專利名稱：一種基于γ-Fe₂O₃納米材料免疫磁分離食源性致病菌快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種致病菌的快速檢測(cè)方，尤其涉及一種基于Y-Fe2O3的免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
基本原理:單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，這種結(jié)合不會(huì)改變單克隆抗體、抗原和酶的免疫學(xué)特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會(huì)與特異性的抗原結(jié)合。其主要的原理步驟:1.利用Y晶型的Fe2O3磁珠，包被一層高分子化合物，經(jīng)過(guò)修飾后后采用適當(dāng)?shù)呐悸?lián)劑將待檢目標(biāo)菌的單克隆抗體偶聯(lián)在磁珠表面，形成特異性免疫磁珠，并封閉多余活性位點(diǎn)。2.將另一部分目標(biāo)菌的特異性單克隆抗體采用一定的方法固定在固相載體表面，并將多余活性位點(diǎn)封閉。3.將制備的特異性免疫磁珠用于抓取富集目標(biāo)菌，通過(guò)外加磁場(chǎng)將磁珠分離出來(lái)，此時(shí)，結(jié)合了目標(biāo)菌的磁珠和沒(méi)有結(jié)合目標(biāo)菌的磁珠還是混在一起。4.將上述混在一起的磁珠，加到第2步的固相載體表面，則抓取了目標(biāo)菌的磁珠將與固相載體表面單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心，用無(wú)菌的去離子水清洗可以將未發(fā)生結(jié)合的磁珠洗脫，如不存在目標(biāo)菌，則所有磁珠都被洗掉。5.再采用洗脫劑將固相載體上結(jié)合的特異性納米免疫磁珠洗下來(lái)，用外加磁場(chǎng)將這部分磁珠分離，清洗掉離子、溶劑。此部分磁珠如果存在，就是抓取了目標(biāo)菌的磁珠。6.加入硝酸和硫酸進(jìn)行硝化反應(yīng)，這部分磁珠如果存在，則Fe2O3轉(zhuǎn)化為三價(jià)鐵離子和二價(jià)鐵離子。所有食品標(biāo)準(zhǔn)中致病菌都是不得檢出的。通過(guò)檢測(cè)是否存在鐵離子就可以檢測(cè)出樣本中是否存在目標(biāo)菌。通過(guò)加標(biāo)，在一定范圍內(nèi)可以定量檢測(cè)目標(biāo)菌。該方法中Y-Fe2O3磁珠既是分離富集的手段，同時(shí)也是定量檢測(cè)的載體，起了一個(gè)信號(hào)放大的作用。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)就是快速、靈敏度相對(duì)較高。相對(duì)于致病菌的微生物培養(yǎng)2-3天甚至幾天的時(shí)間。此方法主要取決于樣品的預(yù)處理時(shí)間。因此，用該方法可做大規(guī)模待檢樣本的陽(yáng)性篩選，檢出的陽(yáng)性樣還需用微生物培養(yǎng)進(jìn)行確證。目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道這種方法，但是采用免疫磁珠進(jìn)行致病菌的富集、目標(biāo)物的富集等的報(bào)道還是很多的，但沒(méi)有采用檢驗(yàn)鐵離子的方法做進(jìn)一步的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于Y -Fe2O3納米材料免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測(cè)方法，用于對(duì)各種不同的食品樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，該方法是一種客觀有效的檢出食品中有害致病菌的方法，從而在某種程度上大大縮減了食品樣品有害致病菌的篩選時(shí)間?！N基于Y-Fe2O3的納米免疫磁分離快速檢測(cè)出食品中的有害致病菌的方法，通過(guò)分離捕獲的免疫磁珠，使其轉(zhuǎn)化為鐵離子，提出鐵離子與目標(biāo)菌的相關(guān)性指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)鐵離子來(lái)間接定量目標(biāo)菌。不同的致病菌檢出下限不同。該方法依賴于建立的可用于食品樣品中有害致病菌特征性免疫磁珠富集、分離。采用偶聯(lián)了特異性單克隆抗體的免疫磁珠，可以將樣品中的特異性致病菌進(jìn)行富集；通過(guò)設(shè)計(jì)雙抗夾心分離捕獲到目標(biāo)菌的磁珠，再將磁珠硝化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為三價(jià)鐵離子和二價(jià)鐵離子。采用鄰二氮菲吸光光度法、硫氰酸鉀比色法等可以檢測(cè)出鐵離子的量，從而可以算出磁珠的量，通過(guò)加標(biāo)定量磁珠而在一定程度間接定量出目標(biāo)菌的量。通過(guò)定量分析捕獲目標(biāo)菌的磁珠含量，從而可以間接定量出食品樣品中的有害致病菌含量。檢測(cè)出的致病菌含量與磁珠含量線性相關(guān)，擬合度較好。最終以免疫磁珠與致病菌間的對(duì)應(yīng)關(guān)系為紐帶，確定食品樣本中的致病菌菌落數(shù)。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，步驟如下:
1)檢測(cè)目標(biāo)菌的特異性免疫磁珠的制備；
2)將目標(biāo)菌特異性單克隆抗體固定在固相載體表面；
3)免疫磁珠富集目標(biāo)菌株，并分離:將第I步制得的免疫磁珠加入待檢樣品，充分混合震蕩，抓取目標(biāo)菌后通過(guò)施加外加磁場(chǎng)，則磁珠就匯集到磁場(chǎng)一邊，吸走上清液則可以分離出磁珠，若待檢樣本中有目標(biāo)菌，則被磁珠所富集，加少量無(wú)菌的去離子水則形成目標(biāo)菌的磁珠懸池液；
4)將富集的磁珠懸濁液加到第2步制作的固定了單克隆抗體的固相載體上，若存在目標(biāo)菌則形成雙抗夾心；用無(wú)菌的去離子水清洗，則沒(méi)有抓取到目標(biāo)菌的磁珠就被洗掉，若不存在目標(biāo)菌，則所有磁珠都被洗掉；
5)之后，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的磁珠洗下來(lái)，用外加磁場(chǎng)分離磁珠的方法分離磁珠，用無(wú)菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在磁珠，這部分磁珠就是抓到目標(biāo)菌的磁珠；
6)加入硝酸和硫酸進(jìn)行硝化反應(yīng)，這部分磁珠如果存在，則被反應(yīng)轉(zhuǎn)化為三價(jià)鐵離子和二價(jià)鐵離子，所有食品標(biāo)準(zhǔn)，致病菌均不得檢出，此時(shí)若檢出了鐵離子就間接檢出了目標(biāo)致病菌，采用鄰二氮菲吸光光度法、硫氰酸鉀比色法等可以檢測(cè)出鐵離子的量，從而可以算出磁珠的量，通過(guò)加標(biāo)定量磁珠而在一定程度間接定量出目標(biāo)菌的量。所述NMR納米免疫磁珠核材Y -Fe2O3材料，Y晶形的納米粒徑小于1000納米，包被材料為葡聚糖、殼聚糖等能被硝化有機(jī)高分子。所述的目標(biāo)菌的最終檢出評(píng)價(jià)方法是基于是否檢出鐵離子及鐵離子的濃度。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供一種客觀的快速檢測(cè)出食品中的有害致病菌的方法，其特征是通過(guò)檢驗(yàn)鐵離子間接檢出目標(biāo)致病菌。該方法可以客觀有效地對(duì)食品中有害致病菌進(jìn)行檢測(cè)，相比于致病菌的生物培養(yǎng)確認(rèn)，該方法具有快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，可以用于大規(guī)模樣本的快速篩選。一定程度上可以定量檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式實(shí)例I
檢測(cè)食品樣本中測(cè)定其是否含有有害致病菌一李斯特菌。1.免疫磁珠制備:磁珠與單克隆抗體的偶聯(lián)。采用商品化羧基化磁珠,或采用微乳液法自行制備Y-Fe2O3納米微球,通過(guò)包被修飾成羧基化磁珠或氨基化磁珠。單克隆抗體采用生物試劑公司購(gòu)買(mǎi)的商品李斯特菌單克隆抗體，或自行制備單克隆抗體并分離純化。以羧基化磁珠為例，偶聯(lián)步驟:①清洗:分別取5mg羧基化磁珠于5mL離心管中，2mL磷酸緩沖液(PB) 0.02M, pH=6.0洗2次，洗滌后用2mL水嗎啉乙磺酸(MES) 0.05M, pH=6.0重懸；②活化:超聲使磁珠分散，再分別加入Img碳二亞胺(EDC)，lmg N-羥基琥珀酰亞胺(NHSS)(用0.05M,pH=6.0 MES溶解)，25°C活化2h，旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài)；③偶聯(lián):磁分離，吸去上清，2mL PB (0.02M, pH=7.4)洗滌一次并轉(zhuǎn)移至新的離心管，3mL磷酸鹽緩沖液(PBS) 0.02M, pH=7.4重懸，超聲使磁珠分散。再分別將275 μ g抗體加入到已活化磁珠中，25°C偶聯(lián)3h，旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài)；④封閉:磁分離，取出上清(上清中的蛋白含量用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè),測(cè)算偶聯(lián)量),加入lmg/mL乙醇胺及l(fā)mg/mL牛血清白蛋白(BSA)封閉(0.02M, pH=7.4的PB溶解，并調(diào)節(jié)pH至中性)，25°C封閉2h，旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài)；⑤保存:0.01M PBS洗滌磁珠2次，磁分離，去上清，用3mL pH7.4 PB(0.02M, 0.02% NaN3，0.5%BSA)重懸，存于4°C。制備的免疫磁珠備用。2.單克隆抗體固定:可以采用常規(guī)的酶標(biāo)板固定方法，也可以采用以下方法。用干凈的蓋玻片5X5mm2正方形,鍍膜機(jī)先噴一層Cr (2 - 4 nm)用以幫助固定金。再用在表面濺射噴上一層納米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亞胺-丙酸酯(DSP)對(duì)納米金進(jìn)行修飾(DMS0，二甲基亞砜稀釋DSP)。加入李斯特菌單克隆單抗，即將100 L 100 g/mL單克隆抗體通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)法固定在玻璃板上并37 C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22 C，I小時(shí)，將板上剩余的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉并干燥。3.將食品樣本進(jìn)行預(yù)處理，得到待檢液體樣本。將第一步制得的免疫單克隆抗體磁珠加入后進(jìn)行充分震蕩數(shù)分鐘。上磁力架分離磁珠，加少量無(wú)菌的去離子水得到磁珠的懸濁液。此時(shí)，如果待檢樣本中有目標(biāo)李斯特菌，則通過(guò)免疫磁珠的特異性反應(yīng)就達(dá)到了目標(biāo)菌富集的目的。將此富集的磁珠懸濁液加到第2步所制備的單克隆抗體固定板上，反應(yīng)一段時(shí)間則磁珠乳液中結(jié)合了李斯特菌的磁珠會(huì)進(jìn)一步與固定板上的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)。此時(shí)用無(wú)菌的去離子水清洗，就可以將沒(méi)有結(jié)合李斯特菌的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有結(jié)合了李斯特菌的磁珠。

4.用洗脫液(甲醇等)將固定板上的結(jié)合了李斯特菌的磁珠洗脫下來(lái)。上磁力架，分離磁珠并清洗1-2次，將離子、溶劑洗去。加入硝酸和硫酸進(jìn)行硝化反應(yīng)，如果存在磁珠，則反應(yīng)使之轉(zhuǎn)化為三價(jià)鐵離子和二價(jià)鐵離子。所有食品標(biāo)準(zhǔn)，致病菌均不得檢出，檢出了鐵離子就間接檢出了目標(biāo)致病菌。加入還原劑鹽酸羥胺使三價(jià)鐵離子全部轉(zhuǎn)化為二價(jià)鐵離子，采用鄰二氮菲吸光光度法可以檢測(cè)出鐵離子的量，從而可以算出磁珠的量，通過(guò)加標(biāo)定量磁珠而在一定程度間接定量出目標(biāo)菌的量。實(shí)例2
測(cè)定食品樣品是否含有有害致病菌大腸桿菌0157:H7。1.免疫磁珠制備:磁珠與單克隆抗體的偶聯(lián)。采用商品化羧基化磁珠,或采用微乳液法自行制備Y-Fe2O3納米微球,通過(guò)包被修飾成羧基化磁珠或氨基化磁珠。單克隆抗體采用商品的大腸桿菌0157:H7單克隆抗體，或自行制備單克隆抗體并分離純化。以羧基化磁珠為例，偶聯(lián)步驟:①清洗:分別取5mg羧基化磁珠于5mL離心管中，2mL PB (0.02M,pH=6.0)洗2次，洗滌后用2mL MES (0.05M, pH=6.0)重懸；②活化:超聲使磁珠分散，再分別加入 Img EDC, Img NHSS (用 0.05M, pH=6.0 MES 溶解)，25°C活化 2h，旋轉(zhuǎn)儀 15r/min 保持懸浮狀態(tài)；③偶聯(lián):磁分離，吸去上清，2mL PB (0.02M,pH=7.4)洗滌一次并轉(zhuǎn)移至新的離心管，3mL PB (0.02M，pH=7.4)重懸，超聲使磁珠分散。再分別將275 μ g單克隆抗體加入到已活化磁珠中，25°C偶聯(lián)3h,旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài)；④封閉:磁分離,取出上清(上清中的蛋白含量待檢)，加入lmg/mL乙醇胺及l(fā)mg/mL BSA封閉(0.02M，pH=7.4的PB溶解，并調(diào)節(jié)pH至中性)，25°C封閉2h，旋轉(zhuǎn)儀15r/min保持懸浮狀態(tài)逾保存:0.0lM PBS洗滌磁珠 2 次，磁分離，去上清，用 3mL ρΗ7.4 PB (0.02Μ, 0.02% NaN3，0.5%BSA)重懸，存于 4°C。制備的免疫磁珠備用。2.單克隆抗體固定:可以采用常規(guī)的酶標(biāo)板固定方法，也可以采用以下方法。用干凈的蓋玻片5X5mm2正方形,鍍膜機(jī)先噴一層Cr (2 - 4 nm)用以幫助固定金。再用在表面濺射噴上一層納米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥珀酰亞胺-丙酸酯(DSP)對(duì)納米金進(jìn)行修飾(DMS0，二甲基亞砜稀釋DSP)。加入0157:H7單克隆抗體，即將100 L 100 g/mL單克隆抗體通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)法固定在玻璃板上并37 C孵育45 min，形成如下結(jié)構(gòu)。加入牛血清蛋白將板上剩余的活性位點(diǎn)進(jìn)行封閉并干燥。3.將食品樣本進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾、增菌活化等預(yù)處理，得到待檢樣本。將第一步制得的免疫單克隆抗體磁珠加入后進(jìn)行充分震蕩數(shù)分鐘。上磁力架分離磁珠，加少量水得到磁珠的乳液。此時(shí)，如果待檢樣本中有目標(biāo)大腸桿菌0157:H7，則通過(guò)免疫磁珠的特異性反應(yīng)就達(dá)到了目標(biāo)菌富集的目的。將此富集的磁珠懸濁液加到第2步所制備的單克隆抗體固定板上，則磁珠懸池液中結(jié)合了大腸桿菌0157:H7的磁珠會(huì)進(jìn)一步與固定板上的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)。此時(shí)用無(wú)菌的去離子水清洗，就可以將未結(jié)合大腸桿菌0157:H7的磁珠洗去。在固定板上剩下的就只有結(jié)合了大腸桿菌0157:H7的磁珠。4.用洗脫液(甲醇等)將固定板上的結(jié)合了 0157:H7的磁珠洗脫下來(lái)。上磁力架，分離磁珠并清洗1-2次，將離子、溶劑洗去。加入硝酸和硫酸進(jìn)行硝化反應(yīng)，如果存在磁珠，則反應(yīng)使之轉(zhuǎn)化為三價(jià)鐵離子和二價(jià)鐵離子。所有食品標(biāo)準(zhǔn)，致病菌均不得檢出，檢出了鐵離子就間接檢出了目標(biāo)致病菌。加入還原劑鹽酸羥胺使三價(jià)鐵離子全部轉(zhuǎn)化為二價(jià)鐵離子，采用鄰二氮菲吸光光度法可以檢測(cè)出鐵離子的量，從而可以算出磁珠的量，通過(guò)加標(biāo)定量磁珠而在一定程度間接定量出目標(biāo)菌 的量。
權(quán)利要求
1.一種基于Y -Fe2O3納米材料免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測(cè)方法，其特征步驟如下: 1)檢測(cè)目標(biāo)菌的特異性免疫磁珠的制備； 2)將目標(biāo)菌特異性單克隆抗體固定在固相載體上； 3)免疫磁珠富集目標(biāo)菌株并分離:將第I步制得的免疫磁珠加入待檢樣品，充分混合震蕩，抓取目標(biāo)菌后通過(guò)施加外加磁場(chǎng)，則磁珠就匯集到磁場(chǎng)一邊，吸走上清液則可以分離出磁珠，若待檢樣本中有目標(biāo)菌，則被磁珠所富集，加少量無(wú)菌的去離子水則形成目標(biāo)菌的磁珠懸池液； 4)將富集的磁珠懸濁液加到固定了單克隆抗體的固相載體上，若存在目標(biāo)菌則形成雙抗夾心，用無(wú)菌的去離子水清洗，則沒(méi)有抓取到目標(biāo)菌的磁珠就被洗掉，若不存在目標(biāo)菌，則所有磁珠都被洗掉； 5)之后，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的磁珠洗下來(lái)，用外加磁場(chǎng)分離磁珠的方法分離磁珠，用無(wú)菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在磁珠，這部分就是抓到目標(biāo)菌的磁珠； 6)這部分磁珠，加入分析純的硝酸和硫酸進(jìn)行硝化反應(yīng)，使磁珠Fe2O3轉(zhuǎn)變?yōu)槿齼r(jià)鐵離子和二價(jià)鐵離子，采用鄰二氮菲吸光光度法、硫氰酸鉀比色法等可以檢測(cè)出鐵離子的量，從而可以算出磁珠的量，通過(guò)加標(biāo)定量磁珠而在一定程度間接定量出目標(biāo)菌的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Y-Fe2O3納米材料免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測(cè)方法，其特征是所述免疫磁珠為Y -Fe2O3材料，表面修飾為葡聚糖、殼聚糖等可被硝化反應(yīng)的有機(jī)高分子，納米磁珠粒徑小于1000納米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Y-Fe2O3納米材料免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測(cè)方法，其特征是所述的目標(biāo)菌最終檢出評(píng)價(jià)方法是通過(guò)分析捕獲目標(biāo)菌的磁珠Fe2O3的量，間接計(jì)算目標(biāo)菌的量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于Y-Fe2O3納米材料免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測(cè)方法，其特征是通過(guò)硝化反應(yīng)，將捕獲目標(biāo)菌的磁珠轉(zhuǎn)化成鐵離子，通過(guò)檢測(cè)出鐵離子的量來(lái)定量磁珠量并間接定量目標(biāo)菌。
全文摘要
一種基于γ-Fe2O3納米材料免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測(cè)方法，屬于食品安全致病菌快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明依賴于建立的可以用于食品液體樣本中致病菌的快速篩選方法，利用γ晶型Fe2O3納米材料制備的免疫磁珠針對(duì)性地富集目標(biāo)菌株，通過(guò)分離捕獲了目標(biāo)菌的納米磁珠，再硝化反應(yīng)使之轉(zhuǎn)化為鐵離子，檢驗(yàn)鐵離子從而間接檢測(cè)出樣本中是否含有目標(biāo)致病菌。在一定條件下鐵離子的量與目標(biāo)菌顯示出線性關(guān)系，在一定范圍能夠定量檢測(cè)目標(biāo)菌。該方法可以用于食品樣本中有害致病菌的快速檢測(cè)，從而可以作為大批待檢樣品的快速篩選。
文檔編號(hào)G01N33/569GK103149354SQ201310032119
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者張錦勝, 彭紅, 賴衛(wèi)華 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)