布魯氏菌抗體金標快速檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種布魯氏菌抗體金標快速檢測試劑盒，屬于臨床醫(yī)學檢測領域。所述試劑盒由卡盒與試紙條兩部分組成：卡盒包括盒蓋(4)與盒底(7)，卡盒內(nèi)置檢測試紙條。卡盒正面可見加樣孔(1)和檢視窗(2)，盒蓋正面印有加樣孔標注(5)、結果判別說明(6)、信息記錄欄(3)。本發(fā)明應用膠體金免疫層析技術，以工程表達的布魯氏菌BP26、OMP25或OMP31抗原為檢測抗原，以高效抗人IgG單克隆抗體作為捕獲抗體制作“間接法”檢測試劑盒，可檢測人體血清、血漿或全血中布魯氏菌的抗體，具有檢測方法簡單，結果顯示準確、快速，無需特殊儀器設備的優(yōu)點。
【專利說明】布魯氏菌抗體金標快速檢測試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬臨床醫(yī)學檢測【技術領域】，具體涉及膠體金免疫層析檢測技術。

【背景技術】
[0002] 布魯氏菌（Brucella)屬于兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性球桿菌，無孢子和莢 膜，不運動，已經(jīng)確認布魯氏菌有9個種，其中具有致病性的有7個種，包括B. abortus、 B. melitensis等。布魯氏菌能引起人和多種動物的急、慢性感染，其引發(fā)的疾病簡稱布病， 被感染的人和動物表現(xiàn)流產(chǎn)及不孕不育等癥狀。所有數(shù)據(jù)顯示全世界由于布病引起的損失 是嚴重的，既包括對動物產(chǎn)品所帶來的直接經(jīng)濟損失，如奶產(chǎn)量下降、流產(chǎn)、延遲受孕等，也 包括對公共衛(wèi)生等所造成的間接經(jīng)濟損失，如治療的費用及生育能力下降等。由于布魯氏 菌具有高致病性和快速霧化的特性，美國疾病預防控制中心（CDC)已經(jīng)將布魯氏菌的3個 種列為潛在的生物武器。因為其初始癥狀很容易和流行性感冒相混淆，布病感染后較難做 出診斷。
[0003] 目前，布魯氏菌的檢測方法主要分為病原分離培養(yǎng)、血清學試驗和核酸檢測等。病 原分離培養(yǎng)主要通過其培養(yǎng)特性及生化試驗指標進行鑒別，該方法耗時長，不利于臨床快 速診斷；核酸檢測主要利用各式PCR進行檢測，包括多重PCR、巢式PCR、實時熒光定量PCR 等，此類方法敏感度好且準確性相對較高，但需要專業(yè)的儀器設備進行檢驗操作；常用的血 清學檢測方法包括試管凝集試驗（SAT)、補體結合試驗（CF)、乳汁環(huán)狀試驗(MKT)、虎紅平 板凝集試驗（RBT)及酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)等，這些方法大多需要專業(yè)的設備或操作 人員進行試驗，對試驗條件要求較高，而膠體金免疫層析（GICA)技術可以克服其它檢測方 法耗時長、需要專業(yè)儀器設備等缺點。
[0004] 根據(jù)徐衛(wèi)民等2006年的一項研究，滴金免疫測定法的敏感性為95. 35%，特異性 為98. 99%，其與SAT的符合率為97. 89% ;2008年朱明東等將GICA應用于牛布魯氏菌病 檢測，表明GICA方法具有試劑敏感、特異，而且血清用量少，操作簡便的特點；2009年邵豐 堯等將GICA在布魯氏菌病監(jiān)測地區(qū)進行了現(xiàn)場應用，同時采用RBT進行檢測，驗證其檢測 效果，再次證明了 GICA與RBT同樣具有較好的敏感性，但是GICA還具有操作簡便、快速、微 量等優(yōu)點。從以上的研究來看，GICA具有迅速、準確、方便的特點，在布病診斷中顯示了廣 闊的應用前景。
[0005] BP26、0MP31和0MP25是三種布魯氏菌的結構抗原。0ΜΡ是外膜蛋白的簡稱（outer membrane proteins，OMPs)，其中0MP25據(jù)PCR-RFLP分析表明，在布魯氏菌種及生物型變種 中是一個高度保守的基因片段，而0MP31存在于除B. abortus之外其它所有的布魯氏菌中， 免疫原性良好；BP26 (periplasmic protein 26)是一種具有強免疫原性、可以由細胞內(nèi)向 外釋放的可溶性外周漿蛋白，相對于固定的外膜蛋白來說，具有易于檢測的優(yōu)點。本發(fā)明以 GICA技術為基礎，以工程表達的BP26、0MP31和0MP25抗原為檢測抗體制作檢測試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種布魯氏菌抗體金標快速檢測試劑盒，用于人體血清、血漿或 全血中布魯氏菌抗體的檢測，對布魯氏菌感染進行輔助診斷。本發(fā)明可解決人體布病感染 檢測需專業(yè)儀器及耗時長等問題，提供一種檢測特異性強、操作簡單快速的試劑盒，可廣泛 用于各級醫(yī)療機構及體檢普查的檢測。
[0007] 本發(fā)明包括卡盒和試紙條兩部分。
[0008] 所述卡盒包括盒蓋和盒底兩部分，材質(zhì)為ABS樹脂(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚 物）；盒蓋與盒底由柱和柱槽以插接方式連接，盒蓋與盒底均為圓角長方形；卡盒正面可見 加樣孔和檢視窗，加樣孔為長圓形，檢視窗為長方形；在檢視窗位置可見反應膜、檢測線T 和質(zhì)控線C，在加樣孔位置可見試紙條樣品墊；盒蓋正面印有加樣孔標注、結果判別說明及 信息記錄欄。
[0009] 所述試紙條置于卡盒內(nèi)部，安放在盒底上的試紙條槽中；試紙條由基板、雙面膠、 膠體金墊、樣品墊、膠帶、反應膜、吸樣墊組成?；宀馁|(zhì)為PVC塑料(聚氯乙烯)，樣品墊及 膠體金墊材質(zhì)為無紡布，反應膜為硝酸纖維素膜，吸樣墊材質(zhì)為吸油紙。所述試紙條以高效 鼠源抗人IgG單克隆抗體作為捕獲抗體，用膠體金標記形成抗人IgG-膠體金復合物并固化 于膠體金墊上；以工程表達的布魯氏菌BP26、0MP25或0MP31抗原包被于反應膜檢測線T位 置；質(zhì)控線C位置包被有羊或兔抗鼠 IgG抗體。
[0010] 本發(fā)明應用膠體金免疫層析技術，旨在檢測血清、血漿或全血中的布魯氏菌抗體。 檢測時，若待測樣品中含有達到閾值的布魯氏菌抗體，足量的布魯氏菌抗體與膠體金墊中 的抗人IgG-膠體金復合物形成布魯氏菌抗體-抗人IgG-膠體金復合物，在毛細作用下， 布魯氏菌抗體-抗人IgG-膠體金復合物在反應膜上移動，在檢測線T處與工程表達的布魯 氏菌BP26、0MP25或0MP31抗原結合形成肉眼可見的紅色檢測線T，而未與布魯氏菌抗體結 合的抗人IgG-膠體金復合物則越過檢測線T與包被在反應膜質(zhì)控線C位置的羊或兔抗鼠 IgG抗體結合形成紅色質(zhì)控線C ;若樣本中無達閾值的布魯氏菌抗體，則檢測線T不可見，只 見紅色質(zhì)控線C。
[0011] 本發(fā)明調(diào)整膠體金標記技術，有效組合抗體蛋白，使所述試劑盒可在常溫下 (4°C ~30°C)保存；同時，本發(fā)明具有免疫膠體金技術操作簡單、結果判讀快速、無需特殊設 備的優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明的外觀立體示意圖。
[0013] 圖2是本發(fā)明的盒蓋（4)背面示意圖。
[0014] 圖3是本發(fā)明的盒底（7)正面示意圖。
[0015] 圖4是本發(fā)明的試紙條正面示意圖。
[0016] 圖5是本發(fā)明的試紙條側(cè)面示意圖。
[0017] 圖中各數(shù)字表示內(nèi)容如下：1.加樣孔2.檢視窗3.信息記錄欄4.盒蓋5.加 樣孔標注6.結果判別說明7.盒底8.柱9.柱槽10.試紙條槽11.樣品墊12.膠帶 13.反應膜14.檢測線15.質(zhì)控線16.吸樣墊17.基板18.雙面膠19.膠體金墊。

【具體實施方式】
[0018] 提供下述實施例是為了進一步理解本發(fā)明，并不局限于所述最佳實施方式，不對 本發(fā)明的內(nèi)容和保護范圍構成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其他現(xiàn)有 技術的特征相組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相似的產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的保護范圍之 內(nèi)。
[0019] 本發(fā)明包括卡盒和試紙條兩部分，下面結合說明書附圖，對本發(fā)明外觀進行簡述： 圖1所不為所述試劑盒外觀立體圖，盒體分為盒蓋（4)與盒底（7)兩部分，盒蓋與盒底均為 圓角長方形；盒體正面可見加樣孔（1)和檢視窗（2)，加樣孔為長圓形，檢視窗為長方形；在 加樣孔位置可見圖4所示試紙條樣品墊（11 )，在檢視窗位置可見反應膜（13)、檢測線（14) 和質(zhì)控線（15);盒蓋正面印有加樣孔標注（5)、結果判別說明（6)、信息記錄欄（7)。
[0020] 圖2和圖3分別是盒體打開后，盒蓋（4)背面與盒底（7)正面的示意圖，整個盒體 由圖2所示柱（8)和圖3所示柱槽（9)以插接方式連接；圖4所示試紙條置于盒體內(nèi)部，具 體位置在圖3所示盒底（7)上的卡槽（10)中；將盒底、試紙條與盒蓋組裝接合后呈圖1所 /_J、1 〇
[0021] 圖4所示為試紙條正視圖，圖5所示為試紙條側(cè)視圖。試紙條最底層為基板（17)， 材質(zhì)為PVC塑料(聚氯乙烯）；基板上附著一層雙面膠（18)用于固定基板與其他部件；試紙 條前端（圖4、圖5所示左側(cè)）放置膠體金墊（19)，并覆蓋一層較長樣品墊（11 )，樣品墊及膠 體金墊材質(zhì)為無紡布，膠體金墊上吸附有膠體金標記的抗人IgG單克隆抗體；膠體金墊右 端壓在反應膜（13)上，并以膠帶（12)在上端固定，反應膜材質(zhì)為硝酸纖維素膜，反應膜上 包被有檢測抗體（即檢測線T (14))和控制抗體（即質(zhì)控線C (15));試紙條末端（圖4、圖 5所示右側(cè)）為吸樣墊（16)，吸樣墊左端覆蓋反應膜右端，以提供毛細作用力并吸收樣品余 液，吸樣墊材質(zhì)為吸油紙。
[0022] 本發(fā)明卡盒部分選擇有資質(zhì)的供應商進行定制，現(xiàn)對試紙條制備方法進行描述： 所述試紙條的膠體金墊制備方法如下：①膠體金的制備：在濃度為〇. 0049Γ0. 012%的氯 金酸中加入其體積的1. 39Γ2%、濃度為19Γ3%的檸檬酸三鈉，煮沸1(Γ20分鐘，得到膠體 金溶液；②膠體金標記抗人IgG:將①中所得膠體金溶液中用0.2M碳酸鉀溶液調(diào)pH至 8. (T9. 0,加入一定量抗人IgG，置磁力攪拌器上攪拌均勻后，按0. f 0. 6g/100ml在溶液中 加入動物血清蛋白，4°C靜置2小時；③將②中所得抗人IgG-膠體金混合溶液經(jīng)1000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心30分鐘，棄上清液，取沉淀物；④將③中所得沉淀物按riOml/lOOml溶于0. 02M pH 7. 4 Tris-Hcl緩沖液(含0. 29ΓΟ. 6%的動物血清蛋白和0. 019Γ0. 06%疊氮鈉）中，得到 抗人IgG-膠體金復合物溶液；⑤將無紡布浸入④中所得膠體金溶液中，待浸入的無紡布 有液體滲出后，37 °C干燥，即得包被有抗人IgG-膠體金復合物的膠體金墊。
[0023] 所述試紙條反應膜上的檢測線T和質(zhì)控線C的包被方法如下：取高濃度布魯氏菌 BP26、0MP25或0MP31抗原，調(diào)濃度至lmg/ml，加入適量甲醛，用專用噴膜機在反應膜中段包 被檢測線T;取高濃度羊或兔抗鼠 IgG抗體，調(diào)濃度為2mg/ml，加入適量甲醛，用專用噴膜機 在反應膜中段距檢測線T 4~5mm處包被質(zhì)控線C ;檢測線T和質(zhì)控線C均按1(Γ20 μ Ι/ml設 置噴量，反應膜完成包被后，立即置入45°C烘箱中，干燥1小時即得。
[0024] 本發(fā)明使用時需添加一定濃度的磷酸鹽稀釋液，稀釋液成分如下：每lOOOmL稀釋 液含(X 004M Na2HP04,0 . 001M NaH2P04,0. 15M NaCl，溶劑為蒸餾水。
[0025] 使用所述試劑盒檢測方法如下：將干燥密封的試劑盒從包裝內(nèi)取出，平放在實驗 室臺面上，用移液器吸取待測樣本(血清、血漿或全血）10 μ L加入加樣孔，再向加樣孔中滴 加稀釋液1〇〇 μ L，同時將樣本編號填寫在盒蓋正面信息記錄欄，開始觀察結果；20分鐘內(nèi)， 觀察檢視窗處質(zhì)控線C和檢測線Τ是否顯紅色；若質(zhì)控線C和檢測線Τ顯紅色，則說明樣本 中有達到閾值的布魯氏桿菌抗體IgG檢測結果呈陽性；若僅質(zhì)控線C顯色，則檢測結果呈陰 性。
【權利要求】
1. 一種布魯氏菌抗體金標快速檢測試劑盒，其特征在于包含卡盒和試紙條兩部分。
2. 根據(jù)權利要求1所述的布魯氏菌抗體金標快速檢測試劑盒，其特征在于所述卡盒分 為盒蓋（4)與盒底（7)兩部分；盒蓋與盒底由柱（8)和柱槽（9)以插接方式連接，盒蓋與盒 底均為圓角長方形；卡盒正面可見加樣孔（1)和檢視窗（2)，加樣孔為長圓形，檢視窗為長 方形；在加樣孔位置可見試紙條樣品墊（11 )，在檢視窗位置可見反應膜（13)、檢測線T(14) 和質(zhì)控線C (15);盒蓋正面印有加樣孔標注（5)、結果判別說明（6)、信息記錄欄（3)。
3. 根據(jù)權利要求1所述的布魯氏菌抗體金標快速檢測試劑盒，其特征在于所述試紙條 置于卡盒內(nèi)部的盒底（7)上的卡槽（10)中，由基板（17)、雙面膠（18)、樣品墊（11)、膠體金 墊（19)、膠帶（12)、反應膜（13)、吸樣墊（16)組成，膠體金墊上吸附有膠體金標記的單克隆 抗體，反應膜上包被有檢測抗原(顯示為檢測線T (14))和質(zhì)量控制抗體(顯示為質(zhì)控線C (15))。
4. 根據(jù)權利要求3所述試紙條，其特征在于其膠體金標記的單克隆抗體為高效鼠源抗 人IgG單克隆抗體，反應膜上的質(zhì)控抗原為工程表達的布魯氏菌BP26、OMP25或OMP31抗 原，質(zhì)量控制抗體為羊或兔抗鼠 IgG抗體。
【文檔編號】G01N33/569GK104090100SQ201410337480
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權日:2014年7月16日
【發(fā)明者】李克生, 杜惠芬, 楊立雅, 王開倩, 辛彬先, 武建海, 王金芳, 范麗赟 申請人:李克生