)方法，該方法具有免疫層析試紙和酶聯(lián)免疫級(jí)聯(lián)放大的兩者的優(yōu)點(diǎn)，既實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的目的，又有效地提高檢測(cè)靈敏度，且檢測(cè)方法操作方便簡(jiǎn)單，獲得檢測(cè)結(jié)果快速，也不需要儀器進(jìn)行結(jié)果的判定；而且試劑成本低。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。
[0007]—種免疫層析試紙的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0008](1)、通過將標(biāo)記后的？6304磁性納米顆粒噴涂于玻璃纖維膜上，制備免疫磁性納米顆粒結(jié)合墊；
[0009](2)、制備包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的包被膜；
[0010]⑶、處理樣品墊；
[0011](4)、組裝試紙條:將所述步驟(3)處理后的樣品墊、所述步驟(1)制備的免疫磁性納米顆粒結(jié)合墊、所述步驟(2)制備好的包被膜和吸水墊依次貼在底襯卡上，得到免疫層析試紙；
[0012](5)、樣品檢測(cè):將待檢樣本加入到步驟(4)中所述免疫層析試紙的樣品墊，再將過氧化物酶底物滴加于樣品墊，進(jìn)行結(jié)果的判定。
[0013]如上所述的非診斷性檢測(cè)方法，優(yōu)選地，所述步驟(1)包括:用與待檢項(xiàng)目相結(jié)合的抗原或抗體標(biāo)記？6304磁性納米顆粒，將標(biāo)記后的磁性納米顆粒噴涂于玻璃纖維膜上，制備成免疫磁性納米顆粒結(jié)合墊。
[0014]如上所述的非診斷性檢測(cè)方法，優(yōu)選地，所述步驟(1)中在待檢項(xiàng)目相結(jié)合的抗原或抗體標(biāo)記？6304磁性納米顆粒之前，所述？6304磁性納米顆粒進(jìn)行羧基化修飾。
[0015]如上所述的非診斷性檢測(cè)方法，優(yōu)選地，步驟(2)中，所述檢測(cè)帶包被有與待檢項(xiàng)目結(jié)合的抗體或抗原，所述質(zhì)控帶包被有與上述磁性納米顆粒標(biāo)記的抗原或抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)物。
[0016]如上所述的非診斷性檢測(cè)方法，優(yōu)選地，所述步驟⑶處理樣品墊具體為:將含有體積比為0.5%?2%吐溫20、邱=7.2?7.6的？83，噴涂于樣品墊上，烘干或自然干燥后待用。
[0017]如上所述的非診斷性檢測(cè)方法，優(yōu)選地，所述步驟(2)中包被膜為硝酸纖維素膜，所述步驟(3)中樣品墊為玻璃纖維膜，所述步驟(4)中吸水墊為吸水紙或純棉絨漿濾紙。
[0018]如上所述的非診斷性檢測(cè)方法，優(yōu)選地，所述過氧化物酶底物為鄰苯二胺體系、四甲基聯(lián)苯胺體系、3.3 一二氨基聯(lián)苯胺體系或2.2’ -邊氮基-雙3-乙基苯并噻卩比咯啉-6橫酸體系中的任一種。
[0019]如上所述的非診斷性檢測(cè)方法，優(yōu)選地，所述四甲基聯(lián)苯胺體系包括:四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫，所述四甲基聯(lián)苯胺的質(zhì)量濃度為0.011118/1111?101118/1111，所述過氧化氫的摩爾濃度為 0.25111 11101/1 ?1.2111 11101/1。
[0020]如上所述的非診斷性檢測(cè)方法，優(yōu)選地，所述四甲基聯(lián)苯胺體系配制方法如下先將四甲基聯(lián)苯胺溶于二甲基亞砜，再將加入蒸餾水定容，獲得纟液；
[0021]幻先配制質(zhì)量濃度為0.5%?30%的過氧化氫尿素溶液，之后稱取檸檬酸、磷酸氫二納，加入過所述氧化氫尿素溶液，用蒸餾水定容，所述檸檬酸的終濃度為0.111101/1、所述磷酸氫二納的終濃度為0.211101/1，所述過氧化氫尿素的摩爾濃度為0.5111 11101/1?2.4111001/1，獲得8液；
[0022]0)將上述八液與8液等體積混合獲得118應(yīng)用液備用。
[0023]如上所述的非診斷性檢測(cè)方法，優(yōu)選地，所述制備的免疫層析試紙還包括通過如下方法進(jìn)行驗(yàn)證:利用所述制備好的試紙條對(duì)陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，只有質(zhì)控帶顯色，對(duì)含有待檢項(xiàng)目的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)帶與質(zhì)控帶均顯色，免疫層析試紙合格，用于待檢項(xiàng)目的檢測(cè)。
[0024]上述對(duì)制備的免疫層析試紙做驗(yàn)證試驗(yàn)，有效保證試紙的有效性和準(zhǔn)確性，避免假陰性試驗(yàn)結(jié)果的出現(xiàn)。
[0025]本發(fā)明提供一種采用新型免疫層析試紙進(jìn)行病原檢測(cè)，采用可以很容易獲得的磁性納米顆粒，磁性納米顆粒經(jīng)羧基化修飾后，再進(jìn)行抗原或抗體標(biāo)記，標(biāo)記后形成免疫磁珠，該免疫磁珠比較穩(wěn)定，能有效結(jié)合待檢的目標(biāo)物，不會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，從而避免出現(xiàn)漏檢。判斷結(jié)果時(shí)，利用？6304磁性納米顆粒具有過氧化物酶的特性，加入過氧化物酶的底物顯色后，判斷檢測(cè)結(jié)果，通過酶聯(lián)的級(jí)聯(lián)擴(kuò)大反應(yīng)，使靈敏度大大提高，可比膠體金檢測(cè)靈敏度高10-100倍的數(shù)量級(jí)，且不需要檢測(cè)儀器進(jìn)行結(jié)果的檢測(cè)。本發(fā)明的免疫層析試紙制備時(shí)，采用成本較低的試劑，使總的檢測(cè)成本降低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是本發(fā)明免疫層析試紙檢測(cè)方法的流程圖。
[0027]圖2是本發(fā)明免疫層析試紙檢測(cè)結(jié)果。
[0028]圖3是膠體金免疫層析試紙檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0029]目前有利用四氧化三鐵納米顆粒進(jìn)行檢測(cè)，主要是利用其具有磁響應(yīng)性的功能，對(duì)待檢目的物進(jìn)行富集分離的，可有效提高檢測(cè)率。四氧化三鐵納米顆粒還具有辣根過氧化物酶催化底物變色的特性，但是利用這個(gè)特性進(jìn)行21^1“檢測(cè)鮮有報(bào)道，主要原因可能是一方面考慮到由于四氧化三鐵納米顆粒的量子化尺寸效應(yīng)等，使它對(duì)某種波長(zhǎng)的光吸收帶有藍(lán)移現(xiàn)象，并對(duì)各種波長(zhǎng)光的吸收有寬化現(xiàn)象，認(rèn)為對(duì)檢測(cè)需要測(cè)量吸光度值不是很準(zhǔn)確；另一方面，由于四氧化三鐵本身具有的顏色，會(huì)對(duì)后續(xù)測(cè)定吸光度值有影響，所以認(rèn)為利用四氧化三鐵納米顆粒具有辣根過氧化物酶的特性進(jìn)行免疫學(xué)方法的檢測(cè)，尤其是檢測(cè)，結(jié)果不是很準(zhǔn)確、可靠，有一定的技術(shù)偏見。
[0030]本發(fā)明利用四氧化三鐵具有辣根過氧化物酶催化的特性，即能催化鄰苯二胺體系即含有過氧化氫和鄰苯二胺(090)、四甲基聯(lián)苯胺體系即含有過氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺(118)的溶液、3.3 一二氨基聯(lián)苯胺即含有過氧化氫和3.3 一二氨基聯(lián)苯胺(1^8)的溶液，或2.2’ -邊氮基-雙3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸即含有過氧化氫和2.2’ -邊氮基-雙3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸(八813)的溶液顯色的特點(diǎn)，首次將四氧化三鐵納米顆粒利用到免疫層析試紙上進(jìn)行抗原抗體的檢測(cè)，利用四氧化三鐵可使辣根過氧化物酶底物顯色的特性，極大地增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，使本發(fā)明的制備的免疫層析試紙檢測(cè)靈敏度大大提高，也使四氧化三鐵具有辣根過氧化物酶催化的特性，能用于免疫學(xué)方法檢測(cè)成為可能。
[0031]本發(fā)明利用四氧化三鐵磁性納米顆粒制備檢測(cè)試紙還有效解決了，采用膠體金材料制備試紙時(shí)，膠體金包被不穩(wěn)定性，靈敏度降低的問題。主要是，本發(fā)明制備檢測(cè)試紙時(shí)，對(duì)四氧化三鐵顆粒進(jìn)行了羧基化處理，有利于包被，且與包被物形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，并且包被后不會(huì)影響包被物的免疫學(xué)特性。
[0032]另外，通過對(duì)樣品墊處理方式的研究，發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明處理方法，可有效地避免非特異性反應(yīng)，降低假陽(yáng)性的檢出率。
[0033]本發(fā)明對(duì)118應(yīng)用液中118的含量和??！202的含量，進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，研究表明丁18 含量在 0.01111^/1111 ?1011^/1111，過氧化氫的摩爾濃度為 0.25111 11101/1 ?1.2111 11101/1,四氧化三鐵納米顆粒制備的檢測(cè)試紙顯色效果較佳。
[0034]常規(guī)此1“采用的底物為118顯色液，反應(yīng)時(shí)，首先需要加入含有118的4液，再加入含有402的8液，進(jìn)行反應(yīng)，一般八液與8液是分開存放或是現(xiàn)用現(xiàn)配，因118溶液與單獨(dú)的?。?02溶液混合一起后，存放一段時(shí)間容易產(chǎn)生渾濁或沉淀，長(zhǎng)期存放會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，一般采用氏02溶液時(shí)最好現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0035]本發(fā)明對(duì)118應(yīng)用液的配制方法進(jìn)一步進(jìn)行改進(jìn)，研究發(fā)現(xiàn)采用過氧化氫水溶液和過氧化氫尿素的效果相同，但采用過氧化氫尿素配制的溶液比采用氏02配制的溶液更加穩(wěn)定，過氧化氫尿素的水溶液具有尿素和氏02性質(zhì)。
[0036]本發(fā)明配制的118應(yīng)用液可直接使用，但需要41避光存放。優(yōu)選地，配制的方法如下:
[0037]1.底物液4:118200呢，溶于二甲基亞砜10001，加雙蒸水至10001111。
[0038]2.底物8:先配制重量濃度為1%過氧化氫尿素待用，稱取似2！?。?414 218，檸檬酸
9.6078，加入1%過氧化氫尿素2.41111，加雙蒸水至5001111。
[0039]3.將底物液八和底物8按1:1混合即成118應(yīng)用液。
[0040]這種方法簡(jiǎn)單、方便、節(jié)約試劑，同時(shí)過氧化氫尿素較過氧化氫穩(wěn)定，更能夠確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
[0041]本發(fā)明中所指的蒸餾水可以是一次蒸餾水，也可以是二次蒸餾水、三次蒸餾水或超純水。
[0042]下面對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的說明。以下具體實(shí)施例中所用的試劑，如無特別說明均為常規(guī)試劑，百分比含量如無特別說明均為重量百分比。
[0043]森林腦炎抗原、森林腦炎抗原免疫的兔血清、森林腦炎抗體由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)生檢疫研究所提供。
[0044]實(shí)施例1森林腦炎抗體免疫層析檢測(cè)方法
[0045]結(jié)合圖1，對(duì)本發(fā)明制備的免疫層析檢測(cè)方法具體的優(yōu)選的實(shí)施方式如下:
[0046]1、制備免疫磁性納米顆粒結(jié)合墊，采用3？八標(biāo)記磁性納米顆粒
[0047]取100111 ？6304磁性納米顆粒溶液加700^ [水，200^ I 25%的戊二醛溶液，搖晃311 ； 101水洗1-2次，用邱=7.4的？83洗2次，即將四氧化三鐵磁性納米顆粒進(jìn)行羧基化處理；加入500 111, 2呢加1的3？八，搖晃3卜，邱值7.6 ；加入500 9匕含0.5 %的83八溶液，搖晃30分鐘，進(jìn)行封閉；加入含0.01 %吐溫-20濃度為0.011、邱=7.4的？83，洗3-4次；加入1此重懸液，其中重懸液中含有重量百分比為0.1%的11*18堿、1%的8“和5%的蔗糖，混勻，噴涂于玻璃纖維膜上，371干燥處。
[0048]2、包被膜的制備
[0049]將森林腦炎重組抗原和羊抗兔I姊用？83溶液分別稀釋至1呢/此和0.8呢/111匕用噴膜機(jī)將森林腦炎重組抗原和羊抗兔I姊包被于硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，置于371干燥過夜。
[0050]3、處理樣品墊
[0051]將含1%吐溫20、？?。?= 7.4的？83，噴涂于玻璃纖維膜上，獲得樣品墊。
[0052]4、組裝試紙條
[0053]將上述制備好的樣品墊、磁性納米顆粒結(jié)合墊、包被后的硝酸纖維素膜、吸水墊依次貼在底襯卡上，切成寬度為0.40.11的條，裝殼，吸水墊可選用吸水紙也可選用純棉絨漿濾紙。
[0054]5、試紙條的驗(yàn)證
[0055]為保證所制備的試紙條檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠，對(duì)試紙條進(jìn)行驗(yàn)證。具體步驟如下:將陰性兔血清取809 I滴加在免疫層析試紙的樣品墊上，2分鐘后取509 I 118應(yīng)用液(采用上述方法配置)滴加在樣品墊上，10--15-！！后判斷結(jié)果，應(yīng)僅質(zhì)控帶出現(xiàn)棕黃色；將森林腦炎重組抗原免疫的兔血清取809 I滴加在另一免疫層析試紙的樣品墊上，并且在2分鐘后，取50仏118應(yīng)用液滴加在樣品墊上，質(zhì)控帶和陽(yáng)性檢測(cè)條帶308內(nèi)加深，100111后判斷結(jié)果，質(zhì)控帶和檢測(cè)帶均出現(xiàn)棕黃色條帶，試紙條合格，可進(jìn)行森林腦炎抗體的檢測(cè)。
[0056]6、樣品檢測(cè)
[0057]在進(jìn)行森林腦炎抗體的檢測(cè)時(shí)，取809 I血清樣品滴加在樣品墊上，并且在2分鐘后取50^1 118應(yīng)用液滴加在樣品墊上，10-=判斷結(jié)果。若僅質(zhì)控帶出現(xiàn)棕黃色，結(jié)果為陰性，說明待檢血清樣品中不含有森林腦炎抗體；若質(zhì)控帶和檢測(cè)帶均出現(xiàn)棕黃色，結(jié)果為陽(yáng)性，說明待檢血清樣品中含有森林腦炎抗體；若兩條帶都沒有顯色或者只有檢測(cè)帶顯色，則說明此試紙條已經(jīng)失效，結(jié)果無效。
[0058]實(shí)施例2森林腦炎抗體的納米磁珠免疫層析試紙與膠體金免疫層析試紙的靈敏度檢測(cè)比較
[0059]采用實(shí)施例1制備的試紙條分別檢測(cè)森林腦炎抗體血清，用胎牛血清稀釋為1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000，同時(shí)將胎牛血清作為陰性對(duì)照，取80 ^ I血清樣品加樣孔內(nèi)，并且在2分鐘后取50 ^ I 118應(yīng)用液滴加在樣品墊上，10-11判斷結(jié)果。
[0060]采用常規(guī)方法制備膠體金免疫層析試紙，其中采用3？八標(biāo)記膠體金顆粒，硝酸纖維素膜上的檢測(cè)帶包被有森林腦炎重組抗原，質(zhì)控帶包被羊抗兔I姊，利用制備的膠體金免疫層析試紙對(duì)森林腦炎抗體血清進(jìn)行檢測(cè)，同樣采用用胎牛血清稀釋為1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000，同時(shí)將胎牛血清作為陰性對(duì)照，取80 111血清樣品加樣孔內(nèi)，10111111后判斷結(jié)果。
[0061]納米磁珠免疫層析試紙檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，圖3為膠體金免疫層析試紙檢測(cè)結(jié)果圖，其中圖中注:0:質(zhì)控帶；1:檢測(cè)帶；1-7:森林腦炎陽(yáng)性血清稀釋濃度:1:10,1:100,1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000 ；7:陰性對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果表明，作為陰性對(duì)照的胎牛血清均為陰性，制備的納米磁珠免疫層析試紙可檢測(cè)出稀釋至1:100000的森林腦炎抗體，而膠體金免疫層析試紙僅可檢測(cè)出稀釋至1:10000的森林腦炎抗體，靈敏度相差10倍。
[0062]實(shí)施例3森林腦炎抗原免疫層析檢測(cè)方法
[0063]1、制備免疫磁性納米顆粒結(jié)合墊，采用森林腦炎抗體標(biāo)記磁性納米顆粒
[0064]取100 ？6304磁性納米顆粒溶液加700 ^ I水，200 ^ I 25%的戊二醛溶液，搖晃311 ； 101水洗1-2次，用邱=7.4的？83洗2次，即將四氧化三鐵磁性納米顆粒進(jìn)行羧基化處理；加入500 111, 2呢加1的森林腦炎抗體，搖晃3卜，邱值7.4 ；加入500仏，含0.3 %的83八溶液，搖晃30分鐘，進(jìn)行封閉；加入含0.01%吐溫-20濃度為0.011、邱=7.4的？83，洗3-4次；加入1此重懸液，其中重懸液中含有重量百分比為0.1%的11*18堿、1%的83八和5%的蔗糖，混勻，噴涂于玻璃纖維膜上，371干燥處。
[0065]2、包被膜的制備
[0066]將森林腦炎抗體和羊抗兔I姊用？83溶液分別稀釋至1.2呢/此和0.8呢/111匕用噴膜機(jī)將森林腦炎抗體和羊抗兔I姊包被于硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，置于371干燥。
[0067]3、處理樣品墊
[0068]將含1%吐溫20、？！！ = 7.4的？83，噴涂于玻璃纖維膜上，獲得樣品墊。
[0069]4、組裝試紙條
[0070]將上述制備好的樣品墊、磁性納米顆粒結(jié)合墊、包被后的硝酸纖維素膜、吸水墊依次貼在底襯卡上，切成寬度為0.4挪的條，裝殼，吸水墊可選用吸水紙。
[0071]5、試紙條的驗(yàn)證
[0072]為保證所制備的試紙條檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠，對(duì)試紙條進(jìn)行驗(yàn)證。具體步驟如下:將不含森林腦炎抗原的0.1I的？8溶液80 9 I滴加在免疫層析試紙的樣品墊上，2分鐘后取50^1 118應(yīng)用液(采用上述方法配置)滴加在樣品墊上，10--150111后判斷結(jié)果，應(yīng)僅質(zhì)控帶出現(xiàn)棕黃色；將含森林腦炎抗原的0.1I的？8溶液80 9 I滴加在另一免疫層析試紙的樣品墊上，并且在2分鐘后，取509 I 118應(yīng)用液滴加在樣品墊上，質(zhì)控帶和陽(yáng)性檢測(cè)條帶308內(nèi)加深，10111111后判斷結(jié)果,質(zhì)控帶和檢測(cè)帶均出現(xiàn)棕黃色條帶，試紙條合格，可進(jìn)行森林腦炎抗原的檢測(cè)。
[0073]6、樣品檢測(cè)
[0074]在進(jìn)行森林腦炎抗體的檢測(cè)時(shí)，取80 9 I血清樣品滴加在樣品墊上，并且在2分鐘后取50^1 118應(yīng)用液滴加在樣品墊上，10-=判斷結(jié)果。若僅質(zhì)控帶出現(xiàn)棕黃色，結(jié)果為陰性，說明待檢樣品中不含有森林腦炎抗原；若質(zhì)控帶和檢測(cè)帶均出現(xiàn)棕黃色，結(jié)果為陽(yáng)性，說明待檢樣品中含有森林腦炎抗原；若兩條帶都沒有顯色或者只有檢測(cè)帶顯色，則說明此試紙條已經(jīng)失效，結(jié)果無效。
[0075]在以上實(shí)施列中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0076]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明做其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種免疫層析試紙的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、通過將標(biāo)記后的Fe3O4磁性納米顆粒噴涂于玻璃纖維膜上，制備免疫磁性納米顆粒結(jié)合墊； (2)、制備包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的包被膜； (3)、處理樣品墊； (4)、組裝試紙條:將所述步驟(3)處理后的樣品墊、所述步驟(I)制備的免疫磁性納米顆粒結(jié)合墊、所述步驟(2)制備好的包被膜和吸水墊依次貼在底襯卡上，得到免疫層析試紙； (5)、樣品檢測(cè):將待檢樣本加入到步驟(4)中所述免疫層析試紙的樣品墊，再將過氧化物酶底物滴加于樣品墊，進(jìn)行結(jié)果的判定。
2.如權(quán)利要求1所述的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(I)包括:用與待檢項(xiàng)目相結(jié)合的抗原或抗體標(biāo)記Fe3O4磁性納米顆粒，將標(biāo)記后的磁性納米顆粒噴涂于玻璃纖維膜上，制備成免疫磁性納米顆粒結(jié)合墊。
3.如權(quán)利要求2所述的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(I)中在待檢項(xiàng)目相結(jié)合的抗原或抗體標(biāo)記Fe3O4磁性納米顆粒之前，所述Fe3O4磁性納米顆粒進(jìn)行羧基化修飾。
4.如權(quán)利要求1所述的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中，所述檢測(cè)帶包被與待檢項(xiàng)目結(jié)合的抗體或抗原，所述質(zhì)控帶包被與上述磁性納米顆粒標(biāo)記的抗原或抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)物。
5.如權(quán)利要求1所述的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(4)處理樣品墊具體為:將含有體積比為0.5%?2%吐溫20、pH = 7.2?7.6的PBS，噴涂于樣品墊上，烘干或自然干燥后待用。
6.如權(quán)利要求1所述的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(2)中包被膜為硝酸纖維素膜，所述步驟(3)中樣品墊為玻璃纖維膜，所述步驟(4)中吸水墊為吸水紙或純棉絨漿濾紙。
7.如權(quán)利要求1所述的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，所述過氧化物酶底物為鄰苯二胺體系、四甲基聯(lián)苯胺體系、3.3 一二氨基聯(lián)苯胺體系或2.2’ -邊氮基-雙3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸體系中的任一種。
8.如權(quán)利要求7所述的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，所述四甲基聯(lián)苯胺體系包括:四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫，所述四甲基聯(lián)苯胺的質(zhì)量濃度為0.01mg/ml?10mg/ml，所述過氧化氫的摩爾濃度為0.25m mol/L?1.2m mol/L。
9.如權(quán)利要求8所述的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，所述四甲基聯(lián)苯胺體系配制方法如下:a)先將四甲基聯(lián)苯胺溶于二甲基亞砜，再將加入蒸餾水定容，獲得A液； b)先配制質(zhì)量濃度為0.5%?30%的過氧化氫尿素溶液，之后稱取檸檬酸、磷酸氫二納，加入過所述氧化氫尿素溶液，用蒸餾水定容，所述檸檬酸的終濃度為0.lmol/L、所述磷酸氫二納的終濃度為0.2mol/L，所述過氧化氫尿素的摩爾濃度為0.5m mol/L?2.4m mol/L,獲得B液； c)將上述A液與B液等體積混合獲得TMB應(yīng)用液備用。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的非診斷性檢測(cè)方法，其特征在于，所述制備的免疫層析試紙還包括通過如下方法進(jìn)行驗(yàn)證:利用所述制備好的試紙條對(duì)陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，只有質(zhì)控帶顯色，對(duì)含有待檢項(xiàng)目的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)帶與質(zhì)控帶均顯色，免疫層析試紙合格，用于待檢項(xiàng)目的檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK104330554SQ201410568316
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】楊宇, 王靜, 趙婷婷, 徐寶梁 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院