專利名稱：一種抗AChE干擾且能快速檢測BChE活性的方法
—種抗AChE干擾且能快速檢測BChE活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶活性檢測技術(shù)，特別是一種抗AChE (乙酰膽堿酯酶)干擾且能快速檢測BChE (丁酰膽堿酯酶)活性的方法。
背景技術(shù)：
近年來，由于膽堿酯酶在人體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)傳感中的重要性，以及在阿爾茲海默癥治療中的關(guān)鍵作用受到廣泛關(guān)注，參見:Lane, R.M.;Potkin, S.G.;Enz,A.1nt.J.Neuropsychopharmacol.2006, 9, 101 - 124。目前，基于膽堿酯酶活性的檢測和相應(yīng)的抑制劑的篩選已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，參見:l)Pardo_Yissar，V.;Katz, E.;Wasserman, J.;ffiI lner, 1.J.Am.Chem.Soc.2003，125，622-623 ;2) Maeda, H.; Mastuno, H.; Ushida, M.; Katayama, K.; Saeki, K.; Itoh, N.Angew.Chem., Int.Ed.2005, 44, 2922 - 2925 ；3) Bailey,D.M.; Hennig, A.; Uzunova, V.D.; Nau, ff.M.Chem.Eur.J.2008, 14, 6069 - 6077 ；4) Nau, ff.M.;Ghale, G.;Hennig, A.;Bakirci, H.;Bailey, D.M.J.Am.Chem.Soc.2009, 131, 11558 - 11570 ；5) Ghale, G.; Ramalingam, V.; Urbach, A.R.; Nau, ff.M.J.Am.Chem.Soc.2011, 133, 7528 -7535 ；6) Dsouza, R.N.; Hennig, A.; Nau, ff.M.Chem.Eur.J.2012, 18, 3444 - 3459。脊柱動(dòng)物體內(nèi)普遍存在兩種重要膽堿酯酶，乙酰膽堿酯酶(AChE)和丁酰膽堿酯酶(BChE),相似度 >65%,參見:Massoulie, J.; Sussman, J.; Bon, S.; SiIman, 1.BrainRes.1993，98，139146。研究證明，BChE在人體內(nèi)具有清除體內(nèi)抗膽堿物質(zhì)，將藥物前體轉(zhuǎn)化為活性組分等重要的作用，參見:Cokugras1A.N.Turk.J.Biochem.2003，28，54 - 61。并且，在阿爾茲海默癥患者的體內(nèi)，AChE的活性降低，BChE活性升高，使得BChE可以作為該疾病診斷和治療的目標(biāo)，參見:Lane, R.Μ.; Potkin, S.G.; Enz, A.1nt.J.Neuropsychopharmaco1.2006，9，101 - 124。但是，現(xiàn)有的多數(shù)檢測膽堿酯酶活性的方法都是針對AChE活性的檢測，目前還沒有一種能夠快速直接 選擇性檢測BChE的方法。所以，建立一種抗AChE干擾，并且能夠靈敏、快速、實(shí)時(shí)、專一檢測BChE活性的方法具有重大的意義和廣闊的應(yīng)用前景。超分子串聯(lián)檢測是一種新穎的酶活性測定方法，主要利用大環(huán)主體化合物與熒光染料、酶底物、相應(yīng)產(chǎn)物三者鍵合強(qiáng)弱的差異得到熒光檢測信號，再應(yīng)用到酶反應(yīng)過程中，達(dá)到通過檢測熒光信號檢測酶活性的目的，參見:Dsouza，R.N.; Hennig, A.;Nau, ff.M.Chem.Eur.J.2012，18，3444 - 3459。同時(shí)，熒光光譜檢測技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)、易于操作、直觀且快速得到響應(yīng)信號等優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)分析，提供一種抗AChE (乙酰膽堿酯酶)干擾且能快速檢測BChE (丁酰膽堿酯酶)活性的方法，該檢測方法工藝簡單、便于操作、無需標(biāo)記、靈敏快速、直觀持續(xù)、具有良好的生物相容性，能夠在過量的AChE存在下，高選擇的檢測BChE的活性，即時(shí)快速的給出明顯的熒光檢測信號。本發(fā)明的技術(shù)方案:
一種抗AChE (乙酰膽堿酯酶)干擾且能快速檢測BChE (丁酰膽堿酯酶)活性的方法，以磺化杯[4]芳烴(SC4A)和染料光澤精(LCG)作為酶活性檢測的傳感對，以琥珀酰膽堿(SuCh)作為酶反應(yīng)底物，建立了用于BChE活性監(jiān)測的超分子串聯(lián)檢測體系，步驟如下:I)在37° C溫度下，用10mmol/L pH8.0的磷酸緩沖溶液配置含有0.5μπιο1/LSC4A、0.5 μ mol/L LCG和10 μ mol/L SuCh的溶液，得到用于BChE活性監(jiān)測的超分子串聯(lián)檢測體系；2)在上述體系中加入lU/ml的BChE，即可在15min內(nèi)得到明顯的熒光淬滅信號。本發(fā)明的工作原理: 選擇SC4A和LCG作為檢測過程的傳感對。SC4A與酶催化反應(yīng)的底物(SuCh)及相應(yīng)產(chǎn)物(Ch)鍵合差異明顯，且和LCG、SuCh, Ch均有較大的鍵合常數(shù)。同時(shí)SC4A具有很好的生物相容性，經(jīng)濟(jì)易得；光澤精作為競爭染料，量子產(chǎn)率高且和磺化杯[4]芳烴作用后熒光淬滅顯著，與底物/產(chǎn)物競爭鍵合的過程中顯示出明顯的熒光強(qiáng)度變化，得到響應(yīng)信號。以神經(jīng)肌肉的弛緩藥物琥珀酰膽堿(SuCh)作為酶反應(yīng)的底物，它能夠?qū)Ｒ坏谋籅ChE水解，而不被AChE水解，且酶反應(yīng)后生成的Ch與SC4A鍵合更弱，體系熒光淬滅得到檢測信號，這是實(shí)現(xiàn)選擇性檢測BChE活性的前提。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:該方法工藝簡單、便于操作、無需標(biāo)記、靈敏快速、直觀持續(xù)、具有良好的生物相容性，能夠在過量的AChE存在下，高選擇的檢測BChE的活性，即時(shí)快速的給出明顯的熒光檢測信號，在專一檢測BChE活性和阿爾茲海默癥的治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖1為SuCh和C h分別與SC4A.LCG傳感對的競爭鍵合熒光滴定結(jié)果擬合圖。圖2為超分子串聯(lián)檢測體系分別檢測AChE和BChE活性的熒光響應(yīng)對比圖。圖3為超分子串聯(lián)檢測體系在AChEO-7倍過量時(shí)對lU/ml BChE活性檢測的影響。圖4為超分子串聯(lián)檢測體系中，分別加入0_300nmol/L他克林對BChE活性抑制的熒光響應(yīng)。圖5為由加入不同濃度的他克林得到的反應(yīng)初速度擬合得他克林的IC5tl值。
具體實(shí)施方式實(shí)施例:一種抗AChE (乙酰膽堿酯酶)干擾且能快速檢測BChE (丁酰膽堿酯酶)活性的方法，以磺化杯[4]芳烴(SC4A)和染料光澤精(LCG)作為酶活性檢測的傳感對，以琥珀酰膽堿(SuCh)作為酶反應(yīng)底物，建立了用于BChE活性監(jiān)測的超分子串聯(lián)檢測體系，步驟如下:I)在37° C溫度下，用10mmol/L pH8.0的磷酸緩沖溶液配置含有0.5μπιο1/LSC4A、0.5 μ mol/L LCG和10 μ mol/L SuCh的溶液，得到用于BChE活性監(jiān)測的超分子串聯(lián)檢測體系；所述10mmol/L pH8.0磷酸緩沖溶液的配置方法是:稱取1.56g磷酸二氫鈉和
0.33g氫氧化鈉配置成lLlOmmol/L pH8.0磷酸緩沖溶液；選擇SC4A和LCG作為檢測過程的傳感對，采用競爭鍵合熒光滴定方法測得了 SC4A和LCG、SuCh, Ch均有較大的鍵合常數(shù)(Ks為IO5-1O6),提高了體系的靈敏度，且SC4A與酶催化反應(yīng)的底物(SuCh)及相應(yīng)產(chǎn)物(Ch)鍵合大小相差一個(gè)數(shù)量級，競爭鍵合熒光滴定擬合曲線如圖1所示，圖中表明:選擇合適的SC4A.LCG傳感對及SuCh濃度，就可以很好的應(yīng)用于監(jiān)測SuCh轉(zhuǎn)化為Ch的過程，如圖中箭頭所指為反應(yīng)前后的熒光信號差異；光澤精作為競爭染料，有較高的量子產(chǎn)率，和SC4A作用后熒光淬滅顯著，并且能夠在與底物/產(chǎn)物競爭鍵合的過程中顯示出明顯的熒光強(qiáng)度變化，實(shí)現(xiàn)無需標(biāo)記的熒光傳感。以神經(jīng)肌肉的弛緩藥物琥珀酰膽堿(SuCh)作為酶反應(yīng)的底物。它能夠?qū)Ｒ坏谋籅ChE水解，而不被AChE水解，且酶反應(yīng)后生成的Ch和SC4A鍵合較SuCh弱，使體系熒光淬滅得到檢測信號，這是實(shí)現(xiàn)選擇性檢測BChE活性的前提。2)在上述體系中加入lU/ml的BChE，即可在15min內(nèi)得到明顯的熒光淬滅信號，熒光淬滅系數(shù)為1.4。圖2為超分子串聯(lián)檢測體系分別檢測AChE和BChE活性的熒光響應(yīng)對比圖，圖中表明:加入7倍過量(超過人體內(nèi)AChE/BChE比例)的AChE體系無任何熒光響應(yīng)。圖3為超分子串聯(lián)檢測體系在AChEO-7倍過量時(shí)對lU/ml BChE活性檢測的影響，可以看出:同一體系中，即使存在7倍過量的AChE，BChE的檢測過程不受干擾。用SC4A、LCG和SuCh超分子串聯(lián)檢測體系，考察了他克林(Tacrine)對BChE活性的抑制作用。他克林是一種可逆的競爭性抑制劑，常用于阿爾茲海默癥的治療。圖4為體系中加入0-300nmol/L的他克林抑制BChE活性的熒光響應(yīng)圖，圖5為以加入不同濃度他克林得到的反應(yīng)初速度對他克林濃度作圖，圖中顯示:得到他克林的IC5tl值，與文獻(xiàn)吻合，證實(shí)了體系應(yīng)用在BChE抑制劑篩選上的可行性。
權(quán)利要求
1.一種抗AChE (乙酰膽堿酯酶)干擾且能快速檢測BChE (丁酰膽堿酯酶)活性的方法，其特征在于:以磺化杯[4]芳烴(SC4A)和染料光澤精(LCG)作為酶活性檢測的傳感對，以琥珀酰膽堿(SuCh)作為酶反應(yīng)底物，建立了用于BChE活性監(jiān)測的超分子串聯(lián)檢測體系，步驟如下: 1)在37°C溫度下，用10mmol/L pH8.0的磷酸緩沖溶液配置含有0.5 μ mol/LSC4A、.0.5 μ mol/L LCG和10 μ mol/L SuCh的溶液，得到用于BChE活性監(jiān)測的超分子串聯(lián)檢測體系； 2)在上述體系中加入lU/ml的BChE，即可在15min內(nèi)得到明顯的熒光淬滅信號。
全文摘要
一種抗AChE干擾且能快速檢測BChE活性的方法，步驟如下1)以磺化杯[4]芳烴和染料光澤精作為酶活性檢測的傳感對，以琥珀酰膽堿作為酶反應(yīng)底物，37°C下用10mmol/L pH8.0的磷酸緩沖溶液配置含有0.5μmol/LSC4A、0.5μmol/L LCG和10μmol/L SuCh的溶液，建立超分子串聯(lián)檢測體系；2)在上述體系中加入1U/ml的BChE，即可在15min內(nèi)得到明顯的熒光淬滅信號。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是該方法工藝簡單、便于操作、靈敏快速、能夠在過量的AChE存在下，高選擇的檢測BChE的活性，在專一檢測BChE活性和阿爾茲海默癥的治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N21/64GK103091295SQ20131002204
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者劉育, 郭東升, 楊婧 申請人:南開大學(xué)