一種快速檢測食品中志賀氏菌的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測食品中志賀氏菌的有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的PCR試劑盒，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，本方法使用方便、可靠性好、檢測周期短、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低廉、操作步驟簡單，適用于高通量操作、標(biāo)準(zhǔn)化操作，且能避免因?yàn)闃悠反嬖贒NA聚合酶的抑制因子而得到假陰性結(jié)果導(dǎo)致的誤判，可用于多種食品中志賀氏菌的檢測等。所述方法包括：（1）利用primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)的針對志賀氏菌的一對特異性引物ipaHF/ipaHR，再增加擴(kuò)增原核生物16S rDNA保守序列的27F/1492R引物作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，2對引物共同進(jìn)行擴(kuò)增；（2）取待檢測樣品增菌培養(yǎng)6?8小時(shí)，培養(yǎng)后的增菌液采用煮沸凍融法提取基因組DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增；（3）取試劑盒的PCR反應(yīng)預(yù)混液配置25μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后紫外燈下觀察檢測結(jié)果。
【專利說明】
一種快速檢測食品中志賀氏菌的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測食品中志賀氏菌的有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的PCR試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]志賀氏菌屬是一類革蘭氏陰性桿菌，是人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌，通稱痢疾桿菌。志賀氏菌導(dǎo)致的細(xì)菌性痢疾是最常見的腸道傳染病，夏秋兩季患者最多。志賀氏菌也是一種最常見的食源性致病菌。傳染源主要為病人和帶菌者，通過污染了痢疾桿菌的食物、飲水等經(jīng)口感染。人主要通過食用被志賀氏菌污染的食品而感染發(fā)病，以全身中毒癥狀、潰瘍和大腸化膿性炎癥為主要臨床特征，食用被志賀氏菌污染的食物，一般情況將在6至24小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)如下癥狀:惡寒、發(fā)熱、嘔吐、腹痛、頻繁的腹瀉，水樣便，混有血液和黏液；嚴(yán)重者出現(xiàn)(兒童多見)驚厥、昏迷，或手腳發(fā)冷、發(fā)紺、脈搏細(xì)而弱，血壓低等表現(xiàn)。。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年的人類痢疾病例有1.647億，其中的1.632億病例發(fā)生在發(fā)展中國家，并導(dǎo)致110萬人死亡，志賀氏菌病的危害遠(yuǎn)大于現(xiàn)有的想象。食品中的志賀氏菌與食品安全以及人類的生命健康有著很大的關(guān)系，因此，對志賀氏菌的檢測研究非常重要。
[0003]目前常用的檢測方法主要包括快速生化檢測儀器法、毒素檢測法、免疫法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amp Iifi cat 1n，LAMP)和基因芯片技術(shù)等。目前，對志賀氏菌的檢測方法參考的國標(biāo)(GB 4789.5一2012)是一種實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法，米集樣品后，用增菌液先進(jìn)行增菌培養(yǎng)16 h-20 h，再用增菌液分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板上，于36°C土TC培養(yǎng)20 h?24 h，觀察各個(gè)平板上生長的菌落形態(tài)，再挑取可疑菌落進(jìn)行生化鑒定或者運(yùn)用生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。這種實(shí)驗(yàn)室規(guī)方法的缺點(diǎn)是檢驗(yàn)步驟繁瑣、耗時(shí)長、準(zhǔn)確率低，且一次檢測完成樣品項(xiàng)數(shù)較少，不能應(yīng)對市場需求的快速準(zhǔn)確檢驗(yàn)方法的要求。全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)所用試劑和儀器都比較昂貴，而且對操作人員的要求較高，尤其對于大批量樣品的檢測成本非常高，不適合一般實(shí)驗(yàn)室。LAMP方法對可能因?yàn)闃悠反嬖趯γ富钚跃哂幸种谱饔玫奈镔|(zhì)而導(dǎo)致的結(jié)果呈現(xiàn)假陰性不能進(jìn)行鑒別;LAMP方法敏感性非常高，且容易形成氣溶膠污染，產(chǎn)生假陽性，造成檢測結(jié)果錯(cuò)誤;ELISA免疫學(xué)方法操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且不便于標(biāo)準(zhǔn)化及高通量操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]鑒于上述各種方法的不足，本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測周期短、敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡單、成本低廉、可準(zhǔn)確地檢測食品中志賀氏菌的試劑盒及方法，可在I d之內(nèi)得到結(jié)果，同時(shí)無需昂貴的儀器和復(fù)雜的試劑，避免因?yàn)闃悠反嬖贒NA聚合酶的抑制因子而得到假陰性結(jié)果導(dǎo)致的誤判，可用于多種食品中志賀氏菌的檢測等。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種快速檢測食品中志賀氏菌的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)PCR試劑盒，其特征在于使用依次按照如下步驟進(jìn)行:
(1)樣品的米集:無菌米集可疑食品；
(2)增菌培養(yǎng):將采集的可疑食品混合均勻后無菌取樣，液體食品直接量取，固體食品放入無菌研缽、組織研磨器或均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)2?5 min，加入無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37± 1°C振蕩培養(yǎng)6?8 h，得到增菌液；
(3)DNA提取:取培養(yǎng)后的增菌液，振蕩混勻，取Iml于離心管中1000?1500 r/mim離心I?2 min，除去較大塊的碎片，取上清8000?12000 r/mim離心I?2 min，傾去上清液，倒置于吸水紙上不同的位置，吸干殘留液體，再用無菌去離子水重懸、洗滌沉淀，8000?12000r/mim離心I?2 min，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，沸水浴5?10 min，冰浴5?10min，1000?5000 r/mim離心5?10 min，上清液即為樣品模板DNA，調(diào)整濃度至約為10?30ng/μ I備用，或-20 °C保存；
(4)PCR反應(yīng)管制備:PCR反應(yīng)管的制備及PCR反應(yīng)預(yù)混液的融化均置于冰上進(jìn)行;依次取PCR反應(yīng)預(yù)混液24 μ?，樣品模板DNA I μ?，加入至無菌PCR反應(yīng)管中混合均勻，制得樣品模板DNA的PCR反應(yīng)管;然后制備陰性對照品和陽性對照品的PCR反應(yīng)管，直接取相應(yīng)管中預(yù)混液25μ1即可;每擴(kuò)增一次，陰性對照和陽性對照都至少各有I管；
(5)擴(kuò)增檢測:將制備的樣品模板DNA、陰性對照品、陽性對照品的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
(6)檢測結(jié)果判定:取Ig瓊脂糖溶于100 ml電泳緩沖液中，混合均勻后煮沸，冷卻，加入DNA染料，傾倒凝膠板;凝膠冷卻凝固后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 yl加入凝膠孔中進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后，將凝膠放置于紫外燈下觀察，判定結(jié)果；(a)陽性對照的凝膠孔有約1500 bp和約250 bp兩條電泳條帶而陰性對照的凝膠孔無任何條帶，則PCR反應(yīng)檢測成功；(b)若陰性對照有2條帶，說明PCR反應(yīng)管制備過程中有交叉污染，結(jié)果不可靠，建議重新進(jìn)行PCR檢測；(c)陽性對照有2條帶，陰性對照沒有條帶，被檢樣品的凝膠孔只出現(xiàn)I條約1500bp的電泳條帶，與陽性對照的凝膠孔相應(yīng)條帶大小一致，則結(jié)果判斷為陰性；(d)被檢樣品的凝膠孔出現(xiàn)的2條電泳條帶與陽性對照的凝膠孔中相應(yīng)條帶大小一致，陰性對照無條帶，則判定為被檢樣品陽性；(e)陽性對照的凝膠孔有兩條電泳條帶，陰性對照的凝膠孔無任何條帶，而被檢樣品的凝膠孔在約1500 bp的位置沒有條帶則說明樣品處理過程中存在酶抑制劑或操作失誤，建議換其他方法進(jìn)行樣品處理再重新進(jìn)行檢測；(f)陽性對照和陰性對照孔都沒有條帶，說明試劑盒失效，本次檢測結(jié)果無效。
[0006]本發(fā)明的有益效果:與現(xiàn)有的檢測方法相比，本發(fā)明能夠根據(jù)ipaHF、ipaHR引物的擴(kuò)增結(jié)果實(shí)現(xiàn)對志賀氏菌的特異性檢測；同時(shí)，可以根據(jù)27F、1492R引物的擴(kuò)增結(jié)果鑒別因試劑或反應(yīng)體系中存在PCR反應(yīng)抑制成分而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果，能夠提示部分假陰性結(jié)果可能引起的誤判，對提尚食品安全檢測水平具有一定意義。
【附圖說明】
[0007]圖1到圖4中，M:250bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；陰:陰性對照；陽:陽性對照。
[0008]圖1:陰性對照無條帶，而陽性對照在約1500bp和250bp處分別有2條電泳條帶，說明檢測成功。第I泳道有2條帶與陽性對照位置一致，說明檢樣I呈陽性，而檢樣2只在約1500bp處有I條擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)條帶，在約250bp處無條帶，說明檢樣2為陰性。
[0009]圖2:陰性對照和陽性對照在約1500bp和250bp處均有2條電泳條帶，說明樣品處理過程中被交叉污染，檢測結(jié)果不可信，需要重新進(jìn)行檢測。
[0010]圖3:陰對照無條帶，陽性對照有2條電泳條帶，而檢樣I在約1500bp處無擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)條帶，說明樣品處理過程中存在抑制DNA聚合酶活性的物質(zhì)或操作失誤，檢測結(jié)果不可信，需要重新進(jìn)行處理后檢測。
[0011]圖4:實(shí)際樣品檢測結(jié)果。
[0012]以上所述，僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)所述以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
[0013]
[0014]
[0015]
[0016]
[0017]
【具體實(shí)施方式】
實(shí)施例
[0018]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0019]1.無菌采集可疑食品后取25 g，用無菌研缽或研磨器研磨碎，或者用無菌均質(zhì)袋均質(zhì)2 min，與225 ml營養(yǎng)肉湯增菌液混合，置于37±TC增菌培養(yǎng)6_8 h，得到增菌液；
2.增菌液振蕩混勻后取1.5ml增菌液至離心管中，1000r/min離心I min去除食品碎片，取上清10000 r/min離心2 min，棄上清，用無菌去離子水重懸沉淀，10000 r/min離心2min，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，沸水浴5 min，冰浴5 min, 1000 r/min離心5min，取上清液，得樣品模板DNA;
3.將試劑盒中的PCR反應(yīng)預(yù)混液等置于冰上融化后，取PCR反應(yīng)預(yù)混液24μ?置于PCR反應(yīng)管中，再加入模板DNA I μ?，用移液器吹打混合均勻；按照樣品DNA的PCR反應(yīng)管制備方法依次制備陰性對照品和陽性對照品的PCR反應(yīng)管;然后制備陰性對照品和陽性對照品的PCR反應(yīng)管，直接取相應(yīng)管中預(yù)混液25μ1即可;每擴(kuò)增一次稱都至少有一管陰性對照和一管陽性對照；
4.PCR反應(yīng)管制備好之后置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，具體反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性4 min；94 °C 變性 30 s、59.1°C 退火 30 s、72°C 延伸 90 s，30 個(gè)循環(huán);72 °C 延伸 1 min；
5.PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ? PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，紫外燈下觀察檢測結(jié)果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速檢測食品中志賀氏菌的試劑盒，其特征是: 該試劑盒包含:無菌去離子水、PCR反應(yīng)預(yù)混液、對照品和DNA染料； 所述PCR反應(yīng)預(yù)混液含有PCR反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、Taq DNA聚合酶，檢測用引物； 所述檢測用引物為志賀氏菌的特征性引物ipaHF、ipaHR和擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)引物27F、1492R，其序列分別為: ipaHF:GAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGG； ipaHR:GTGATTATGAATGGTGCAGTCGTGAGC； 27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG； 1492R:TACGGYTACCTTTGTTACGACTT； 所述對照品分為陰性對照品和陽性對照品，陰性對照品模板為無菌去離子水，陽性對照品模板為ipaHF / ipaHR的擴(kuò)增產(chǎn)物連接至T載體后獲得的質(zhì)粒基因組。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測食品中大腸桿菌0157:H7的試劑盒，其特征是:擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)引物27?和1492郎勺終濃度均為0.4 mM。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測食品中志賀氏菌的試劑盒，其特征是:所述志賀氏菌的特異性引物序列為 ipaHF: GAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGG和 ipaHR:GTGATTATGAATGGTGCAGTCGTGAGC。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種快速檢測食品中大腸桿菌0157:H7的試劑盒，其特征是:所述志賀氏菌的特異性引物ipaHF和ipaHR的終濃度均為0.4 mM。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測食品中志賀氏菌的試劑盒，其特征是: 使用本試劑盒快速檢測食品中志賀氏菌的方法是: (1)樣品的米集:無菌米集可疑食品； (2)增菌培養(yǎng):將采集的可疑食品混合均勻后無菌取樣，液體食品直接量取，固體食品放入無菌研缽、組織研磨器或均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)2?5 min，加入無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37± 1°C振蕩培養(yǎng)6?8 h，得到增菌液； (3)DNA提取:取培養(yǎng)后的增菌液，振蕩混勻，取Iml于離心管中1000?1500 r/mim離心1?2 min，除去較大塊的碎片，取上清8000?12000 r/mim離心I?2 min，傾去上清液，倒置于吸水紙上不同的位置，吸干殘留液體，再用無菌去離子水重懸、洗滌沉淀，8000?12000r/mim離心I?2 min，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，沸水浴5?10 min，冰浴5?10min，1000?5000 r/mim離心5?10 min，上清液即為樣品模板DNA，調(diào)整濃度至約為10?30ng/μ I備用，或-20 °C保存； (4)PCR反應(yīng)管制備:PCR反應(yīng)管的制備及PCR反應(yīng)預(yù)混液的融化均置于冰上進(jìn)行；依次取PCR反應(yīng)預(yù)混液24 μ?，樣品模板DNA I μ?，加入至無菌PCR反應(yīng)管中混合均勻，制得樣品模板DNA的PCR反應(yīng)管;然后制備陰性對照品和陽性對照品的PCR反應(yīng)管，直接取相應(yīng)管中預(yù)混液25μ1即可;每擴(kuò)增一次，陰性對照和陽性對照都至少各有I管； (5)擴(kuò)增檢測:將制備的樣品模板DNA、陰性對照品、陽性對照品的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (6)檢測結(jié)果判定:取Ig瓊脂糖溶于100 ml電泳緩沖液中，混合均勻后煮沸，冷卻，加入DNA染料，傾倒凝膠板;凝膠冷卻凝固后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 yl加入凝膠孔中進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后，將凝膠放置于紫外燈下觀察，判定結(jié)果；(a)陽性對照的凝膠孔有約1500 bp和約250 bp兩條電泳條帶而陰性對照的凝膠孔無任何條帶，則PCR反應(yīng)檢測成功；(b)若陰性對照有2條帶，說明PCR反應(yīng)管制備過程中有交叉污染，結(jié)果不可靠，建議重新進(jìn)行PCR檢測；(c)陽性對照有2條帶，陰性對照沒有條帶，被檢樣品的凝膠孔只出現(xiàn)I條約1500 bp的電泳條帶，與陽性對照的凝膠孔相應(yīng)條帶大小一致，則結(jié)果判斷為陰性；(d)被檢樣品的凝膠孔出現(xiàn)的2條電泳條帶與陽性對照的凝膠孔中相應(yīng)條帶大小一致，陰性對照無條帶，則判定為被檢樣品陽性；(e)陽性對照的凝膠孔有兩條電泳條帶，陰性對照的凝膠孔無任何條帶，而被檢樣品的凝膠孔在約1500 bp的位置沒有條帶則說明樣品處理過程中存在酶抑制劑或操作失誤，建議換其他方法進(jìn)行樣品處理再重新進(jìn)行檢測；(f)陽性對照和陰性對照孔都沒有條帶，說明試劑盒失效，本次檢測結(jié)果無效。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種快速檢測食品中志賀氏菌的試劑盒，其特征是:PCR反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)預(yù)混液24 μ?、樣品模板DNA I μ?，而3管對照品直接吸取相應(yīng)管中預(yù)混液25μ?即可。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種快速檢測食品中志賀氏菌的試劑盒及方法，其特征是:進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，具體反應(yīng)程序?yàn)?94 °C預(yù)變性4 min，然后30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94 °C變性30 s、.59.1°C退火30 s、72°C延伸90 S，最后72°C延伸 10 min。
【文檔編號】C12Q1/68GK105821130SQ201610272893
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】勵(lì)建榮, 張德福, 劉雪飛, 張明, 方亞琴, 徐永霞, 李婷婷, 李春, 湯軼偉, 高雪, 白鳳翎
【申請人】渤海大學(xué)