一種生物結(jié)皮中荒漠藻生物量的測(cè)定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種生物結(jié)皮中荒漠藻生物量的測(cè)定方法，涉及藻類(lèi)生物學(xué)領(lǐng)域。該方法包括采樣、過(guò)篩、研磨、浸提和荒漠藻生物量測(cè)定步驟。其中浸提步驟中，采用超聲波萃取或微波萃取或超聲-微波協(xié)同萃取。本發(fā)明采用超聲波或微波輔助測(cè)定生物結(jié)皮中荒漠藻生物量的方法不僅大大縮短了測(cè)定的時(shí)間，而且葉綠素的得率較高，并減少了浸提過(guò)程中葉綠素的氧化分解，能更加準(zhǔn)確、客觀的反映荒漠藻的生物量。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種生物結(jié)皮中荒漠藻生物量的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藻類(lèi)生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種生物結(jié)皮中荒漠藻生物量的測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]荒漠藻也稱(chēng)單細(xì)胞藻類(lèi)，是指那些形態(tài)微小，在顯微鏡下才能辨別其結(jié)構(gòu)的微小藻類(lèi)的總稱(chēng)。它不是一個(gè)分類(lèi)學(xué)的名詞，而是一類(lèi)能進(jìn)行光合作用的微生物，其中還包括藍(lán)細(xì)菌(Cranobacteria)。它們?cè)谧匀唤绲姆植紡V泛,無(wú)論是在干燥的陸地,還是淡水湖泊和海洋等水域，都能發(fā)現(xiàn)荒漠藻的存在。它們生長(zhǎng)周期短、繁殖快、易培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)全面，富含多種色素及其他高附加值生物活性物質(zhì)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及保健品等行業(yè)。此外，荒漠藻還是干旱、半干旱生態(tài)系統(tǒng)的先鋒植物和開(kāi)拓者，許多藻類(lèi)可以分泌胞外多糖，并與絲狀藻絞結(jié)在一起，粘結(jié)沙粒，形成藻結(jié)皮，保持土壤水分，增加土壤養(yǎng)分，起到重要的生態(tài)作用。但是，因?yàn)槠湫螒B(tài)微小，且脅迫條件下的生物量較低，不易測(cè)定，所以，急需一種測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，且測(cè)定方法簡(jiǎn)單易行的藻類(lèi)生物量測(cè)定方法。
[0003]藻類(lèi)生物量可以直接用藻類(lèi)葉綠素a含量來(lái)反映，超聲波或微波輔助提取葉綠素a就是一個(gè)很好的方法。
[0004]超聲波輔助提取法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物活性物質(zhì)的提取，其主要是利用超聲波的空化效應(yīng)，使溶劑能夠快速滲透到細(xì)胞內(nèi)部，溶解其中的化學(xué)成分；同時(shí)，超聲波的機(jī)械振動(dòng)也促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的擴(kuò)散，加速了其溶解速度，且此過(guò)程是一個(gè)物理過(guò)程，全過(guò)程中無(wú)化學(xué)反應(yīng)，所以浸提物的化學(xué)結(jié)構(gòu)并不會(huì)發(fā)生變化。超聲波提取能有效縮短浸提時(shí)間，提高浸提得率，為葉綠素的提取提供了一種快速、有效的新方法。
[0005]微波萃取法是根據(jù)不同物質(zhì)對(duì)微波吸收能力的不同，將物質(zhì)選擇性的加熱，降低了物質(zhì)的介電常數(shù)，使得被萃取的物質(zhì)向介電常數(shù)較小的萃取劑中擴(kuò)散，從而使萃取得率提高。微波輔助萃取技術(shù)具有使用設(shè)備簡(jiǎn)單、快速高效、污染較小的特點(diǎn)。
[0006]雖然有機(jī)溶劑浸提法可以提取葉綠素a，但是需要過(guò)夜浸提，耗時(shí)較長(zhǎng)，且提取的效率不高，并不能客觀的反映荒漠藻生物量。采用超聲波或微波輔助提取葉綠素a，大大縮短了提取時(shí)間，提高了葉綠素a得率，能更加準(zhǔn)確、客觀的反映荒漠藻的生物量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在測(cè)定荒漠藻中存在的不足，提供了一種生物結(jié)皮中荒漠藻生物量的測(cè)定方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]一種生物結(jié)皮中荒漠藻生物量的測(cè)定方法，其步驟如下:
[0010](I)采樣:針對(duì)半干旱、干旱地區(qū)的沙地生態(tài)系統(tǒng)，選取生物結(jié)皮良好的典型沙丘，用經(jīng)酒精消毒的環(huán)刀取樣，封口塑料袋收集樣品，并迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；
[0011](2)過(guò)篩:對(duì)采集的樣品過(guò)1_篩，除去枯枝落葉及苔蘚類(lèi)植物；[0012](3)研磨:取過(guò)篩后的樣品于研缽中充分研磨，使藻細(xì)胞破碎，利于葉綠素浸提；
[0013](4)浸提:在研磨后的樣品中加入N-N-二甲基甲酰胺，充分振蕩，然后超聲波萃取或微波萃取或超聲_微波協(xié)同萃取；
[0014](5)荒漠藻生物量測(cè)定:將浸提處理后的樣品于5000r/min離心lOmin，取上清液，于分光光度計(jì)664nm、647nm、625nm和603nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)公式ug/g = (12.92 X A664-2.16ΧΑ647+1.44ΧΑ625-4.91 XA603) X 5ml/g 計(jì)算葉綠素含量。
[0015]所述的測(cè)定方法，過(guò)篩后的樣品和加入的N-N-甲基甲酰胺的比為1: 5g/ml。
[0016]所述的超聲波萃取條件為100?500W,處理20?IOOmin ;微波萃取條件為100?700W,處理I?IOmin ;超聲-微波協(xié)同萃取條件為超聲波100?500W，處理10?40min，然后再微波100?700W，處理I?5min。
[0017]本發(fā)明的有益效果為:(I)采用超聲波或微波輔助測(cè)定生物結(jié)皮中荒漠藻生物量的方法大大縮短了測(cè)定的時(shí)間。傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑浸提法往往需要相當(dāng)長(zhǎng)的浸提時(shí)間，甚至需過(guò)夜浸提，而此方法節(jié)省時(shí)間，僅需一小時(shí)左右甚至幾分鐘即可完成測(cè)定。(2)葉綠素的得率較高，且減少了浸提過(guò)程中葉綠素的氧化分解。傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑浸提葉綠素的得率不高，且浸提的時(shí)間較長(zhǎng)，葉綠素的氧化分解嚴(yán)重，而超聲波或微波輔助測(cè)定生物結(jié)皮中荒漠藻生物量的方法，提取的時(shí)間短，葉綠素得率高，有效的減少了葉綠素的氧化分解，使得生物量的測(cè)定更加準(zhǔn)確、客觀。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為不同測(cè)定方法對(duì)藻類(lèi)生物量的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0020]實(shí)施例1
[0021](I)采樣:針對(duì)半干旱、干旱地區(qū)的沙地生態(tài)系統(tǒng)，選取生物結(jié)皮良好的典型沙丘，用經(jīng)酒精消毒的環(huán)刀取樣，封口塑料袋收集樣品，并迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。
[0022](2)樣品處理:將采集的樣品過(guò)1_篩，除去枯枝落葉及苔蘚類(lèi)植物,避免其中的葉綠素對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。取過(guò)篩后的2.0Og樣品于研缽中進(jìn)行充分研磨，使藻細(xì)胞破碎，利于葉綠素的浸提。
[0023](3)浸提:取IOml N_N_ 二甲基甲酰胺(DMF)，加入研磨后的樣品中，充分振蕩，利用超聲波輔助萃取，400W，處理60min。
[0024](4)荒漠藻生物量測(cè)定:將浸提后的樣品于5000r/min離心lOmin，取上清液，于分光光度計(jì)664nm、647nm、625nm和603nm下測(cè)定吸光度,根據(jù)公式ug/g=(12.92XΑ664_2.16XA647+1.44ΧΑ625-4.91 XA603) X 5m/g 計(jì)算葉綠素 a 含量。
[0025]實(shí)施例2
[0026](I)采樣:針對(duì)半干旱、干旱地區(qū)的沙地生態(tài)系統(tǒng)，選取生物結(jié)皮良好的典型沙丘，用經(jīng)酒精消毒的環(huán)刀取樣，封口塑料袋收集樣品，并迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。
[0027](2)樣品處理:將采集的樣品過(guò)Imm篩，除去枯枝落葉及苔蘚類(lèi)植物，避免其中的葉綠素對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。取過(guò)篩后的2.0Og樣品于研缽中進(jìn)行充分研磨，使藻細(xì)胞破碎，利于葉綠素的浸提。
[0028](3)浸提:取IOml N_N_二甲基甲酰胺((DMF)，加入研磨后的樣品中，充分振蕩，利用微波萃取，300W,處理5min。
[0029](4)荒漠藻生物量測(cè)定:將浸提后的樣品于5000r/min離心lOmin，取上清液，于分光光度計(jì)664nm、647nm、625nm和603nm下測(cè)定吸光度,根據(jù)公式ug/g=(12.92XΑ664_2.16XA647+1.44ΧΑ625-4.91 XA603) X 5ml/g 計(jì)算葉綠素 a 含量。
[0030]實(shí)施例3
[0031](I)采樣:針對(duì)半干旱、干旱地區(qū)的沙地生態(tài)系統(tǒng)，選取生物結(jié)皮良好的典型沙丘，用經(jīng)酒精消毒的環(huán)刀取樣，封口塑料袋收集樣品，并迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。
[0032](2)樣品處理:將采集的樣品過(guò)1_篩，除去枯枝落葉及苔蘚類(lèi)植物,避免其中的葉綠素對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。取過(guò)篩后的2.0Og樣品于研缽中進(jìn)行充分研磨，使藻細(xì)胞破碎，利于葉綠素的浸提。
[0033](3)浸提:取IOmlN-N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入研磨后的樣品中，充分振蕩，利用超聲波萃取，400W，處理30min，取出樣品，繼續(xù)微波輔助萃取，300W,處理4min。
[0034](4)荒漠藻生物量測(cè)定:將浸提后的樣品于5000r/min離心lOmin，取上清液，于分光光度計(jì)664nm、647nm、625nm和603nm下測(cè)定吸光度,根據(jù)公式ug/g=(12.92XΑ664_2.16XA647+1.44ΧΑ625-4.91 XA603) X 5ml/g 計(jì)算葉綠素 a 含量。
[0035]實(shí)施例4
[0036](I)采樣:針對(duì)半干旱、干旱地區(qū)的沙地生態(tài)系統(tǒng)，選取生物結(jié)皮良好的典型沙丘，用經(jīng)酒精消毒的環(huán)刀取樣，封口塑料袋收集樣品，并迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。
[0037](2)樣品處理:將采集的樣品過(guò)Imm篩，除去枯枝落葉及苔蘚類(lèi)植物，避免其中的葉綠素對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。取過(guò)篩后的2.0Og樣品于研缽中進(jìn)行充分研磨，使藻細(xì)胞破碎，利于葉綠素的浸提。
[0038](3)浸提:取IOmlN-N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入研磨后的樣品中，充分振蕩，將振蕩后的樣品置于暗室中，過(guò)夜浸提(14?16h)。
[0039](4)荒漠藻生物量測(cè)定:將浸提后的樣品于5000r/min離心lOmin，取上清液，于分光光度計(jì)664nm、647nm、625nm和603nm下測(cè)定吸光度,根據(jù)公式ug/g=(12.92XΑ664_2.16XA647+1.44ΧΑ625-4.91 XA603) X 5ml/g 計(jì)算葉綠素 a 含量。
[0040]實(shí)施例5
[0041]利用超聲波或微波輔助對(duì)生物結(jié)皮中荒漠藻的生物量進(jìn)行測(cè)定，實(shí)施例1?3荒漠藻生物量測(cè)定結(jié)果如圖1所示。
[0042]由圖1可知，對(duì)于同一樣品，采用不同的葉綠素萃取方法對(duì)其藻類(lèi)生物量進(jìn)行測(cè)定，得到不同的結(jié)果，冷浸法的耗時(shí)最長(zhǎng)，需隔夜浸提，但藻類(lèi)生物量仍為最低，為19.68 μ g/g,超聲-微波協(xié)同萃取法耗時(shí)最短，約30min,但藻類(lèi)的生物量卻最高，為24.05yg/g，最接近此樣品中的藻類(lèi)真實(shí)生物量。
[0043]傳統(tǒng)有機(jī)溶劑浸提測(cè)定生物結(jié)皮中荒漠藻的生物量的方法，葉綠素得率不高，且耗時(shí)較長(zhǎng)，甚至需要過(guò)夜浸提，長(zhǎng)時(shí)間的室溫浸提使葉綠素的氧化分解增加，不能準(zhǔn)確、客觀的反映荒漠藻生物量。而采用超聲波或微波輔助對(duì)生物結(jié)皮中荒漠藻的生物量進(jìn)行測(cè)定，可以大大的縮短葉綠素浸提時(shí)間，提高得率，且超聲波或微波輔助浸提，設(shè)備簡(jiǎn)單，適用范圍廣，不會(huì)破壞葉綠素的結(jié)構(gòu)，也不會(huì)加速葉綠素的氧化分解，使其能更加準(zhǔn)確、客觀的反映荒漠藻生物量。
[0044]應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種生物結(jié)皮中荒漠藻生物量的測(cè)定方法，其特征是，其步驟如下: (1)采樣:針對(duì)半干旱、干旱地區(qū)的沙地生態(tài)系統(tǒng)，選取生物結(jié)皮良好的典型沙丘，用經(jīng)酒精消毒的環(huán)刀取樣，封口塑料袋收集樣品，并迅速運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室； (2)過(guò)篩:對(duì)采集的樣品過(guò)Imm篩，除去枯枝落葉及苔蘚類(lèi)植物； (3)研磨:取過(guò)篩后的樣品于研缽中充分研磨，使藻細(xì)胞破碎，利于葉綠素浸提； (4)浸提:在研磨后的樣品中加入N-N-二甲基甲酰胺，充分振蕩，然后超聲波萃取或微波萃取或超聲-微波協(xié)同萃??； (5)荒漠藻生物量測(cè)定:將浸提處理后的樣品于5000r/min離心lOmin，取上清液，于分光光度計(jì)664nm、647nm、625nm和603nm下測(cè)定吸光度,根據(jù)公式ug/g=(12.92XΑ664_2.16XA647+1.44ΧΑ625-4.91 XA603) X 5ml/g 計(jì)算葉綠素含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征是，過(guò)篩后的樣品和加入的N-N-二甲基甲酰胺的比為1: 5g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征是，所述超聲波萃取條件為100?500W，處理20?IOOmin ;微波萃取條件為100?700W,處理I?IOmin ;超聲-微波協(xié)同萃取條件為超聲波100?500W，處理10?40min，然后再微波100?700W，處理I?5min。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK103837486SQ201410084285
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】王曉江, 季祥, 張文軍, 苗小麗, 武永智, 王少昆, 李?lèi)?ài)平, 洪光宇 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院