專利名稱：一種檢測胎膜早破免疫層析試紙的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫層析試紙的制備方法，具體涉及一種檢測胎膜早破免疫層析試紙的制備方法。
背景技術(shù)：
免疫層析試紙是一種利用層析原理將待檢測液中的目標(biāo)檢測分子或成分等在試紙條上流動至檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)，當(dāng)檢測線發(fā)生顏色變化則說明檢測結(jié)果為陽性，否則為陰性，當(dāng)質(zhì)控線發(fā)生顏色變化時，則說明檢測結(jié)果有效，否則無效。免疫層析試紙在檢測或診斷某些疾病時具有非常便利的優(yōu)點，因此其已被充分運用到多種疾病或癥狀的檢測或診斷過程中，例如早孕試紙。一般情況下，免疫層析試紙包含有以下幾種構(gòu)成:樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊、膠板，所述樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜和吸水墊依次粘貼在膠板上；所述層析膜上依次設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線；其工作原理為:將待測液滴加至樣品墊上，待測液利用層析原理流向膠體金結(jié)合墊，待測液溶解膠體金結(jié)合墊中的膠體金結(jié)合物，并與其共同依次流向?qū)游瞿ど系臋z測線和質(zhì)控線；當(dāng)待測液中含有目標(biāo)檢測分子，則目標(biāo)檢測分子、膠體金結(jié)合物會與檢測線內(nèi)包含的抗體成分結(jié)合從而形成免疫復(fù)合物，同時檢測線顏色發(fā)生變化；當(dāng)待測液流至質(zhì)控線時，質(zhì)控線內(nèi)包含的抗體成分會與膠體金結(jié)合物結(jié)合，從而質(zhì)控線顏色發(fā)生變化。胎膜破裂(Rupture of Fetal Membrane,簡稱ROM)在孕期可能隨時發(fā)生,在臨產(chǎn)前發(fā)生的胎膜破裂稱為胎膜早破(PR0M)。足月后(37孕周后)PR0M的發(fā)生率約為10%，足月前(37孕周前)PROM的發(fā)生率為2-3.5%。胎膜早破是引起產(chǎn)科病人產(chǎn)前、產(chǎn)后并發(fā)癥的主要因素，也是導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)和新生兒必須入住重癥監(jiān)護室的主要原因。由于醫(yī)務(wù)人員不得不在延長孕周與宮內(nèi)及孕婦感染的風(fēng)險和胎兒肺發(fā)育問題之間求平衡，因而對胎膜早破患者的管理成本高、難度大，準(zhǔn)確及時診斷孕婦是否發(fā)生胎膜早破至關(guān)重要?，F(xiàn)有檢測胎膜早破的方法中除以往的臨床詢問病史等方法外，主要以妊娠婦女陰道分泌物中的細(xì)胞間粘附分子-1 (簡稱ICAM-1)為檢測指標(biāo)的檢測工具為較新的方法。其中以ICAM-1為檢測指標(biāo)的檢測胎膜早破免疫層析試紙對于產(chǎn)科病人及時診斷是否發(fā)生胎膜早破起到了較好的效果；所述免疫層析試紙的檢測線內(nèi)包被有羊抗人ICAM-1多克隆抗體工作液，質(zhì)控線內(nèi)包被有羊抗鼠IgG工作液，膠體金結(jié)合物中含有鼠抗人ICAM-1單克隆抗體?，F(xiàn)有的以ICAM-1為檢測指標(biāo)的檢測胎膜早破免疫層析試紙雖然為產(chǎn)科病人提供了便利，但其靈敏性、特異性以及準(zhǔn)確度均不夠理想，從而容易造成誤診，對產(chǎn)科病人來說同樣會造成不便。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種檢測胎膜早破免疫層析試紙的制備方法，該制備方法制備所得的檢測胎膜早破免疫層析試紙的靈敏性和特異性有較明顯的提高，分別可達(dá)到97%以上和93%以上，從而減少誤診的發(fā)生率。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是采用一種檢測胎膜早破免疫層析試紙的制備方法，所述制備方法包括有以下步驟:A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為1.5-2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為0.5-1.5mg/mL，將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在36-38°C下干燥8-12小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊；C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙。優(yōu)選的，所述A步驟中檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為1.5mg/mL。優(yōu)選的，所述A步驟中經(jīng)包被后的硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時。優(yōu)選的，所述B步驟中膠體金為采用以下方法制備而成:將0.005g_0.03g/100mL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為0.5-2g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，加入量為每IOOmL氯金酸水溶液中加入2-3mL，煮沸3_10分鐘，冷卻后用K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。優(yōu)選的，所述B步驟中氯金酸水溶液的濃度為0.01g/100mL。優(yōu)選的，所述B步驟中加入的檸檬酸三鈉水溶液的濃度為2g/100mL。優(yōu)選的，所述B步驟中加入的檸檬酸三鈉水溶液的體積為2.5mL。優(yōu)選的，所述B步驟中K2CO3水溶液的濃度為0.1-0.3mol/L。優(yōu)選的，所述C步驟中樣品墊為采用以下方法制備而成:將玻璃纖維浸泡于PH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液中2-6小時后，于36_38°C干燥8_12小時得樣品墊。優(yōu)選的，所述C步驟中磷酸鹽緩沖液中還含有0.5-3.0mL/1OOmL的Triton-XlOO和 0.5-2g/100mL 的 BSA。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其詳細(xì)說明如下:本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:檢測胎膜早破免疫層析試紙的制備方法，所述制備方法包括有以下步驟:A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線工作液；檢測線工作液濃度為1.5-2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為
0.5-1.5mg/mL，將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在36-38°C下干燥8-12小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊；C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙。首先，細(xì)胞間粘附分子(intercellularadhesive moleculel,簡稱 ICAM-1)是一種參與細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用的分子統(tǒng)稱，包括有存在于體液中的可溶性細(xì)胞間粘附分子(soluble intercellular adhesive moleculel,簡稱sICAM-1)和存在于細(xì)胞表面的膜型細(xì)胞間粘附分子(簡稱膜型ICAM-1)。其中，sICAM_l不僅保留了膜型ICAM-1的生物學(xué)特性，其還是膜型ICAM-1在體液中的可溶形式。本發(fā)明人經(jīng)過充分的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生胎膜早破的妊娠婦女受胎膜和羊水中的單核細(xì)胞上ICAM-1的表達(dá)和中性粒細(xì)胞的影響，其陰道分泌物中的ICAM-1含量明顯升高，包括膜型ICAM-1和sICAM-1的含量?，F(xiàn)已有將ICAM-1為目標(biāo)分子來檢測胎膜早破的檢測工具，但在實際應(yīng)用過程中，其靈敏性和特異性均較低，容易產(chǎn)生誤診。本發(fā)明人經(jīng)過充分的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生胎膜早破的妊娠婦女的陰道分泌物中導(dǎo)致ICAM-1含量升高的原因主要在于sICAM-1含量的變化，而不是含量變化較小的膜型ICAM-1 ;本發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)，sICAM-1是妊娠晚期出現(xiàn)在羊水中的主要蛋白質(zhì)之一，含量一般為14ng/mL左右；而發(fā)生胎膜早破時，除了胎膜表面細(xì)胞上的膜型ICAM-1會隨羊水流至陰道外，主要還是以羊水為主，而羊水中含量較多的的sICAM-1則會出現(xiàn)在陰道分泌物中。因此，采用妊娠婦女陰道分泌物中的sICAM-1作為檢測目標(biāo)分子相對于以ICAM-1為檢測目標(biāo)分子來檢測胎膜早破可以有更好的靈敏性和特異性。鑒于上述實驗結(jié)果和本發(fā)明人的充分研究，本發(fā)明技術(shù)方案所述的檢測胎膜早破免疫層析試紙的制備方法中采用羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線工作液。免疫層析試紙用于檢測疾病時的靈敏性為患病人群中得出陽性檢測的樣本占病人總數(shù)的百分比，特異性為健康人群中得出陰性檢測的樣本占健康人總數(shù)的百分比。影響靈敏性和特異性的因素較多，包括有試紙本身的制造工藝的區(qū)別以及個人操作是否規(guī)范等等，但基本還是以試紙本身的制造工藝為主。在免疫層析試紙的制造工藝中包括有幾個關(guān)鍵步驟，主要為層析膜、膠體金、膠體金結(jié)合墊以及樣品墊的制備。本發(fā)明經(jīng)過蛋白芯片篩選試驗發(fā)現(xiàn)，確診的胎膜早破產(chǎn)婦與確診的非胎膜早破產(chǎn)婦相比(兩組產(chǎn)婦的年齡與妊娠周齡匹配，無基礎(chǔ)疾病，無妊娠合并癥)，其陰道分泌物樣本中sICAM-1的濃度具有明顯差異；其中，確診的胎膜早破產(chǎn)婦陰道分泌物樣本中sICAM-1的濃度90%以上均在2ng/mL以上，而確診的非胎膜早破產(chǎn)婦陰道分泌物樣本中sICAM-1的濃度90%以上均在Ing/mL以下。鑒于上述實驗結(jié)果，為了讓免疫層析試紙能夠正確檢測出妊娠婦女是否發(fā)生胎膜早破，免疫層析試紙的制備方法就需要經(jīng)過一定的調(diào)整，本發(fā)明則主要是以調(diào)整其中檢測線工作液和質(zhì)控線工作液的濃度來提高免疫層析試紙的靈敏性和特異性。檢測線中抗體(本發(fā)明中為羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子多克隆抗體)的不同濃度對于檢測樣本中的抗原成分(本發(fā)明中為妊娠婦女陰道分泌物中的可溶性細(xì)胞間粘附分子)的顯色程度有著不同的效果；當(dāng)檢測線中的抗體濃度過低，則其和抗原起結(jié)合反應(yīng)的量較少，從而導(dǎo)致顯色不明顯，導(dǎo)致患病人群中本應(yīng)檢測出陽性結(jié)果的檢測出陰性結(jié)果，靈敏性偏低；當(dāng)檢測線中的抗體濃度過高，則其和抗原起結(jié)合反應(yīng)的量較多，從而導(dǎo)致顯色過于明顯，導(dǎo)致健康人群中本應(yīng)檢測出陰性結(jié)果的檢測出陽性結(jié)果，特異性偏低。質(zhì)控線中抗體(本發(fā)明中為羊抗鼠IgG多克隆抗體)的不同濃度對于試紙的檢測結(jié)果有效性的判定有著不同的效果；當(dāng)檢測液經(jīng)過檢測線時，其中的抗原和膠體金結(jié)合墊中的抗體(本發(fā)明中為鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體)會與檢測線內(nèi)的抗體結(jié)合形成帶有一定顏色的結(jié)合物，而部分沒有結(jié)合的膠體金結(jié)合墊內(nèi)的抗體則會繼續(xù)移動至質(zhì)控線，從而與質(zhì)控線中的抗體成分結(jié)合成另一種結(jié)合物，質(zhì)控線顏色變化，從而說明檢測結(jié)果有效。當(dāng)檢測線工作液的濃度過高，則會導(dǎo)致移動至質(zhì)控線的膠體金結(jié)合墊的抗體含量較少，從而導(dǎo)致質(zhì)控線顏色變化不夠明顯，導(dǎo)致檢測結(jié)果失效；當(dāng)檢測線工作液的濃度偏低，則會導(dǎo)致移動至質(zhì)控線的膠體金結(jié)合墊的抗體含量較多，從而導(dǎo)致質(zhì)控線工作液成本上的浪費。鑒于上述原因，如果僅僅單獨調(diào)整檢測線工作液濃度和質(zhì)控線工作液濃度，則得到的是兩者單獨使用時的最佳濃度，但由于免疫層析試紙中檢測線和質(zhì)控線為同時使用，因此兩者之間組合后的較佳濃度需要經(jīng)過大量的實驗進行篩選和驗證。本發(fā)明人經(jīng)過充分的研究發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)有制備檢測胎膜早破免疫層析試紙方法的基礎(chǔ)上，將檢測線工作液濃度和質(zhì)控線工作液濃度分別調(diào)整為1.5-2.5mg/mL和0.5-1.5mg/mL時，所得試紙在相同的使用方法下可以有更好的靈敏性和特異性。另外，本發(fā)明檢測胎膜早破免疫層析試紙的制備方法中所得檢測線和質(zhì)控線包被過的硝酸纖維素膜需要在36-38°C下干燥8-12小時得層析膜。包被過的硝酸纖維素膜經(jīng)過一定溫度的干燥后，其對于試紙的靈敏性和特異性也能夠起到一定的提高作用。本發(fā)明采用上述制備層析膜的優(yōu)選方案所制備的免疫層析試紙在檢測胎膜早破時的靈敏性和特異性能夠得到有效的提高，分別可達(dá)到97%以上和93%以上。進一步的，本發(fā)明優(yōu)選采用所述A步驟中檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為1.5mg/mL。本發(fā)明制備方法中檢測線工作液濃度為1.5-2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為0.5-1.5mg/mL ;本發(fā)明在上述濃度區(qū)間內(nèi)經(jīng)過篩選和試驗，本發(fā)明制備方法中優(yōu)選采用檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為1.5mg/mL，本發(fā)明優(yōu)選采用上述兩種濃度的組合，所制得的免疫層析試紙在檢測妊娠婦女胎膜早破的靈敏性和特異性均有明顯的提聞。進一步的，本發(fā)明優(yōu)選采用所述A步驟中經(jīng)包被后的硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時。本發(fā)明制備方法中經(jīng)包被后的硝酸纖維素膜為在36-38°C下干燥8-12小時，本發(fā)明優(yōu)選采用在38°C下干燥10小時。進一步的，本發(fā)明優(yōu)選采用所述B步驟中膠體金為采用以下方法制備而成:將
0.005g-0.03g/100mL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為0.5-2g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液2-3mL，煮沸3-10分鐘，冷卻后用K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。本發(fā)明所述氯金酸為四氯金酸，化學(xué)式為AuCl3.HCl.4H20。本發(fā)明所述膠體金可以采用現(xiàn)有已知的制備方法來獲得，還可以采用購買市售膠體金的方式獲??；現(xiàn)有已知的制備膠體金的方法包括有將氯金酸水溶液在還原劑如白磷、抗壞血酸、檸檬酸三鈉、鞣酸等任意一種或多種的作用下，還原聚合成一定大小的金顆粒，所得金顆粒在靜電作用下呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，也即膠體金。其中，所加入還原劑的濃度以及加入量均可以采用現(xiàn)有的制備條件和方法進行。本發(fā)明經(jīng)過充分的研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備方法中為了使所得膠體金結(jié)合墊中的鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子單克隆抗體能夠與膠體金更好的結(jié)合，本發(fā)明優(yōu)選采用膠體金的制備方法為:將氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為0.5-2g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，煮沸3-10分鐘，冷卻后用K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。本發(fā)明所述制備方法中采用檸檬酸三鈉作為氯金酸的還原劑，其濃度和加入量是通過大量的試驗研究所得。檸檬酸三鈉作為氯金酸的還原劑，所得膠體金的金顆粒分散均勻程度主要取決于氯金酸水溶液與還原劑的反應(yīng)條件，其中以加入的檸檬酸三鈉水溶液的濃度以及加入量為主。本發(fā)明檸檬酸三鈉的加入時間為氯金酸水溶液加熱至沸時，這種方式可以使加入的檸檬酸三鈉在足夠溫度的條件下能夠快速分散于氯金酸水溶液中，從而所得膠體金的金顆粒大小均勻。當(dāng)檸檬酸三鈉水溶液的濃度過高時，其加入氯金酸水溶液中容易產(chǎn)生局部濃度過高，就不易達(dá)到快速分散于其中的目的，從而導(dǎo)致所得膠體金的金顆粒大小不夠均勻；當(dāng)檸檬酸三鈉水溶液的濃度偏小時，其加入氯金酸水溶液的量就不夠，這時就需要多次重復(fù)加入檸檬酸三鈉水溶液，所得膠體金中金顆粒的顆粒大小仍然會不夠均勻。同樣的，檸檬酸三鈉水溶液的加入量也對所制備的膠體金的顆粒均勻程度有一定的影響。鑒于上述原因，本發(fā)明制備方法中優(yōu)選采用加入氯金酸水溶液中的還原劑檸檬酸三鈉水溶液的濃度為0.5-2.0g/100mL，加入量為2mL_3mL。檸檬酸三鈉水溶液的濃度與加入量的組合并不是簡單的組合，需要經(jīng)過大量的實驗才能得到較佳效果。另外，本發(fā)明制備方法中膠體金的制備過程中，經(jīng)還原后的氯金酸水溶液冷卻后需要調(diào)節(jié)PH值至6.0-7.0，從而獲得膠體金。該制備過程中溶液pH值同樣會對所制得試紙的靈敏性和特異性有一定的影響。進一步的，本發(fā)明優(yōu)選采用所述B步驟中氯金酸水溶液的濃度為0.01g/100mL。進一步的，本發(fā)明優(yōu)選采用所述加入的檸檬酸三鈉水溶液的體積為2.5mL。本發(fā)明優(yōu)選采用當(dāng)所述檸檬酸三鈉水溶液的濃度為0.5-2g/100mL時，其加入量為2.5mL ;本發(fā)明優(yōu)選采用上述方式可以使所得膠體金中的金顆粒大小更加均勻。進一步的，本發(fā)明優(yōu)選采用所述K2CO3水溶液的濃度為0.1-0.3mol/L。本發(fā)明優(yōu)選采用上述方式可以便于調(diào)節(jié)溶液的PH值；濃度過高的K2CO3溶液在調(diào)節(jié)溶液pH的過程中容易出現(xiàn)過量的情況，而濃度過低的1(20)3溶液在調(diào)節(jié)溶液pH值的耗時會太長，因此本發(fā)明制備方法優(yōu)選采用K2CO3溶液的濃度為0.1-0.3mol/L。進一步的，本發(fā)明優(yōu)選采用所述C步驟中樣品墊為采用以下方法制備而成:將玻璃纖維浸泡于PH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液中2-6小時后，于36_38°C干燥8_12小時得樣品墊。本發(fā)明樣品墊可以采用現(xiàn)有已知的制備方法進行制備所得，也可以采用購買市售的產(chǎn)品；本發(fā)明優(yōu)選采用所述樣品墊為采用上述優(yōu)選方式制備所得，該法所得樣品墊對于所得試紙的靈敏性和特異性有一定的提高作用。進一步的，本發(fā)明優(yōu)選采用所述C步驟中磷酸鹽緩沖液中還含有0.5-3.0mL/1OOmL 的 Triton-XlOO 和 0.5_2g/100mL 的 BSA。本發(fā)明所述 Triton-XlOO 為聚乙二醇辛基苯基醚，其是一種表面活性劑；BSA為牛血清白蛋白；本發(fā)明中采用將上述兩種物質(zhì)共同配制于磷酸鹽緩沖液中并用于浸泡玻璃纖維，其制備所得的樣品墊對于待測樣品的緩沖作用效果更佳，從而對試紙的靈敏性和特異性有明顯的提高。


圖1是胎膜早破組陰道分泌物樣本的細(xì)胞因子/趨化因子抗體芯片檢測結(jié)果圖2是健康對照組陰道分泌物樣本的細(xì)胞因子/趨化因子抗體芯片檢測結(jié)果圖；圖3是健康妊娠婦女羊水樣本的細(xì)胞因子/趨化因子抗體芯片檢測結(jié)果圖；圖4是sICAM-1的酶聯(lián)免疫吸附法的檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)說明。實施例1胎膜早破組:110例胎膜早破妊娠婦女(其中80例足月胎膜早破和30例足月前胎膜早破);健康對照組:110例分娩前的胎膜完整妊娠婦女；羊水樣本組:30例行剖宮產(chǎn)的胎膜完整妊娠婦女。實驗對象臨床篩選標(biāo)準(zhǔn):胎膜早破組一 (i)臨產(chǎn)前觀察到羊水漏出；(ii)陰道分泌物樣本pH試紙檢測陽性；(iii)羊齒植物葉狀結(jié)晶檢測陽性。健康對照組一 ( )臨產(chǎn)前未觀察到羊水漏出；(ii)陰道分泌物樣本pH試紙檢測陰性；(iii)羊齒植物葉狀結(jié)晶檢測陰性。實驗對象年齡分布:80例足月胎膜早破平均年齡28歲(年齡范圍19-35歲)，30例足月前胎膜早破平均年齡31歲(年齡范圍19-45歲)，健康對照組平均年齡30歲(年齡范圍18-43 歲)。樣本收集方法:妊娠婦女取膀胱截石位(以平仰臥位躺下，雙下肢分開屈曲，暴露外陰)，窺開陰道后，用一次性無菌棉簽伸入陰道后穹窿處，旋轉(zhuǎn)5圈取樣。將棉簽頭插入ImL樣本稀釋液(磷酸鹽緩沖系統(tǒng))中，旋轉(zhuǎn)5次后，緊貼管壁擠壓旋轉(zhuǎn)2次，獲得待測樣本。A、實驗方法:細(xì)胞因子/趨化因子抗體芯片定性檢測實驗條件:I)將預(yù)先標(biāo)記有174個細(xì)胞因子抗體的膜(RayBiotech，美國)放入檢測盒中，然后加入2ml封閉液,室溫封閉6小時；2)棄去封閉液，加入1.2ml待檢樣本I份，4°C過夜孵育；3)棄去樣本，用2ml洗滌緩沖液清洗5次；4)加入Iml生物素偶聯(lián)的檢測抗體，室溫孵育2小時；5)棄去抗體，用2ml洗滌緩沖液清洗5次；6)加入2ml辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的鏈霉素親和素，室溫孵育2小時；7)棄去液體，用2ml洗滌緩沖液清洗5次；8)在膜上加入化學(xué)發(fā)光試劑500 μ I,避光作用2分鐘,觀察結(jié)果。從胎膜早破組、健康對照組和羊水樣本組中各收集的待測樣本均采用上述實驗條件進行檢測，所得結(jié)果如圖1、圖2和圖3所示。實驗結(jié)果:圖1 、圖2和圖3中的標(biāo)記I為IGFBP-1的表達(dá)信號，標(biāo)記2為sICAM_l的表達(dá)信號，標(biāo)記3為Axl的表達(dá)信號。從圖1、圖2和圖3中可以看出，胎膜早破組的陰道分泌物和羊水樣本組中IGFBP-1、sICAM-U Axl的表達(dá)較強，而健康妊娠婦女陰道分泌物樣本中上述三者的表達(dá)較弱，上述三者中，又以sICAM-1的表達(dá)最強。B、實驗方法:酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測實驗條件:實驗材料:sICAM_lELISA檢測試劑盒(R&D公司)1.試劑的配制洗漆緩沖液(WashBuffer)底物溶液(Substrate Solution):使用前,將試劑盒中的顯色劑A和顯色劑B等量、避光混合15分鐘，每個孔需要兩種顯色劑的混合物200 μ I。s I CAM-1標(biāo)準(zhǔn)品:用Iml去離子水將sICAM_l標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品原液濃度為250ng/ml。為確保標(biāo)準(zhǔn)品充分混勻，在進一步稀釋前，將標(biāo)準(zhǔn)品放于搖床上輕輕晃動混勻至少15分鐘以上。分別將250ng/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品配置成濃度為 50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml,3.13ng/ml、l.56ng/ml的sICAM-1檢測標(biāo)準(zhǔn)品；RD5_7校準(zhǔn)稀釋劑作為空白對照(Ong/ml)2.檢測程序向每個微孔中加入100 μ I sICAM-lConjugate ;標(biāo)準(zhǔn)品、對照物、樣本的加入量為ΙΟΟμΙ，并加入到對應(yīng)的微孔中。將微孔用試劑盒提供的膠條蓋好。將微孔板在室溫條件下置于水平搖床上500±50轉(zhuǎn)/分鐘培育1.5小時。洗板；每孔加底物溶液(SubstrateSolution) 200 μ I,室溫條件下，避光、平放培育30分鐘；每孔加50 μ I終止液(StopSolution)?？字腥芤旱念伾珜⒂伤{(lán)色變?yōu)辄S色。如果孔中溶液顏色為綠色或顏色變化不一致，輕輕拍打平板，以確保溶液充分混勻；30分鐘內(nèi)測450nm吸光值。3.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本含量。4.將計算所得的每個待測樣本的含量統(tǒng)計并繪制成圖表，所得圖表見附圖4。實驗結(jié)果:圖4中，AF of control為羊水樣本，CVF of PROM為胎膜早破組的陰道分泌物，CVF of control為健康對照組的陰道分泌物。從圖4可以看出，sICAM-1在健康妊娠婦女羊水樣本中的濃度最高，平均可達(dá)到80ng/mL ；sICAM-l在胎膜早破組陰道分泌物樣本中的濃度90%以上可達(dá)到2ng/mL以上；sICAM_l在健康對照組陰道分泌物樣本中的濃度90%以上在Ing/mL以下。從實施例1的實驗結(jié)果可知，發(fā)生胎膜早破妊娠婦女的陰道分泌物中主要發(fā)生含量變化之一的是可溶性細(xì)胞間粘附分子sICAM-1，而sICAM-1主要來自于胎膜破裂的羊水中。以下是以妊娠婦女陰道分泌物中sICAM-1為檢測目標(biāo)分子，并按照不同的制備方法制備所得的免疫層析試紙的對照例，各對照例的制備方法如下:對照例IA、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為2mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被得層析膜；
B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊，膠體金為購買市售的產(chǎn)品；C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得對照例1-檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售的產(chǎn)品。對照例2A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為lmg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為3mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊，膠體金為購買市售的產(chǎn)品；C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得對照例2-檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售的產(chǎn)品。對照例2和對照例I的區(qū)別在于檢測線工作液和質(zhì)控線工作液濃度的不同。對照例3A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為3mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為3mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊，膠體金為購買市售的產(chǎn)品；C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得對照例3-檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售的產(chǎn)品。對照例4A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為1.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為
0.5mg/mL，將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊，膠體金為購買市售的產(chǎn)品；C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得對照例4-檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊為購買市售的產(chǎn)品。對照例5A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為
1.5mg/mL，將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊，膠體金為購買市售的產(chǎn)品；
C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得對照例5-檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售的產(chǎn)品。對照例6A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為1.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為1.5mg/mL，將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊，膠體金為購買市售的產(chǎn)品；C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售的產(chǎn)品。對照例7A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為
0.5mg/mL，將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊，膠體金為購買市售的產(chǎn)品；C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售的產(chǎn)品。對照例8A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為1.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為
1.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在36°C下干燥8小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊，膠體金為購買市售產(chǎn)品；C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售的產(chǎn)品。對照例9A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為
0.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在38°C下干燥12小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊，膠體金為購買市售產(chǎn)品；C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售產(chǎn)品。對照例10A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為1.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊，膠體金為購買市售產(chǎn)品；C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售產(chǎn)品。對照例11A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為1.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊；所述膠體金為采用以下方法制備而成:將0.005g/mL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為0.5g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，加入量為每IOOmL氯金酸水溶液中加入2mL，煮沸3-10分鐘，冷卻后用K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售產(chǎn)品。對照例12A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為1.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊；所述膠體金為采用以下方法制備而成:將0.02g/mL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為2g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，加入量為每IOOmL氯金酸水溶液中加入3mL，煮沸3-10分鐘，冷卻后用K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售產(chǎn)品。對照例13A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為1.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊；將0.0lg/1OOmL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為2g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，加入量為每IOOmL氯金酸水溶液中加入2.5mL，煮沸3_10分鐘，冷卻后用K2CO3水溶液調(diào)節(jié)PH值至6.0-7.0得膠體金。C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售產(chǎn)品。對照例14A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為1.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊；將0.0 lg/1OOmL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為2g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，加入量為每IOOmL氯金酸水溶液中加入2.5mL,煮沸3_10分鐘，冷卻后用0.5mol/L的K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售產(chǎn)品。對照例15A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為
1.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊；將0.01g/100mL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為12g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，加入量為每IOOmL氯金酸水溶液中加入2.5mL,煮沸3_10分鐘，冷卻后用0.lmol/L的K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售產(chǎn)品。對照例16A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為
1.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊；將0.0lg/1OOmL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為2g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，加入量為每IOOmL氯金酸水溶液中加入2.5mL,煮沸3_10分鐘，冷卻后用0.3mol/L的K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊、吸水墊均為購買市售產(chǎn)品。對照例17A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為
1.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊；所述膠體金為采用以下方法制備而成:將0.01g/100mL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為2g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，加入量為每IOOmL氯金酸水溶液中加入
2.5mL,煮沸3-10分鐘，冷卻后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊為采用以下方法制備而成:將玻璃纖維浸泡于PH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液中2小時后，于36°C干燥8小時得樣品墊；所述吸水墊為購買市售產(chǎn)品。對照例18A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為
1.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊；所述膠體金為采用以下方法制備而成:將0.01g/100mL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為2g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，加入量為每IOOmL氯金酸水溶液中加入
2.5mL,煮沸3-10分鐘，冷卻后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊為采用以下方法制備而成:將玻璃纖維浸泡于PH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液中6小時后，于38°C干燥12小時得樣品墊；所述吸水墊為購買市售產(chǎn)品。對照例19A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為
1.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時得層析膜；
B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊；所述膠體金為采用以下方法制備而成:將0.01g/100mL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為2g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，加入量為每IOOmL氯金酸水溶液中加入
2.5mL,煮沸3-10分鐘，冷卻后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊為采用以下方法制備而成:將玻璃纖維浸泡于PH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液中2-6小時后，于36-38°C干燥8-12小時得樣品墊；所述磷酸鹽緩沖液中含有0.5mL/100mL的Triton-XlOO和0.5g/100mL的BSA ;所述吸水墊為購買市售產(chǎn)品。對照例20A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為
1.5mg/mL,將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時得層析膜；B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊；所述膠體金為采用以下方法制備而成:將0.01g/100mL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為2g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，加入量為每IOOmL氯金酸水溶液中加入
2.5mL,煮沸3-10分鐘，冷卻后用0.1-0.3mol/L的K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙；所述樣品墊為采用以下方法制備而成:將玻璃纖維浸泡于PH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液中2-6小時后，于36-38°C干燥8-12小時得樣品墊；所述磷酸鹽緩沖液中含有3.0mL/1OOmL的Triton-XlOO和2g/100mL的BSA ;所述吸水墊為購買市售產(chǎn)品。上述對照例1-20中的材料來源如下:羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體:購自R&D公司；羊抗鼠IgG多克隆抗體:購自上海派坤生物工程有限公司；鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體:購自R&D公司；樣品墊(市售):購自Ahlstrom公司；吸水墊(市售):購自上海杰一生物科技有限公司；膠體金(市售):購自上海捷寧生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA):Roche公司；實施例2將不同方法制備而成的對照例1-20免疫層析試紙分別用于檢測同樣的妊娠婦女陰道分泌物的臨床樣本，包括有胎膜早破組和健康對照組，其中胎膜早破組為240例，健康對照組為260例，試驗對象均采用實施例1的方法進行臨床診斷和篩選。樣本收集:妊娠婦女取膀胱截石位(以平仰臥位躺下，雙下肢分開屈曲，暴露外陰)，窺開陰道后，用一次性無菌棉簽伸入陰道后穹窿處，旋轉(zhuǎn)5圈取樣。將棉簽頭插入ImL樣本稀釋液(磷酸鹽緩沖系統(tǒng))中，旋轉(zhuǎn)5次后，緊貼管壁擠壓旋轉(zhuǎn)2次，獲得樣本。樣本試驗對象年齡分布:利用對照例1-20分別對所收集的500例樣本進行檢測，所得檢測結(jié)果的陰性和陽性例數(shù)統(tǒng)計見表一:表一
權(quán)利要求
1.一種檢測胎膜早破免疫層析試紙的制備方法，其特征在于:所述制備方法包括有以下步驟: A、羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為1.5-2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為0.5-1.5mg/mL，將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在36-38°C下干燥8-12小時得層析膜； B、將鼠抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1單克隆抗體和膠體金制備成膠體金結(jié)合墊； C、將A和B步驟所得的層析膜和膠體金結(jié)合墊按照樣品墊、膠體金結(jié)合墊、層析膜、吸水墊的順序依次粘貼在膠板上制備得所述檢測胎膜早破免疫層析試紙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述A步驟中檢測線工作液濃度為2.5mg/mL,質(zhì)控線工作液濃度為1.5mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述A步驟中經(jīng)包被后的硝酸纖維素膜在38°C下干燥10小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述B步驟中膠體金為采用以下方法制備而成:將0.005g-0.03g/100mL的氯金酸水溶液加熱至沸，攪拌下加入濃度為0.5-2g/100mL的檸檬酸三鈉水溶液，加入量為每IOOmL氯金酸水溶液中加入2_3mL，煮沸3-10分鐘，冷卻后用K2CO3水溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0-7.0得膠體金。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:所述B步驟中氯金酸水溶液的濃度為 0.01g/100mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:所述B步驟中加入的檸檬酸三鈉水溶液的濃度為2g/100mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:所述B步驟中加入的檸檬酸三鈉水溶液的體積為2.5mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:所述B步驟中K2CO3水溶液的濃度為0.1-0.3mol/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述C步驟中樣品墊為采用以下方法制備而成:將玻璃纖維浸泡于pH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液中2-6小時后，于36_38°C干燥8-12小時得樣品塾。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于:所述C步驟中磷酸鹽緩沖液中還含有 0.5-3.0mL/1OOmL 的 Triton-XlOO 和 0.5_2g/100mL 的 BSA。
全文摘要
本發(fā)明公開一種免疫層析試紙的制備方法，具體涉及一種檢測胎膜早破免疫層析試紙的制備方法。所述制備方法中的層析膜為按以下方法制備所得羊抗人可溶性細(xì)胞間粘附分子-1多克隆抗體作為檢測線的工作液，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線的工作液；檢測線工作液濃度為1.5-2.5mg/mL，質(zhì)控線工作液濃度為0.5-1.5mg/mL，將所述檢測線工作液和質(zhì)控線工作液在硝酸纖維素膜上進行包被，所得硝酸纖維素膜在36-38℃下干燥8-12小時得層析膜；本發(fā)明制備方法制備所得的檢測胎膜早破免疫層析試紙的靈敏性和特異性有較明顯的提高，分別可達(dá)到97%以上和93%以上，從而減少誤診的發(fā)生率。
文檔編號G01N33/577GK103149362SQ201310064278
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者關(guān)祥乾, 胡懷忠 申請人:成都創(chuàng)宜生物科技有限公司