溶液的攪拌方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種促進被固定化于分析用芯片的選擇結合性物質與被檢物質的選擇性結合反應，特別是能夠以短時間進行被檢物質的分析的手段。本發(fā)明為在分析用芯片的凹部注入包含被檢物質的溶液時，在凹部的空間以殘留該空間的一部分的方式注入，施加1×g以上的離心加速度使分析用芯片回轉旋轉，將被檢物質溶液進行攪拌的方法。
【專利說明】溶液的攪拌方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及包含被檢物質的溶液的攪拌方法，對使包含被檢物質的溶液與被固定化于基板上的與被檢物質選擇性結合的物質(本說明書中稱為“選擇結合性物質”。)接觸來進行反應時的溶液進行攪拌的方法。

【背景技術】
[0002]分析用芯片具有固定化有作為與被檢物質選擇性結合的物質的選擇結合性物質(核酸、蛋白質、脂質、糖等)的基板，使該基板上的選擇結合性物質與被檢物質通常在溶液中進行雜交反應，由其反應結果來用于分析被檢物質中包含的物質的存在有無、狀態(tài)或量等。作為該基板，一般使用玻璃制、金屬制、樹脂制的基板。
[0003]作為分析用芯片的一方式，以例如數(shù)十?數(shù)萬這樣的大量基因表達的同時測定作為目的，有在基板上高密度地配置DNA、蛋白質、糖鏈等分子的被稱為微陣列的方式。通過使用微陣列，從而能夠基于核酸/核酸間雜交反應進行核酸的檢測、定量，基于蛋白質/蛋白質間、糖鏈/糖鏈間或糖鏈/蛋白質間的特異性反應進行蛋白質、糖鏈的檢測、定量，可以進行例如各種疾病動物模型、細胞生物學現(xiàn)象中的體系并且窮盡基因表達解析。具體而言，能夠使基因的功能，即基因編碼的蛋白質清楚，并且特定蛋白質表達的時期、作用的場所。通過利用微陣列來解析生物的細胞或組織水平的基因表達的變化，與生理學的、細胞生物學的、生物化學的事實現(xiàn)象數(shù)據(jù)組合來構建基因表達圖譜數(shù)據(jù)庫，從而能夠探索疾病基因、治療相關基因的檢索、治療方法。
[0004]在分析用芯片中，DNA微陣列(DNA芯片)基于核酸/核酸間雜交反應來用于核酸的檢測、定量等。作為DNA芯片，例如，使用在玻璃制的平面基板上，高密度地排列固定化有大量的DNA片段的DNA芯片。DNA芯片通過例如，使研究對象細胞的表達基因等用熒光色素等標記了的樣品在平面基板上進行雜交，使互相互補的核酸(DNA或RNA)彼此結合，用高析像度檢測裝置(掃描儀)高速地讀取該處的熒光的方法；基于電化學反應來檢測電流值等的應答的方法，從而用于檢測樣品中的各基因或測定其量。此外，DNA芯片不僅在利用表達基因的檢測、定量進行基因表達解析，而且在基因的單堿基置換(SNP)的檢測等應用領域中也大受:期待。
[0005]此外，分析用芯片不僅作為DNA等核酸，而且作為蛋白質、糖類等的檢查、解析手段也被利用。特別是，在蛋白質分析用芯片中，抗體、抗原、酶底物等蛋白質被固定化于基板上。
[0006]在專利文獻I中，記載了使具有凹凸結構的分析用芯片旋轉，使分析用芯片中的微?；驓馀菀苿觼頂嚢璋粰z物質的溶液的方法，公開了使微?；驓馀菀圆皇刮⒘；驓馀萁佑|固定化有選擇結合性物質的面的方式移動，即使是微量的被檢物質，也以良好的S/N比獲得強熒光信號的方法。
[0007]在專利文獻2中，公開了使具有凹凸結構的分析用芯片在大致水平方向上旋轉，進行被檢物質與選擇結合性物質的選擇性反應時，可以通過使用微粒將被檢物質溶液進行攪拌，從而簡便并且穩(wěn)定地進行的方法。
[0008]在專利文獻3中，公開了通過使裝入有試樣溶液和微粒的容器旋轉，使微粒在重力方向上落下，從而將容器內的試樣溶液進行攪拌的雜交方法和裝置。
[0009]在專利文獻4中，公開了通過在配置有微陣列的專用的雜交用室中，以殘留空間的一部分的方式注入雜交溶液，使室旋轉，從而室內溶液的空間的位置變化，將溶液進行攪拌的雜交方法。
[0010]在專利文獻5中，公開了一邊使設置于轉臺的微陣列公轉一邊使其自身也旋轉，從而將試樣溶液進行攪拌的自轉公轉方式的雜交裝置。
[0011]現(xiàn)有技術文獻
[0012]專利文獻
[0013]專利文獻1:國際公開第2005/090997號
[0014]專利文獻2:日本特開2007-285828號公報
[0015]專利文獻3:日本特開2003-339375號公報
[0016]專利文獻4:日本特許第4473007號公報
[0017]專利文獻5:美國專利第6309875號


【發(fā)明內容】

[0018]發(fā)明所要解決的課題
[0019]在專利文獻I所記載的溶液的攪拌方法中，以例如3rpm這樣的比較低的轉速使分析用芯片旋轉，但在該情況下雜交反應需要10小時，不是適于被檢物質的迅速的檢測的方法。此外，在專利文獻2所記載的被檢物質溶液的攪拌方法中，由于雜交反應需要16小時，因此與專利文獻I的方法同樣，也不是可以適用于被檢物質的迅速的檢測的方法。此外，專利文獻3所公開的方法中，雖然以雜交的時間縮短作為效果而博得好評，但實際上雜交反應需要6小時，適用于要求迅速的診斷的分析是困難的。進一步，專利文獻4所公開的雜交方法通過使室旋轉，與靜置下進行反應的情況下相比，CV值改善了，但信號強度幾乎沒有變化，不是使反應的進行加速的方法。專利文獻5所記載的裝置為能夠用少量的檢體溶液進行微陣列的攪拌的裝置，但對于雜交所需要的時間、其時間縮短沒有提及，是否可以適應于迅速診斷不清楚。
[0020]這些專利文獻I?5所記載的溶液的攪拌方法都是以提高雜交反應的效率來使檢測靈敏度提高為目的，但實際上雜交反應需要6小時?20小時，不能說是用于顯著地提高使用了分析用芯片的被檢物質的檢測或定量的速度的技術。因此，在使用分析用芯片進行的被檢物質的分析中，在要求數(shù)分鐘?最多2小時以內這樣的短時間的檢測或定量的分析，例如流行性感冒等傳染病、敗血癥等的檢查、診斷用途中，用于以能夠滿足其要求那樣的速度進行分析的被檢物質溶液的攪拌方法迄今為止還不存在。
[0021]本發(fā)明為了解決上述課題，其目的在于提供促進被固定化于分析用芯片的選擇結合性物質與被檢物質的選擇性結合反應(雜交反應)的進行，特別是能夠以短時間進行被檢物質的分析的手段。
[0022]用于解決課題的方法
[0023]為了解決上述課題，本發(fā)明人等對于在使用分析用芯片的被檢物質的分析中，可以促進被檢物質與被固定化了的選擇結合性物質的反應的包含被檢物質的溶液的攪拌方法進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，通過在分析用芯片的凹部以殘留凹部空間的一部分的方式注入包含被檢物質的溶液，施加IXg以上的離心加速度使其回轉旋轉，將溶液進行攪拌，從而能夠以短時間實現(xiàn)穩(wěn)定的選擇性結合反應，從而達成本發(fā)明。
[0024]SP，本發(fā)明由以下(I)?(7)構成。
[0025](I) 一種溶液的攪拌方法，是被注入到分析用芯片中的包含被檢物質的溶液的攪拌方法，該分析用芯片具有注入該包含被檢物質的溶液的凹部，在該凹部的全部底面表面或一部分底面表面固定化與該被檢物質選擇性結合的選擇結合性物質，在分析用芯片的凹部的空間以殘留該空間的一部分的方式注入該包含被檢物質的溶液，對注入有該包含被檢物質的溶液的分析用芯片施加IXg以上的離心加速度使其回轉旋轉。
[0026](2)根據(jù)(I)所述的溶液的攪拌方法，使注入有該包含被檢物質的溶液的分析用芯片以0.1mm以上20mm以下的旋轉半徑進行回轉旋轉。
[0027](3)根據(jù)⑴或⑵所述的溶液的攪拌方法，在上述凹部以殘留10%以上70%以下的空間的方式注入上述包含被檢物質的溶液。
[0028](4)根據(jù)(I)?(3)的任一項所述的溶液的攪拌方法，上述分析用芯片具有彼此被壁面隔開了的注入包含被檢物質的溶液的多個凹部。
[0029](5)根據(jù)⑴?(4)的任一項所述的溶液的攪拌方法，在上述分析用芯片上安裝覆蓋整個上述凹部的蓋，從而將上述包含被檢物質的溶液密閉在該凹部內。
[0030](6)根據(jù)(I)?(5)的任一項所述的溶液的攪拌方法，注入有上述包含被檢物質的溶液的分析用芯片，以上述凹部的底面成為水平或大致水平的方式設置而在水平或大致水平的方向上回轉旋轉。
[0031](7) 一種被檢物質的分析方法，通過(I)?(6)的任一項所述的溶液的攪拌方法使被檢物質與被固定化于分析用芯片的選擇結合性物質結合，檢測與選擇結合性物質結合的該被檢物質。
[0032]發(fā)明的效果
[0033]根據(jù)本發(fā)明的被檢物質溶液的攪拌方法，可以有效地促進被檢物質與被固定化于分析用芯片的選擇結合性物質的選擇性反應，使選擇結合性物質與被檢物質接近的機會顯著地增大。因此，能夠使用分析用芯片以短時間檢測或定量被檢物質溶液所包含的被檢物質。
[0034]此外，根據(jù)本發(fā)明的被檢物質溶液的攪拌方法，即使在使用具有多個注入包含被檢物質的溶液的凹部的分析用芯片的情況下，也可以在相同條件下攪拌各凹部內的溶液，因此可以在相同條件下進行各凹部中的選擇結合性物質與被檢物質的反應，可以抑制凹部間的反應偏差的發(fā)生。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為顯示本發(fā)明的分析用芯片的一例的圖。(a)凹部為I個的分析用芯片的一例，(b)具有多個凹部的分析用芯片的一例，(c)凹部的截面圖。
[0036]圖2為顯示本發(fā)明的分析用芯片的一例的圖。(a)凹部為I個的分析用芯片的一例，(b)具有多個凹部的分析用芯片的一例，(c)凹部的截面圖。
[0037]圖3為顯示本發(fā)明的分析用芯片的一例的圖。(a)凹部為I個的分析用芯片的一例，(b)具有多個凹部的分析用芯片的一例，(C)凹部的截面圖。
[0038]圖4為顯示安裝有蓋的本發(fā)明的分析用芯片的一例的圖。(a)凹部為I個的分析用芯片的一例，(b)具有多個凹部的分析用芯片的一例，(C)凹部的截面圖。
[0039]圖5為顯示本發(fā)明的分析用芯片的凹部的底面的優(yōu)選形狀的一例的俯視圖。(a)六邊形，(b)角進行了 R加工的四邊形，(c)橢圓形。
[0040]圖6為顯示在本發(fā)明的分析用芯片中注入包含被檢物質的溶液時的一方式的分析用芯片的截面圖。
[0041]圖7為例示本發(fā)明的回轉旋轉的圖。
[0042]圖8為例示包含公轉的旋轉方式的圖。
[0043]圖9為表示實施例1?4、比較例I?3中的反應時間與信號強度的關系的圖。
[0044]圖10為圖9的圖中將反應時間為I小時之前的部分放大了的圖。

【具體實施方式】
[0045]在本發(fā)明中，所謂分析用芯片，是指將包含被檢物質的溶液(以下有時稱為“被檢物質溶液”。)注入至該芯片中，用于測定被檢物質的存在的有無、被檢物質的量、被檢物質的性狀等的芯片。具體而言，可舉出通過被固定化于載體表面的選擇結合性物質與被檢物質的反應，來測定被檢物質的量、有無的生物芯片。更具體而言，可舉出將核酸固定化于載體表面的DNA芯片，將以抗體為代表的蛋白質固定化于載體表面的蛋白質芯片，將糖鏈固定化于載體表面的糖鏈芯片，和將細胞固定化于載體表面的細胞芯片等。
[0046]本發(fā)明所使用的分析用芯片中，形成有注入包含被檢物質的溶液的凹部。凹部形成由壁面和底面構成的空間,在凹部的全部底面表面或一部分底面表面固定化有選擇結合性物質。
[0047]以下，使用圖1?6來說明本發(fā)明所使用的分析用芯片的例子。
[0048]圖1中，例示了由平板的基板1(例如，載玻片)、具有貫通孔的板材2構成的分析用芯片?；錓與具有貫通孔的板材2接合，形成了由凹部的壁面3和凹部的壁面4構成的凹部6 (或凹部的空間)。(a)是凹部6為I個的情況的一例，(b)是具有多個凹部6的情況的一例，(c)顯不各凹部的截面。選擇結合性物質被固定化于基板I的表面(上表面)的一部分，但關于其固定化表面，由于基板I與板材2接合，因此凹部6的底面3的一部分成為選擇結合性物質的固定化表面5。
[0049]在圖1所例示那樣的由固定化選擇結合性物質的平板的基板、與具有用于形成凹部的貫通孔的板材構成的分析用芯片中，該平板基板和板材的材質沒有特別限定，可以適合使用例如，玻璃、陶瓷、硅等無機材料、聚對苯二甲酸乙二醇酯、乙酸纖維素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、硅橡膠等高分子材料。平板基板與板材的接合方法沒有特別限定，可以使用粘接劑而以實質上不能裝卸的狀態(tài)粘接，可以為介由雙面帶、樹脂組合物等的粘接層而以能夠裝卸的狀態(tài)粘接。此外，分析用芯片每I片的凹部的數(shù)目可以根據(jù)分析的目的進行設定，可以為I個也可以為多個。
[0050]圖2和圖3中，例示了不使用圖1所例示的具有貫通孔的板材,通過例如注射成型，在基板I上形成有凹部6的分析用芯片。形成于基板I的凹部6具有由底面3和壁面4構成的空間，凹部的底面3的一部分成為選擇結合性物質的固定化表面5。(a)是凹部為I個的情況的一例，(b)是具有多個凹部的情況的一例，(c)顯示凹部的截面的一例。分析用芯片每I片的凹部的數(shù)目可以根據(jù)分析目的選擇任意的數(shù)目。
[0051]在圖2和圖3所例示的分析用芯片中，基板的材質可以使用與上述圖1中例示的分析用芯片中的基板同樣的材質。
[0052]本發(fā)明的溶液的攪拌方法中使用的分析用芯片的凹部的深度沒有特別限定，優(yōu)選為0.1?1mm,更優(yōu)選為0.5?5mm。圖2是凹部6的深度淺的類型的分析用芯片的例子，圖3是凹部6的深度深的類型的分析用芯片的例子。
[0053]在使注入有被檢物質溶液的分析用芯片進行回轉旋轉時，使用圖3那樣的凹部深的分析用芯片的情況下，還能夠不對分析用芯片加蓋而使其直接回轉旋轉。另一方面，在使用圖2那樣的凹部淺的分析用芯片的情況下，優(yōu)選安裝覆蓋整個凹部的蓋而被檢物質溶液密閉于凹部中。優(yōu)選根據(jù)使分析用芯片回轉旋轉的條件(離心加速度、轉速、旋轉半徑)，例如，在凹部的深度為5mm以下的情況下，安裝蓋。
[0054]圖4所例示的分析用芯片為覆蓋整個凹部6的蓋7被安裝于分析用芯片而被檢物質溶液密閉于凹部6的分析用芯片的例子。具體而言，是在圖2或圖3所示的分析用芯片中安裝有平板狀的蓋7而得。(a)是凹部為I個的情況的一例，(b)是具有多個凹部的情況的一例，(c)是顯示凹部的截面。在該例子中，蓋7具備用于將被檢物質溶液注入至凹部的注入孔8。
[0055]作為蓋，可以使用樹脂制、橡膠制、玻璃制等的平板、粘著性帶等密封材料。通過在蓋上設置用于將被檢物質溶液注入至凹部的注入孔，從而可以在將被檢物質溶液注入至凹部后安裝蓋。在該情況下，優(yōu)選注入孔有多個，例如可以每個凹部設置2?4個。另一方面，在被檢物質溶液的注入后安裝蓋的情況下，可以在蓋上設置注入孔也可以不設置，可以適合使用例如用粘著性帶堵塞開放部來進行密閉的方法；使固定有符合開放部形狀的O形環(huán)的板材密合來進行密閉的方法；用粘土樣的物質在開放部加蓋來進行密閉的方法等。
[0056]在雜交反應時，需要防止被檢物質溶液的蒸發(fā)，或將反應溫度嚴密地保持一定的情況下，優(yōu)選將分析用芯片的凹部的空間密閉，在該情況下，優(yōu)選在分析用芯片安裝蓋來使用。
[0057]本發(fā)明的溶液的攪拌方法中使用的分析用芯片的凹部的底面的形狀，優(yōu)選為在使分析用芯片回轉旋轉時，在沒有被被檢物質溶液填充的凹部，殘留的空間(或氣泡)易于移動的形狀。例如，如圖5所示，優(yōu)選使用凹部的底面的形狀為六邊形(a)、四邊形(b)、橢圓形(C)的分析用芯片，因為凹部所殘留的空間(或氣泡)9易于移動。此外，在凹部的底面的形狀為多邊形的情況下，角進行了 R加工(例如，圖5的(b))也優(yōu)選，因為在沒有被被檢溶液填充的凹部殘留的空間(或氣泡)易于移動。
[0058]圖6為顯示在安裝有蓋的分析用芯片中注入包含被檢物質的溶液時的一方式的分析用芯片凹部附近的截面圖。顯示在分析用芯片的凹部的空間6中注入包含被檢物質的溶液，形成沒有被溶液填充的空間(或氣泡)9，安裝有蓋7的狀態(tài)。通過以圖6的狀態(tài)回轉旋轉分析用芯片，從而可以將被檢物質溶液進行攪拌，進行雜交反應。
[0059]本發(fā)明中的所謂選擇結合性物質，是指可以與被檢物質直接或間接地選擇性結合的各種物質。作為可結合于載體表面的選擇結合性物質的代表例，可舉出核酸、蛋白質、肽、糖類、脂質。
[0060]作為核酸，可舉出DNA、RNA，可以為PNA、LNA。作為DNA，可以使用染色體DNA、病毒DNA、細菌、霉菌等的DNAjf RNA反轉錄而得的cDNA、作為它們的一部分的片段等，但不限定于這些。此外，作為RNA，可以使用信使RNA、核糖體RNA、small RNA、micro RNA、作為它們的一部分的片段等，但不限定于這些。此外，還包含化學合成的DNA或RNA等。具有特定堿基序列的單鏈核酸與具有與該堿基序列或其一部分互補的堿基序列的單鏈核酸進行選擇性雜交而結合，因此相當于本發(fā)明中所謂選擇結合性物質。核酸可以為來源于活細胞等天然物的核酸，可以通過核酸合成裝置合成的核酸。關于來自活細胞的DNA或RNA的調制，可以通過公知的方法來進行,例如對于DNA的提取，利用Blin等人的方法(Blin et al.，Nucleic Acids Res.3:2303 (1976))等進行，此外，對于RNA的提取,可以利用Favaloro等人的方法(Favaloro et al., Methods Enzymol.65:718(1980))等進行。作為被固定化的核酸，還可以使用鏈狀或環(huán)狀的質粒DNA、染色體DNA、將它們通過限制性酶或化學地切斷了的DNA片段、在試管內通過酶等合成出的DNA、或化學合成出的寡核苷酸等。
[0061]作為蛋白質，可舉出抗體和Fab片段、F(ab’)2片段那樣的、抗體的抗原結合性片段、以及各種抗原?？贵w、其抗原結合性片段與對應的抗原選擇性結合，抗原與對應的抗體選擇性結合，因此相當于“選擇結合性物質”。
[0062]作為糖類，可舉出各種單糖、寡糖、多糖等糖鏈。
[0063]作為脂質，除了單純脂質以外，可以為復合脂質。
[0064]此外，還可以將上述核酸、蛋白質、糖類、脂質以外的具有抗原性的物質進行固定化。此外，作為選擇結合性物質，可以在載體的表面將細胞進行固定化。
[0065]作為這些選擇結合性物質中特別優(yōu)選的物質，可舉出DNA、RNA、蛋白質、肽、糖、糖鏈、脂質。
[0066]作為本發(fā)明所使用的被檢物質，可舉出要測定的核酸(靶核酸)，例如，病原菌、病毒等的基因、遺傳病的致病基因等以及其一部分，具有抗原性的各種生物體成分，針對病原菌、病毒等的抗體等，但不限定于這些。
[0067]在本發(fā)明的溶液的攪拌方法中，作為包含這些被檢物質的溶液，可以使用血液、血清、血漿、尿、便、髓液、唾液、各種組織液等體液、各種飲食物以及它們的稀釋物等，但不限定于這些。這里，包含被檢物質的溶液的粘度只要是在施加離心加速度使分析芯片回轉旋轉時，沒有被被檢物質溶液填充的分析芯片的凹部的空間能夠移動，則沒有特別限定。
[0068]成為被檢物質的核酸可以對由血液、細胞通過常規(guī)方法提取的核酸進行標記；可以為將該核酸作為模板，通過PCR等核酸擴增法而擴增了的核酸。在后者的情況下，能夠使進行本發(fā)明的攪拌方法之后的測定靈敏度大幅度提高。在將核酸擴增產物作為被檢物質的情況下，通過在被熒光物質等標記了的核苷三磷酸的存在下進行擴增，從而能夠標記擴增核酸。此外，在被檢物質為抗原或抗體的情況下，可以將作為被檢物質的抗原、抗體通過常規(guī)方法直接標記，還可以使作為被檢物質的抗原或抗體與選擇結合性物質結合之后，將載體進行洗滌，使與該抗原或抗體進行抗原抗體反應的標記了的抗體或抗原進行反應，測定結合于載體的標記。此外，在將沒有被擴增的核酸作為被檢物質的情況下，例如通過堿性磷酸酶來除去核酸的5’末端的磷酸基，使標記有熒光物質的被檢物質與選擇結合性物質進行反應，測定結合了的標記的方法；通過選擇結合性物質(捕捉探針)捕捉被檢物質之后，使被檢物質與被熒光物質等標記了的檢測探針進行結合，測定檢測探針的標記的方法(夾心雜交法)是適合使用的。
[0069]本發(fā)明的溶液的攪拌方法中，使上述那樣的實施了標記、擴增等的被檢物質溶解于水溶液、適當?shù)木彌_液等來制成包含被檢物質的溶液(被檢物質溶液)。
[0070]在本發(fā)明的溶液的攪拌方法中，被檢物質溶液向分析用芯片的凹部的空間的注入以殘留凹部的空間的一部分的方式進行，在凹部形成了沒有被被檢物質溶液填充的空間。通過不使凹部的空間被被檢物質溶液完全填充而形成沒有被被檢物質溶液填充的空間，從而可以通過分析用芯片的回轉旋轉而空間在凹部內移動，將被檢物質溶液進行攪拌。在分析用芯片被回轉旋轉時，凹部所形成的空間可以在凹部內以單一的空間方式存在，也可以劃分成多個空間，即成為多個氣泡而存在。
[0071]沒有被被檢物質溶液填充的空間在凹部的空間中所占的比例，其下限優(yōu)選為10%以上，更優(yōu)選為20%以上，上限優(yōu)選為90%以下，更優(yōu)選為80%以下，進一步優(yōu)選為70%以下。沒有被被檢物質溶液填充的空間的比例的范圍優(yōu)選為10%以上90%以下，更優(yōu)選為15%以上80%以下。進一步優(yōu)選為20%以上70%以下。如果該空間的比例少于5%，則在分析用芯片回轉旋轉時，凹部的空間中的被檢物質溶液的移動變得不充分，有可能實質上被檢物質溶液沒有被攪拌，此外如果多于90%，則包含被檢物質的溶液與固定化有選擇結合性物質的區(qū)域接觸的機會減少而導致反應的進行降低。此外，在不對圖3那樣的凹部深的分析用芯片安裝蓋而使其進行回轉旋轉的情況下，沒有被被檢物質溶液填充的空間的比例優(yōu)選為例如30%以上90%以下，更優(yōu)選為40%以上80%以下。
[0072]本發(fā)明的溶液的攪拌方法中，通過使注入有包含被檢物質的溶液的分析用芯片進行回轉旋轉來進行溶液的攪拌。這里，所謂回轉旋轉，是指分析用芯片自身通過圓周運動或橢圓運動來繞旋轉軸周圍旋轉。詳細地說，本發(fā)明的回轉旋轉是指在分析用芯片上的任意一點，都以進行具有各固有的旋轉中心的相同半徑圓周運動那樣進行的旋轉方式。圖7顯示本發(fā)明的回轉旋轉的一例。關于分析用芯片10上的任意的點A、B，點A為在將OA作為中心的半徑r的圓軌道上以規(guī)定轉速進行旋轉，點B也同樣地，在將OB作為中心的半徑r的圓軌道上以規(guī)定轉速進行旋轉。此時，連結分析用芯片10上的任意的點A、B的直線AB在圓周運動的任意的軌道上總是平行。例如，在圖7中，分析用芯片10位于位置P1、位置P2、位置P3、位置P4的任一位置的情況下，直線AB平行。另一方面，在公轉旋轉、自轉公轉旋轉這樣的包含公轉的旋轉方式的情況下，如圖8所示，從公轉的中心O直至分析用芯片10上的任意的點A、點B的距離(ra、rb)分別不同。即，包含公轉的旋轉方式為根據(jù)分析用芯片上的位置不同而圓周運動的旋轉半徑不同的旋轉方式。
[0073]在使分析用芯片進行回轉旋轉時，分析用芯片優(yōu)選以固定化有該選擇結合性物質的面與旋轉面成為平行或大致平行的方式被設置。
[0074]在使用具有多個注入包含被檢物質的溶液的凹部的分析用芯片的情況下，通過進行回轉旋轉，從而可以將各凹部內的溶液在相同條件下進行攪拌，由此可以使各凹部中的選擇結合性物質與被檢物質的反應在相同條件下進行，可以降低凹部間的反應偏差，因此優(yōu)選。另一方面，在通過一邊使分析用芯片公轉一邊使自身旋轉的自轉公轉方式、旋轉中心位于分析用芯片的外側的公轉方式進行攪拌的情況下，有可能多個凹部在各自不同的條件下被攪拌，凹部間產生反應偏差。
[0075]使分析用芯片回轉旋轉時的旋轉面的方向沒有特別限定，可以使用例如水平或大致水平方向、從水平方向傾斜了 15度的方向、從水平方向傾斜了 30度的方向、從水平方向傾斜了 45度的方向、從水平方向傾斜了 60度的方向、從水平方向傾斜了 75度的方向、垂直或大致垂直方向等。優(yōu)選的旋轉面的方向為水平或大致水平方向。這里，所謂大致水平方向，是指與分析用芯片的固定化有選擇性結合物質的面接近于水平的方向，優(yōu)選為例如以水平面作為基準而以O度?3度的范圍傾斜了的方向。此外，所謂大致垂直方向，是指與分析用芯片的固定化有選擇結合性物質的面接近于垂直的方向，優(yōu)選為例如以垂直面作為基準而以O度?3度的范圍傾斜了的方向。
[0076]在本發(fā)明中，關于分析用芯片的回轉旋轉，可以將轉速設為恒定，也可以使轉速變化，此外可以在回轉旋轉中停止一定時間等間歇地進行。此外，旋轉方向沒有特別限定，可以為順時針旋轉也可以為逆時針旋轉，可以為它們的組合。
[0077]反應時進行回轉旋轉的時間沒有特別限定，可以在對于選擇結合性物質與被檢物質進行反應而言充分的范圍內適當決定。例如，在被檢物質為核酸的情況下，可以根據(jù)與作為選擇結合性物質的探針核酸的雜交反應所需要的時間進行設定。本發(fā)明的溶液的攪拌方法具有如下特征，通過在回轉旋轉時施加IXg以上的離心加速度，從而有效地促進被檢物質與選擇結合性物質的選擇性反應，能夠以短時間檢測或定量被檢物質。在有效利用該特征，特別是在檢查、診斷用途中使用分析用芯片的情況下等，要求迅速的檢測或定量的情況下，優(yōu)選回轉旋轉的時間為短時間。例如，在核酸的雜交的情況下，反應時間優(yōu)選為3小時以上4小時以內，更優(yōu)選為2小時以內，進一步優(yōu)選為I小時以內，特別優(yōu)選為0.5小時以內。
[0078]一般而言，所謂離心加速度，是指在進行旋轉運動的體系中，將對物體施加的離心力的大小以加速度的形式表示，其與旋轉中心的距離的絕對值和旋轉運動的角速度的平方成比例。本發(fā)明中的離心加速度是指離心力、即相對離心加速度(Ralative CentrifugeForce ；RCF)，采用以下的式I算出。
[0079]RCF = 1118XRXN2X1(T8..?(式 I)
[0080]RCF:相對離心加速度(Xg)
[0081]R:旋轉半徑(cm)
[0082]N:轉速(rpm)。
[0083]本發(fā)明的溶液的攪拌方法中，在使分析用芯片回轉旋轉時施加IXg以上的離心加速度。離心加速度的下限優(yōu)選為5Xg以上，更優(yōu)選為1Xg以上。離心加速度的上限沒有特別限定，優(yōu)選為50Xg以下，更優(yōu)選為40Xg以下，進一步優(yōu)選為30Xg以下。離心加速度的范圍優(yōu)選為IXg以上50Xg以下，更優(yōu)選為5Xg以上40Xg以下，進一步優(yōu)選為1Xg以上30Xg以下。
[0084]本發(fā)明的溶液的攪拌方法中，通過適當設定使分析用芯片回轉旋轉時的轉速與旋轉半徑，從而可以施加目標的離心加速度。因此，可以根據(jù)對分析用芯片進行攪拌的攪拌裝置的規(guī)格選擇轉速和旋轉半徑來進行。例如，在旋轉半徑小的情況下，通過加大旋轉速度，可以施加大的離心加速度。
[0085]旋轉半徑可以通過與轉速的組合而適當選擇可獲得所期望的離心加速度的值。旋轉半徑的下限優(yōu)選為0.1mm以上，更優(yōu)選為0.2mm以上，進一步優(yōu)選為0.3mm以上。此外，旋轉半徑的上限優(yōu)選為20mm以下，更優(yōu)選為1mm以下，進一步優(yōu)選為5mm以下。作為旋轉半徑的范圍，優(yōu)選為0.1?20mm,更優(yōu)選為0.2?1mm,進一步優(yōu)選為0.3?5mm。如果旋轉半徑大于20mm,則有離心力起支配作用，沒有被被檢物質溶液填充的空間向凹部的外周擠壓的傾向，有時產生攪拌效率的降低、凹部內的攪拌不均勻。另一方面，如果旋轉半徑小于0.1_，則有在旋轉方向上作用的力起支配作用，沒有被被檢物質溶液填充的空間殘留在凹部的中心部的傾向，有時產生攪拌效率的降低、攪拌不均勻。
[0086]此外，回轉旋轉的轉速可以通過與旋轉半徑的組合而適當選擇可獲得所期望的離心加速度的值，優(yōu)選為500rpm以上1000rpm以下，更優(yōu)選為750rpm以上8000rpm以下。旋轉半徑小時，可以將反應裝置、攪拌裝置小型化，可以緊湊地制作實現(xiàn)本發(fā)明的溶液的攪拌方法的裝置，因此優(yōu)選。
[0087]此外，在不對分析用芯片安裝蓋而使其進行回轉旋轉的情況下，為了使被注入了的被檢物質溶液不溢出，因此旋轉半徑小的攪拌裝置適合使用。例如，旋轉半徑優(yōu)選為0.1mm以上5_以下，更優(yōu)選為0.2mm以上4mm以下,進一步優(yōu)選為0.3mm以上3_以下。
[0088]在本發(fā)明中使用的對分析用芯片進行攪拌的攪拌裝置只要能夠以回轉旋轉的轉速與旋轉半徑的組合而施加IXg以上的離心加速度，就沒有特別限定。對于市售品，可以適合使用板振蕩器，可舉出例如 “B1Shake5000elm”、“B1Shake 3000-T elm”、“B1Shake3000 elm” (以上，Q Instruments 社制)、“ ? 7 '> 工一夕”、“ r > 工一夕”、“ r > 工一夕 1536” (以上，Thermo Scientific 制)、“MS3 <— '> 'y ” ”、“MS3 r -7' 夕卟”、“VXR basicVibrax(注冊商標)、“ VORTEX 3，，(以上，IKA 社制)、“ ι 4 々 口:一卜->工一力一N-704” (日伸理化制)、“ 7。> 一卜 '> 工一力一 KM-M01”(力'7' '乂夕義制)、“ 7。> 一卜務今寸一 P-10”(十慈7 ^ 一力卜''制)等。在安裝于自動化裝置的情況下，優(yōu)選為可以從外部控制回轉旋轉的轉速、驅動時間等的裝置。
[0089]在本發(fā)明中，可以在凹部內側的空間添加攪拌子。作為攪拌子，可舉出微粒(珠)、微棒等，特別優(yōu)選為微粒。微粒、微棒的形狀只要能夠在分析用芯片的凹部內移動而將包含被檢物質的溶液進行攪拌，就沒有特別限定。在微粒的情況下，除了球狀以外，可以為多邊形，此外在微棒的情況下，可以成為圓筒形、棱柱形等任意的形狀，優(yōu)選為球狀。此外，微粒的尺寸也沒有特別限定，例如在球狀的微粒的情況下，可以成為直徑0.1 μπι以上1000 μ m以下的范圍，如果考慮到攪拌效率，則更優(yōu)選為直徑50 μ m以上500 μ m以下的范圍。在微棒的情況下，可以成為優(yōu)選為長度50 μ m以上5000 μ m以下,底面直徑10 μ m以上300 μ m以下的范圍。關于微粒、微棒，從攪拌效率等方面出發(fā)，還可以選擇I種使用，除此以外可以2種以上組合使用。
[0090]上述微粒、微棒的材質也沒有特別限定，可以使用玻璃、陶瓷(例如釔部分穩(wěn)定化氧化鋯)、金屬(例如金、鉬、不銹鋼)、塑料(例如尼龍、聚苯乙烯)等。
[0091]本發(fā)明中使用的分析用芯片可以在凹部，在其上部表面具有用于將選擇結合性物質進行固定化的凸部。通過將具有這樣的結構的分析用芯片用于被檢物質的分析，在信號檢測時，使掃描儀的焦點與在固定化有選擇結合性物質的凸部上面一致，從而可以大幅度降低檢測噪聲，可以提高S/N比。此外，本發(fā)明中使用的分析用芯片優(yōu)選由可以降低自身熒光的材料來制造，優(yōu)選為例如固定化選擇結合性物質的凸部中至少其一部分為黑色。
[0092]在本發(fā)明中，作為表示信號檢測靈敏度的指標，可以使用S/N比(信號對噪聲比)。在該情況下，優(yōu)選將S/N = 2作為檢測限度來判斷靈敏度。一般而言，采用S/N比成為2?3的被檢物質濃度或量作為檢測限度，如果S/N為2以上，則可以判斷為進行了具有檢測限度以上的可靠性的檢測。(例如，丹羽誠著，“ 二札々^ t3化學A O統(tǒng)計手法一正P于''一夕O扱P方一”，2008年，化學同人編，101頁)
[0093]本發(fā)明的溶液的攪拌方法與以往相比可以促進被固定化于分析用芯片的選擇結合性物質與被檢物質的選擇性反應的進行，因此能夠將被檢物質以短時間進行檢測或定量。例如，在核酸的雜交中，可以大幅度縮短以往需要6?20小時的反應時間的反應時間。因此，例如，在要求迅速地分析大量檢體的檢查、診斷領域中，使用分析用芯片來進行分析的情況下，優(yōu)選應用本發(fā)明的溶液的攪拌方法。例如，可以優(yōu)選用于流行性感冒等傳染病、敗血癥的檢查、診斷。此外，即使在檢查中心處理巨大數(shù)目的檢體的情況下，也可以迅速地進行分析，因此從減少成本方面出發(fā)，優(yōu)選應用本發(fā)明。
[0094]實施例
[0095]通過以下的實施例進一步詳細地說明本發(fā)明。但是本發(fā)明不限定于下述實施例。
[0096]參考例I
[0097](I)分析用芯片的基板的制作
[0098]使用作為公知的方法的LIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung)工藝，制作注射成型用的模具，通過注射成型法，獲得具有后述那樣的形狀的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制的基板。所用的PMMA的平均分子量為5萬，PMMA中以I重量％的比例含有炭黑(三菱化學制#3050B)，使基板為黑色。測定該黑色基板的光譜反射率與光譜透射率，結果光譜反射率即使在可見光區(qū)域(波長為400nm?800nm)的任一波長都為5%以下，此外，在相同范圍的波長下透射率為0.5%以下。光譜反射率、光譜透射率在可見光區(qū)域都沒有特定的光譜圖案(峰等)，光譜一樣地為平坦的。另外，光譜反射率使用符合JIS Z 8722的條件C的搭載有照明、受光光學系的裝置(S V >夕力^ 9制，CM-2002)，測定射入來自基板的正反射光的情況下的光譜反射率。
[0099]作為基板，使用下述基板:外形為縱76mm、橫26mm、厚度Imm,在基板上設置縱
6.48_、橫6.90_、深度0.12mm的凹部，在該凹部中設置有576處直徑0.1_、高度0.12mm的凸部的基板(以下稱為“基板A”。)。該基板A中，凸部上面與平坦部上面的高度的差為3μπι以下。此外，凸部上面的高度的偏差為3μπι以下。此外，使凸部的間距為0.18mm。
[0100]將上述基板A在1N的氫氧化鈉水溶液中在70°C浸潰12小時。將其以純水、0.1N的HCl水溶液、純水依次洗滌，使基板表面生成羧基。
[0101](2)選擇結合性物質的固定化
[0102]對于基板A，在以下的條件下，分別固定化寡核苷酸作為選擇結合性物質(探針DNA)。作為與4種基因a?d對應的寡核苷酸，使用序列號I?4的堿基序列所示的寡核苷酸(才?口 >社制DNA微陣列用寡核苷酸試劑盒“Homosapiens (Human)AROS V4.0(各60堿基)”)。使該各寡核苷酸溶解于純水中以成為0.3nmol/μ L的濃度，制成儲備溶液。將該儲備溶液點樣(點著)于基板時，用PBS(使8g的NaCl,2.9g的Na2HPO4.12H20、0.2g的KCl和0.2g的KH2PO4合并而溶解于純水，稀釋成1L，在其中添加鹽酸而調整至pH5.5)稀釋10倍，使探針DNA的終濃度為0.03nmol/μ L，并且，為了使PMMA制基板表面所生成的羧基與探針DNA的末端氨基進行縮合，添加1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，使其終濃度為50mg/mL。對于該溶液使用點樣儀(spotter)(日本 > 一〒一電子制；“GeneStamp-1I ”)，準備下述芯片:在基板A的凸部上面，將與基因a對應的序列號I的堿基序列所示的探針以N = 4點樣的芯片(以下，設為“分析用芯片I”。)、將與基因b?d對應的序列號2?4的堿基序列所示的探針分別以N = 2點樣的芯片(以下，設為“分析用芯片2”。)。接著，將點樣了的各基板放入至密閉的塑料容器中，在37°C、濕度100%的條件下孵育20小時左右。最后用純水洗滌基板，用旋轉式脫水機進行離心來干燥。
[0103](3)蓋構件向分析用芯片基板的粘貼
[0104]對于固定化有選擇結合性物質的上述分析用芯片1、分析用芯片2，如下那樣粘貼蓋構件。蓋構件通過將PMMA平板進行切削加工來制作。制作的該蓋構件中設置有貫通孔和液面停止用室。而且使用雙面帶作為粘接構件，將蓋構件以鑲邊的方式并且以厚度50 μπι疊層而粘貼后，將該蓋構件粘貼于分析用芯片1、分析用芯片2。
[0105](4)被檢物質的調制
[0106]被檢物質使用通常作為微陣列的被檢物質的aRNA (antisense RNA)來調制。由市售的來源于人培養(yǎng)細胞的total RNA(CL0NTECH社制“Human Reference RNA”)5 μ g，將使用 Amb1n 社制 aRNA 調制試劑盒“MessageAmp II aRNA Amplificat1n Kit”來調制的 aRNA用Cy5 (GE Healthcare社)進行突光標記,從而獲得Cy5標記aRNA。
[0107](5)用于選擇結合性物質與被檢物質的雜交的反應液
[0108]在以下的實施例、比較例中只要沒有特別說明，使用將由上述調制的標記aRNA用包含I重量％ BSA、5XSSC、0.01重量％鮭魚精子DNA、0.1重量％ SDS的雜交溶液(各濃度都為終濃度)稀釋后的稀釋液。
[0109]實施例1
[0110]在包含參考例I所記載的Cy5標記aRNAlOOng的溶液中混合雜交溶液并成為25 μ L，調制出被檢物質溶液。將被檢物質溶液10 μ L注入至分析用芯片I。凹部內的沒有被被檢物質溶液填充的空間的容積為約3 μ L，沒有被被檢物質溶液填充的空間在凹部內所占的比例為約23 %。準備6組(set)上述的分析用芯片I。將各分析芯片的注入口密封而成為將凹部密閉了的狀態(tài)，放置在設置于調溫至37°C的烘箱中的攪拌裝置“B1Shake 5000” (QInstruments社；最大轉速5000rpm,旋轉半徑0.6mm)中，關于各分析用芯片，以5000rpm分別攪拌0.5h、lh、2h、4h、8h、16h來進行反應。此時,施加至各分析用芯片的離心加速度為約17.7Xg。關于各分析用芯片，使用高析像度熒光檢測裝置(東 > 株式會社；“3D-Gene (注冊商標)Scanner”)測定雜交了的標記aRNA的信號強度(熒光強度)。將其結果示于圖9、圖10、表I中。在反應開始后0.5h檢測到閾值(空白點的平均+2SD)以上的信號，顯示出反應快速地進行了。
[0111]實施例2
[0112]與實施例1同樣地操作，將被檢物質溶液注入至分析用芯片I (6組)中。放置在設置于調溫至37°C的烘箱中的攪拌裝置“B1Shake 5000”中，以3000rpm分別攪拌0.5h、lh、2h、4h、8h、16h,進行反應。此時,施加至各分析用芯片的離心加速度為約6.04X g。關于各分析用芯片，使用高析像度熒光檢測裝置測定雜交了的標記aRNA的信號強度(熒光強度)。將其結果示于圖9、圖10、表I中。在反應開始后0.5h檢測到閾值以上的信號，顯示出反應快速地進行了。
[0113]實施例3
[0114]與實施例1同樣地操作，將被檢物質溶液注入至分析用芯片I (6組)中。放置在設置于調溫至37 °C的烘箱中的攪拌裝置“MS3 r -7'夕^ ” (IKA社；最大轉速3000rpm，旋轉半徑2.25mm)中，以3000rpm分別攪拌0.5h、lh、2h、4h、8h、16h，進行反應。此時，施加至各分析用芯片的離心加速度為約22.6 X g。關于各分析用芯片，使用高析像度熒光檢測裝置測定雜交了的標記aRNA的信號強度(熒光強度)。將其結果示于圖9、圖10、表I中。在反應開始后0.5h檢測到閾值以上的信號，顯示出反應快速地進行了。
[0115]實施例4
[0116]與實施例1同樣地操作，將被檢物質溶液注入至分析用芯片I (6組)中。放置在設置于調溫至37°C的烘箱中的攪拌裝置“MS3 r ''J夕中，以100rpm分別攪拌0.5h、lh、2h、4h、8h、16h，進行反應。此時，施加至各分析用芯片的離心加速度為約2.52Xg。關于各分析用芯片，使用高析像度熒光檢測裝置測定雜交了的標記aRNA的信號強度(熒光強度)。將其結果示于圖9、圖10、表I中。在反應開始后0.5h檢測到閾值以上的信號，顯示出反應快速地進行了。
[0117]比較例I
[0118]與實施例1同樣地操作，將被檢物質溶液注入至分析用芯片I (6組)中。放置在設置于調溫至37°C的烘箱內的攪拌裝置“B1Shake 5000”中，以100rpm分別攪拌0.5h、比、211、411、811、1611，進行反應。此時，施加至分析用芯片的離心加速度為約0.671 Xg。關于各分析用芯片，使用高析像度熒光檢測裝置測定雜交了的標記aRNA的信號強度(熒光強度)。將其結果示于圖9、圖10、表I中。在反應開始后0.5h未檢測到閾值以上的信號。檢測到閾值以上的信號是在反應開始后Ih以后。
[0119]比較例2
[0120]與實施例1同樣地操作，將被檢物質溶液注入至分析用芯片I (6組)中。放置在設置于調溫至37°C的烘箱內的攪拌裝置“B1Shake 5000”中，以250rpm分別攪拌0.5h、lh、2h、4h、8h、16h，進行反應。此時，施加至各分析用芯片的離心加速度為約0.042Xg。關于各分析用芯片，使用高析像度熒光檢測裝置測定雜交了的標記aRNA的信號強度(熒光強度)。將其結果示于圖9、圖10、表I中。在反應開始后0.5h未檢測到閾值以上的信號。檢測到閾值以上的信號是在反應開始后Ih以后。
[0121]比較例3
[0122]與實施例1同樣地操作，將被檢物質溶液注入至分析用芯片I (6組)中。放置在設置于調溫至37°C的烘箱內的攪拌裝置“MS3 r ''J夕 > ”中，以250rpm分別攪拌0.5h、lh、2h、4h、8h、16h，進行反應。此時，施加至分析用芯片的離心加速度為約0.157 X g。關于各分析用芯片，使用高析像度熒光檢測裝置測定雜交了的標記aRNA的信號強度(熒光強度)。將其結果示于圖9、圖10、表I中。在反應開始后0.5h未檢測到閾值以上的信號。檢測到閾值以上的信號是在反應開始后Ih以后。
[0123][表I]
[0124]表I 反應時間和信號強度
[0125]
反應時間(h) |θ.5[I[2fi [8 [?6
實施例152.597.8182.5~ 232.3~ 285.5~ 309.0
實施例 241.385.5171.3~ 218.3~ 279.2~ 305.4
實施例 361.7101.9~192.1~ 247.9~ 296.4~ 312.3
實施例 43δΓ36?Γ5150.9~193.5~ 265.4~ 296.4
比較例 I2^83573TL2 136.7~207.2~286.4
比較例 2Τ?ΓδθΓθ 108.3~176.1~279.0
比較例 320 533Γ976?8 145.4~218.9~272.9
[0126]實施例5
[0127]在包含參考例I所記載的Cy5標記aRNA60ng的溶液中混合雜交溶液并成為10 μ L，在分析用芯片2 (2組)中注入6.7 μ L。注入了的Cy5標記aRNA的量為40ng，與實施例I?4同量。凹部內的沒有被被檢物質溶液填充的空間的容量為約6.3 μ L，沒有被被檢物質溶液填充的空間在整個凹部中所占的比例為約48%。與實施例1同樣地操作，放置在攪拌裝置“B1Shake5000”中，分別以5000rpm進行反應I小時。關于各分析用芯片，使用高析像度熒光檢測裝置測定對3種基因b?d進行了雜交的標記aRNA的信號強度(熒光強度)。將其結果示于表2中。在I小時的反應時間，全部的基因的信號強度成為閾值以上，是有效的。
[0128]實施例6
[0129]在包含參考例I所記載的Cy5標記aRNA60ng的溶液中混合雜交溶液并成為15 μ L，在分析用芯片2 (2組)中注入10 μ L。注入了的Cy5標記aRNA的量為40ng，與實施例I?4同量。凹部內的沒有被被檢物質溶液填充的空間的容量為約6.3 μ L，沒有被被檢物質溶液填充的空間在整個凹部中所占的比例為約23%。與實施例1同樣地操作，放置在攪拌裝置“B1Shake5000”中，分別以5000rpm進行反應I小時。關于各分析用芯片，使用高析像度熒光檢測裝置測定對3種基因b?d進行了雜交的標記aRNA的信號強度(熒光強度)。將其結果示于表2中。在I小時的反應時間，全部的基因的信號強度成為閾值以上，是有效的。
[0130]比較例4
[0131]在包含參考例I所記載的Cy5標記aRNA60ng的溶液中混合雜交溶液并成為20 μ L，在分析用芯片2 (2組)中注入13 μ L而填充凹部(沒有被被檢物質溶液填充的空間在整個凹部中所占的比例為0% )。與實施例1同樣地操作，放置在攪拌裝置“B1Shake5000”中，分別以5000rpm進行反應I小時。關于各分析用芯片，使用高析像度熒光檢測裝置測定對3種基因b?d進行了雜交的標記aRNA的信號強度。將其結果示于表2中。在I小時的反應時間，基因b的信號強度成為閾值以上，是有效的，但是與實施例5、6相比，信號強度弱。此外，基因c、d的信號強度比閾值低，是無效的。
[0132][表2]
[0133]表2
[0134]凹部中的沒有被被檢物質溶液填充的空間的比例和各基因的信號強度
[0135]
~—實施例5 實施例6 比較例4
'凹部中的沒有被被檢物質溶液填充_ ~~Tl■
空間的比例<*>y
—■430.3 361 O 151 6
基因b-------
___432.2 343.9 155.4

139.3 129.2 107.6
____147.3 132.5 107.6
~~148.7 126.3 99?~~
基因d---

150.6 136.5 101.7
閾值(平均+2SD)111.0 I 107.7 108.8
[0136]參考例2
[0137](I)分析用芯片的基板的制作
[0138]采用與參考例I同樣的材質，利用注射成型制作出外形為縱76mm、橫26mm、厚度2.5mm的基板。基板使用設置有4處長邊4.8mm、短邊2.40mm、深度1.5mm的橢圓形的凹部，在各凹部中設置有98處直徑0.1mm、高度0.12mm的凸部的基板(以下稱為“基板B”。)。在基板B中，凹部的容積為約13.5 μ L0此外，凸部上面與平坦部上面的高度的差、凸部上面的高度的偏差都為3μπι以下。此外，將凸部的間距設為0.18mm。
[0139](2)選擇結合性物質(捕捉探針)的固定化
[0140]通過與參考例I同樣的制作方法，作為選擇結合性物質(捕捉探針)，合成出人乳頭瘤病毒的型判別研究中所報告的文獻(J.Clin.Microb1l, 1995.p.901-905)中所記載的、序列號5的堿基序列(與成為被檢物質的16型人乳頭瘤病毒的LI基因區(qū)域的序列的一部分互補的序列)所示的寡核苷酸的5’末端修飾了氨基的選擇結合性物質，在基板B的98處凸部中的22處點樣并固定化，從而獲得分析用芯片(以下，稱為“分析用芯片3”。)。
[0141](3)被檢物質的調制
[0142]作為被檢物質，將由t 二一7研究資源庫購入的人乳頭瘤病毒的基因組DNA被克隆化了的重組質粒(pHPV16(全長16，600堿基對))通過超聲波進行了片段化處理。以IX雜交溶液(I重量％牛血清白蛋白(BSA)，5XSSC，1重量％十二烷基硫酸鈉(SDS)，50ng/mL鮭魚精子DNA溶液，5重量％葡聚糖硫酸鈉，30%甲酰胺)進行稀釋以使核酸濃度為0.1amol/μ L，設為檢體DNA溶液。
[0143](4)檢測探針溶液的調制
[0144]作為夾心雜交所使用的檢測探針，分別合成出ΜΥ11(序列號6 ;將被檢物質與捕捉探針結合了的情況下的5’末端的堿基位置作為基準，與5’末端側第50?69的堿基序列互補的序列)、GP5 (序列號7 ;與MYll同樣地，與5’末端側第10?34的堿基序列互補的序列)、GP6(序列號8 ;將被檢物質與捕捉探針結合了的情況下的3’末端的堿基位置作為基準，與3’末端側第60?82的堿基序列互補的序列)和MY09 (序列號9 ;與GP6同樣地，與3’末端側第340?359的堿基序列互補的序列)的、3’末端和5’末端進行了生物素標記的檢測探針。將它們用滅菌水稀釋以使?jié)舛葹閘OOfmol，從而獲得各檢測探針溶液。
[0145]實施例7
[0146]在參考例2所記載的檢體DNA溶液I μ L中，添加參考例2所記載的檢測探針溶液I μ L并進行混合，用熱循環(huán)儀在95°C加熱5分鐘。靜置直至恢復至室溫，然后添加8 μ L參考例2所記載的IX雜交溶液并進行混合，制成包含被檢物質的雜交溶液。將全部量注入至分析用芯片3的凹部的I處，將開口部用涂布有丙烯酸系粘著劑的PET制膜密封。此時，凹部內的未被溶液填充的空間的容積為約3.5μ L，未被溶液填充的空間在凹部內所占的比例為約26%。通過夾心雜交法，進行被檢物質的檢測。放置在設置于調溫至32°C的烘箱中的攪拌裝置“B1Shake 5000”(Q Instruments社)中，以3000rpm攪拌2h,將捕捉探針與被檢物質進行雜交反應。此時，施加至各分析用芯片的離心加速度為約6.04Xg。反應后，剝離堵塞了開口部的密封件，用加溫至30°C的洗滌液A(0.5XSSC, I重量％ SDS)洗滌5分鐘。干燥后，將染色試劑(鏈親和素藻紅蛋白，Streptavidin phycoerythrin)與稀釋液(10mM MES, IM NaCl, 0.05 重量％ Tween20, 2mg/mLBSA)進行混合而調制的、50ng/μ L鏈親和素藻紅蛋白溶液10 μ L滴加至凹部，在35°C 5分鐘遮光下進行了孵育。用加溫至30°C的洗滌液W6XSSPE，0.01重量％ Tween20)洗滌5分鐘，進行干燥。使用高析像度熒光檢測裝置(東 > 株式會社；“3D-Gene (注冊商標)Scanner”)測定信號強度(熒光強度)。分別讀取固定化有選擇結合性物質的凸部(信號)和未固定化選擇結合性物質的凸部(噪聲)的數(shù)值，算出信號/噪聲比(S/N比)，將其結果示于表3中。S/N = 2.80，超過作為檢測限度的S/N = 2。
[0147]實施例8
[0148]將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為5000rpm，除此以外，進行了與實施例7同樣的操作。此時，離心加速度為16.77Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N = 2.53，超過作為檢測限度的S/N = 2。
[0149]比較例5
[0150]將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為100rpm，除此以外，進行了與實施例7同樣的操作。此時，離心加速度為0.67Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N=1.56，未達到作為檢測限度的S/N = 2。
[0151]實施例9
[0152]作為攪拌裝置，使用“Mix-EVR”(夕4 f 夕社；最大轉速2500rpm，旋轉半徑1mm)，將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為2000rpm，除此以外，進行了與實施例7同樣的操作。此時，離心加速度為4.47Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N = 2.24，超過作為檢測限度的S/N = 2。
[0153]實施例10
[0154]將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為2500rpm，除此以外，進行了與實施例9同樣的操作。此時，離心加速度為6.99Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N = 2.76，超過作為檢測限度的S/N = 2。
[0155]比較例6
[0156]將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為500rpm，除此以外，進行了與實施例9同樣的操作。此時，離心加速度為0.28Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N=1.48，未達到作為檢測限度的S/N = 2。
[0157]實施例11
[0158]攪拌裝置使用“MS3 r -7' 9 (IKA社)，將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為2000rpm，除此以外，進行了與實施例7同樣的操作。此時，離心加速度為10.06Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N = 3.25，超過作為一檢測限度的S/N = 2。
[0159]實施例12
[0160]將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為3000rpm，除此以外，進行了與實施例10同樣的操作。此時，離心加速度為22.64Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N = 2.72，超過作為檢測限度的S/N = 2。
[0161]比較例7
[0162]將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為500rpm，除此以外，進行了與實施例11同樣的操作。此時，離心加速度為0.63Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N=1.61，未達到作為檢測限度的S/N = 2。
[0163]實施例13
[0164]使用制作的攪拌裝置(最大轉速100rpm,旋轉半徑5mm),將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為100rpm，除此以外，進行了與實施例7同樣的操作。此時，離心加速度為
5.59Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N = 2.39，超過作為檢測限度的S/N = 2。
[0165]比較例8
[0166]將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為250rpm，除此以外，進行了與實施例13同樣的操作。此時，離心加速度為0.35Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N=1.49，未達到作為檢測限度的S/N = 2。
[0167]比較例9
[0168]攪拌裝置使用,v千工一力一 MMS-210”(東京理化器械社；最大轉速250rpm,旋轉半徑12.5mm)，將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為250rpm，除此以外，進行了與實施例7同樣的操作。此時，離心加速度為0.87Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N=1.56，未達到作為檢測限度的S/N = 2。
[0169]比較例10
[0170]使用制作的攪拌裝置(最大轉速100rpm,旋轉半徑24mm),將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為10rpm，除此以外，進行了與實施例7同樣的操作。此時，離心加速度為0.27Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N = 1.39，未達到作為檢測限度的S/N =2。
[0171]比較例11
[0172]使用制作的攪拌裝置(最大轉速100rpm,旋轉半徑72mm),將雜交反應時的攪拌裝置的轉速設為10rpm，除此以外，進行了與實施例7同樣的操作。此時，離心加速度為0.80Xg。算出S/N比，將其結果示于表3中。S/N = 1.57，未達到作為檢測限度的S/N =2。
[0173][表3]
[0174]表3 旋轉半徑、轉速、離心加速度和信號強度
[0175]
I旋轉半徑I轉速P心加速度I信號強度
____ (rpm) (Mg) ~ 信號噪聲 S/N 比
—比較例5 , 0.6.一 1000 067_ 2841 1S21 1:56
_ 實施例7 一..................................0J........................3000 ~— 6.04 — 5110 1825 "^2J0
"實施例 8 _...............................0J........................5000 16.77 462S 1828................................................2.53
比較例 6 -- —_____ 鍛4_~^48
~~—1.....2000 ——— 4Λ7 "'4ci1................................................1802 2.24
—實施例 10................................................1iil..........................2.76'
比較例 7__2.25 500 0.63...........................2924 — 1816 161
實施銅11__2.25 2000 10 06 5879 1809 3 25
—實施例 12.2.25 — 3000 22^64 4S67 1826 — 2.72
比較例 S _5 250 0-35 2713 1821 1.49

5 ~ 100'.....................................1'li 4338 1Α15 2J9
~*555.................................250 0.8? ~2838........................1ili 一^--?
_把較_0 —"24..............................100......0,27 2538 1826 ?5
丨m1 I721100|οΓβοι~.丨丨2820|咖咖^11--?ι.........................Tm
[0176]實施例14
[0177]在參考例2所記載的檢體DNA溶液4 μ L中添加參考例2所記載的檢測探針溶液4y L并進行混合，用熱循環(huán)儀在95°C加熱5分鐘。靜置直至恢復至室溫，然后添加32 μ L參考例2所記載的IX雜交溶液并進行混合，制成包含被檢物質的雜交溶液。在分析用芯片3的凹部4處(凹部N0.#1?#4)分別注入10 μ L，將開口部用涂布有丙烯酸系粘著劑的PET制膜密封。此時，凹部內的未被溶液填充的空間的容積為約3.5 μ L，未被溶液填充的空間在凹部內所占的比例為約26%。通過夾心雜交法，進行被檢物質的檢測。放置在設置于調溫至32°C的烘箱中的攪拌裝置“MS3 r ''J夕^ ” (IKA社)中，以2000rpm攪拌2h，將捕捉探針與被檢物質進行雜交反應。此時，施加至各分析用芯片的離心加速度為約10.1Xgo反應后，剝離堵塞了開口部的密封件，用加溫至30°C的洗滌液A (0.5 X SSC, I重量％ SDS)洗滌5分鐘。干燥后，將染色試劑(鏈親和素藻紅蛋白)與稀釋液(10mM MES, IM NaCl,0.05重量％ Tween20,2mg/mL BSA)進行混合而調制的、50ng/μ L鏈親和素藻紅蛋白溶液10 μ L滴加至凹部，在35°C 5分鐘遮光下進行了孵育。用加溫至30°C的洗滌液B(6XSSPE，
0.01重量％ Tween20)洗滌5分鐘，進行干燥。使用高析像度熒光檢測裝置(東 > 株式會社；“3D-Gene (注冊商標)Scanner”)測定信號強度(熒光強度)。分別讀取固定化有選擇結合性物質的凸部(信號)和未固定化選擇結合性物質的凸部(噪聲)的數(shù)值，算出4處凹部(凹部N0.#1?#4)的信號/噪聲比(S/N比)，將其結果示于表4中。分別為S/N =
2.9,2.7,2.8,2.8，全部凹部都超過作為檢測限度的S/N = 2。此外，各凹部內的22個凸部斑點的信號的CV值全部為低于10%的低的值，凹部內的信號的偏差也小。進一步顯示出，4處凹部整體的信號(88個)的CV值也低至7.5%，凹部間的偏差也小。
[0178]比較例12
[0179]使用制作的自轉公轉方式的攪拌裝置(公轉半徑72mm),將公轉轉速設為350rpm,除此以外，進行與實施例14同樣的操作。此時，離心加速度為9.9Xg。算出4處凹部(凹部N0.#1?#4)的S/N比，將其結果示于表4中。分別為S/N= 1.8、1.9、1.7、1.5，全部凹部都未達到作為檢測限度的S/N = 2。此外，各凹部內的22個凸部斑點的信號的CV值為10%左右且有偏差，進一步顯示出，4處凹部整體的信號(88個)的CV值高達15.3%，凹部間的偏差大。
[0180][表 4]
[0181]表4 攪拌的旋轉方式和信號強度、偏差、S/N比
[0182]
實施例14比較例12
旋轉方式 —.....—"^?1?.......................................................................................................................1i#^#....................................................................旋轉半操2.26 ITHiiI72 ιηπι|
— 榦速1 Π20Μφιη..............................................................................................................................350rpm..........................................n——
離心加速度__10,1 Xg9—9— xg
—~iiplo-lllllllllllllim—lllllllllimiilllllllllllim11111111111111?lllllllllimlllllllllim#3lllllllllimlllllllllim#4llllllllim~--ι…1…1111111…1…111111#2…1…1111111"" #3 #4
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平均 _5266__3112
昏體的信號396.0~475.8
CV(%): ?.S __ 15.3: ~
各》部的噪聲平均 18T4 I 1938 ~?Κ9 I 1862 1820 | 1847~ 1757I 1777
S/W Λ ~~ 2.S I 2.7 —2~8~ I 2~8~ 1.8 I 1.9 1.7[ 1~
[0183]產業(yè)可利用性
[0184]本發(fā)明的溶液的攪拌方法與以往相比，可以大幅度縮短使用DNA芯片等分析用芯片的被檢物質的檢測或定量所需要的時間。因此，本發(fā)明能夠進行臨床現(xiàn)場、檢查中心中的迅速的疾病的診斷、診察等，因此是有用的。
[0185]符號的說明
[0186]I 基板
[0187]2 具有貫通孔的板材
[0188]3 凹部的底面
[0189]4 凹部的壁面
[0190]5 選擇結合性物質的固定化表面
[0191]6 凹部(或凹部的空間)
[0192]7 蓋
[0193]8 注入孔
[0194]9 未被溶液填充的空間(或氣泡)
[0195]10分析用芯片。
【權利要求】
1.一種溶液的攪拌方法，是被注入到分析用芯片中的包含被檢物質的溶液的攪拌方法， 該分析用芯片具有注入該包含被檢物質的溶液的凹部，在該凹部的全部底面表面或一部分底面表面固定化與該被檢物質選擇性結合的選擇結合性物質， 在分析用芯片的凹部的空間以殘留該空間的一部分的方式注入該包含被檢物質的溶液， 對注入有該包含被檢物質的溶液的分析用芯片施加IXg以上的離心加速度使其回轉旋轉。
2.根據(jù)權利要求1所述的溶液的攪拌方法，使注入有該包含被檢物質的溶液的分析用芯片以0.1mm以上20mm以下的旋轉半徑進行回轉旋轉。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的溶液的攪拌方法，在所述凹部以殘留10%以上70%以下的空間的方式注入所述包含被檢物質的溶液。
4.根據(jù)權利要求1?3的任一項所述的溶液的攪拌方法，所述分析用芯片具有彼此被壁面隔開了的注入包含被檢物質的溶液的多個凹部。
5.根據(jù)權利要求1?4的任一項所述的溶液的攪拌方法，在所述分析用芯片上安裝覆蓋整個所述凹部的蓋，從而將所述包含被檢物質的溶液密閉在該凹部內。
6.根據(jù)權利要求1?5的任一項所述的溶液的攪拌方法，注入有所述包含被檢物質的溶液的分析用芯片，以所述凹部的底面成為水平或大致水平的方式設置而在水平或大致水平的方向上回轉旋轉。
7.一種被檢物質的分析方法，通過權利要求1?6的任一項所述的溶液的攪拌方法使被檢物質與被固定化于分析用芯片的選擇結合性物質結合，檢測與選擇結合性物質結合的該被檢物質。
【文檔編號】G01N37/00GK104169722SQ201380011640
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年2月27日 優(yōu)先權日:2012年2月29日
【發(fā)明者】黑田俊彥, 信正均 申請人:東麗株式會社