基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體a抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法及其在ctd-pah中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，可用于結(jié)締組織病合并肺動(dòng)脈高壓臨床檢測(cè)，通過(guò)體外合成4個(gè)長(zhǎng)度不一的胞外肽段，篩選到與全長(zhǎng)ENRA一致性良好的表位肽段，由人工合成該表位肽段作為抗原肽包板，建立基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，所述表位抗原肽為包含如下氨基酸序列的肽段：DNPERYSTNLSNHVDDFTTFRGTELSFLVTTHQPTNLVLPSNGSMHNYCPQQTKIT該方法減低了全長(zhǎng)真核表達(dá)內(nèi)皮素受體作為底物的成本，提高其臨床檢測(cè)實(shí)用性，成為CTD-PAH（特別是SLE-PAH）的生物標(biāo)記物，對(duì)臨床診斷和治療的決策提供具有價(jià)值的信息。
【專(zhuān)利說(shuō)明】基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法及其在CTD-PAH中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于臨床自身抗體檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法及其在結(jié)締組織病合并肺動(dòng)脈高壓中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肺動(dòng)脈高壓(PAH)是不同原因?qū)е碌姆窝h(huán)疾病，最終引起不可逆的肺血管重構(gòu)和右心衰竭，自然病程的中位數(shù)存活時(shí)間僅為2~3年。結(jié)締組織病(CTD)所致的PAH是肺動(dòng)脈高壓疾病譜的重要組成部分，國(guó)外的報(bào)道顯示CTD-PAH占所有PAH的10%，而國(guó)內(nèi)的資料該數(shù)字接近20% ;西方的數(shù)據(jù)顯示系統(tǒng)性硬化癥(SSc)在CTD-PAH中占絕對(duì)主導(dǎo)，而我國(guó)則是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)為導(dǎo)致CTD-PAH的首要原因(構(gòu)成比達(dá)40%)。
[0003]在過(guò)去10年中，隨著以?xún)?nèi)皮素受體拮抗劑、前列環(huán)素類(lèi)似物、磷酸二酯酶抑制劑為代表肺動(dòng)脈高壓靶向治療的問(wèn)世，各種PAH的總體預(yù)后確實(shí)得到了改善，但CTD-PAH患者的預(yù)后仍明顯低于特發(fā)性PAH患者。以SLE為代表的CTD-PAH顯然存在特有的免疫病理機(jī)制，而發(fā)展其免疫病理特征性的生物標(biāo)記物，勢(shì)必有助于早期捕捉、預(yù)測(cè)PAH的發(fā)生和進(jìn)程，為更有針對(duì)性的靶向性干預(yù)提供依據(jù)。
[0004]內(nèi)皮素受體通路是PAH公認(rèn)的致病通路之一，其活化對(duì)PAH的肺血管重構(gòu)起到了關(guān)鍵作用。已有德國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)了 SSc中存在抗內(nèi)皮素受體A抗體，并建立了基于內(nèi)皮素受體蛋白全長(zhǎng)的 ELISA檢測(cè)方法(Riemekasten G, Philippe A, Nather M, et al.1nvolvementof functional autoantibodies against vascular receptors in systemic sclerosis.Ann Rheum Dis.2011Mar; 70 (3):530-6.) ?其研究結(jié)果顯示，抗內(nèi)皮素受體A抗體與SSc的病情嚴(yán)重性存在正相關(guān)；體外的功能實(shí)驗(yàn)則提示該抗體存在活化內(nèi)皮素受體通路的致病功能。該發(fā)現(xiàn)提出了一系列問(wèn)題需要進(jìn)一步解決:(1)抗內(nèi)皮素受體A抗體(ant1-ENRA)是否存在于其他CTD? (2) ant1-ENRA與CTD-PAH是否存在關(guān)聯(lián)，換言之，其是否能夠成為CTD-PAH (特別是未經(jīng)報(bào)道、而在國(guó)人當(dāng)中更為常見(jiàn)的SLE-PAH)的生物標(biāo)記物？ (3)ant1-ENRA作為可能具有致病功能的自身抗體，其存在是否對(duì)內(nèi)皮素受體拮抗劑的個(gè)體化應(yīng)用提供依據(jù)？ (4)從臨床檢測(cè)的技術(shù)層面，由于內(nèi)皮素受體是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，其全長(zhǎng)的真核表達(dá)代價(jià)昂貴，能否通過(guò)表位分析進(jìn)而合成抗原肽，以?xún)?yōu)化并低成本化ant1-ENRA的檢測(cè)方法、提高其臨床檢測(cè)實(shí)用性？這些問(wèn)題急需得到解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)已有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的之一是提供基于內(nèi)皮素受體A表位抗原肽的ant1-ENRA抗體酶聯(lián) 免疫檢測(cè)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的代價(jià)昂貴的缺陷。
[0006]本發(fā)明的目的之二是提供該方法在CTD-PAH作為生物標(biāo)記物檢測(cè)的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明目的之三是提供內(nèi)皮素受體A表位抗原多肽片段用于制備診斷和評(píng)估結(jié)締組織病合并肺動(dòng)脈高壓以及定性和定量檢測(cè)人血清中抗內(nèi)皮素受體A抗體的試劑和試劑盒。
[0008]本發(fā)明的發(fā)明目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009]在前期首先在CTD-PAH的血清中證實(shí)存在抗內(nèi)皮素受體A (而非內(nèi)皮素受體B)的自身抗體，建立了基于ENRA全長(zhǎng)重組蛋白的ant1-ENRA的ELISA方法。進(jìn)而聚焦于獨(dú)立樣本的SLE-PAH，確證了超過(guò)40%的患者存在ant1-ENRA (如圖1所示)。
[0010]一種基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，內(nèi)皮素受體A是一個(gè)7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，由347個(gè)氨基酸序列構(gòu)成，除一段信號(hào)肽外，共有4個(gè)長(zhǎng)度不一的胞外肽段。循環(huán)中的自身抗體應(yīng)與其胞外肽段構(gòu)成的抗原表位結(jié)合。本發(fā)明就是通過(guò)合成了上述4條胞外肽段，篩選到了與全長(zhǎng)ENRA —致性良好的表位肽段(如圖2所示)，由人工合成該表位肽段作為抗原肽包板，并就此建立了基于內(nèi)皮素受體A表位抗原肽的ant1-ENRA抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。所述肽段為內(nèi)皮素受體A的氨基酸序列為(是內(nèi)皮素受體A的2廣76位的56個(gè)氨基酸序列):
[0011 ] DNPERYSTNLSNHVDDFTTFRGTELSFLVTTHQPTNLVLPSNGSMHNYCPQQTKIT。
[0012]所述表位抗原肽包括所有氨基酸序列，及其排列順序。
[0013]基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，具體步驟如下:
[0014]I)、包被緩沖液(PH9.60.05M 碳酸鹽緩沖液)，由 NaHC03 1.59 克，NaHC03 2.93克加蒸懼水至IOOOml ；
[0015]2)、5ug/ml的抗原肽在碳酸緩沖液中包被96孔板過(guò)夜后，PBS-T (IOOOmL PBS加入0.5mL吐溫20)洗滌三次；
[0016]3)、3%的牛血清白蛋白(或0.3%明膠、10%胎牛血清)封閉2小時(shí)，PBS-T洗滌三次；
[0017]4)、患者血清1:100-1:300稀釋后，加入酶標(biāo)板室溫下反應(yīng)I小時(shí)，PBS-T洗滌三次；
[0018]5)、加入適當(dāng)比例稀釋的辣根過(guò)氧化物酶-抗人IgG 二抗，室溫反應(yīng)I小時(shí)；
[0019]6)、加入TMB (Tetramethyl benzidine)底物反應(yīng)10分鐘后，用2M硫酸終止反應(yīng)；
[0020]7)、酶標(biāo)儀吸光度450nM讀板測(cè)吸光度值。
[0021]所述內(nèi)皮素受體A表位抗原多肽片段用于制備診斷和評(píng)估結(jié)締組織病合并肺動(dòng)脈高壓以及定性和定量檢測(cè)人血清中抗內(nèi)皮素受體A抗體的試劑和試劑盒。
[0022]基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法用于CTD-PAH中的生物標(biāo)記物檢測(cè)。
[0023]其中CTD包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、混合性結(jié)締組織病、炎癥性肌病、干燥綜合征、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性血管炎、抗磷脂抗體綜合征。
[0024]本發(fā)明基于表位抗原肽的ant1-ENRA酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，大幅度減低了全長(zhǎng)真核表達(dá)內(nèi)皮素受體作為底物的成本，提高其臨床檢測(cè)實(shí)用性。本發(fā)明可成為CTD-PAH(特別是SLE-PAH)的生物標(biāo)記物，對(duì)臨床診斷和治療的決策提供具有參考價(jià)值的信息。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1在CTD-PAH和SLE-PAH中ENRA全長(zhǎng)重組蛋白的ant1-ENRA的ELISA檢測(cè)。[0026]圖2ENRA結(jié)構(gòu)模建顯示的4條胞外片段。
[0027]圖3以2廣76位表位肽段為底物的ant1-ENRA的ELISA檢測(cè)結(jié)果，以及和ENRA全長(zhǎng)方法的一致性對(duì)照。(計(jì)量資料一致性分析用Intraclass correlation coefficient(ICC)，alpha 系數(shù) >0.7 認(rèn)為一致性比較高。SLE-PAH 組 alpha 系數(shù):0.821 ；SLE 組 alpha系數(shù):0.803 ；NormaI 組 alpha 系數(shù):0.831)
[0028]圖4SLE-PAH陽(yáng)性血清親和層析獲得ant1-ENRA IgG可刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖，并可增強(qiáng)內(nèi)皮素-1 (ET-1)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖效應(yīng)。
[0029]圖5R0C 曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0030]實(shí)施例1
[0031]本發(fā)明基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立:
[0032]1.15ug/ml的抗原在碳酸緩沖液中包被96孔板過(guò)夜后，PBS-T洗滌三次。
[0033]1.23%的牛血清白蛋白(或0.3%明膠、10%胎牛血清)封閉2小時(shí)，PBS-T洗滌三次。
[0034]1.3患者血清1:100-1:300稀釋后，加入酶標(biāo)板室溫下反應(yīng)I小時(shí)，PBS-T洗滌三次。
[0035]1.4加入適當(dāng)比例稀釋的辣根過(guò)氧化物酶-抗人IgG 二抗，室溫反應(yīng)I小時(shí)。
[0036]1.5加入TMB (Tetramethyl benzidine)底物反應(yīng)10分鐘后，用2M硫酸終止反應(yīng)。
[0037]1.6酶標(biāo)儀吸光度450讀板。
[0038]實(shí)施例2
[0039]本發(fā)明獲得的ant1-ENRA IgG對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響
[0040]2.1對(duì)檢測(cè)篩選到的SLE-PAH陽(yáng)性血清，通過(guò)IgG親和層析獲得ant1-ENRA IgG
[0041]I)取出上一步中含有細(xì)胞上清的肽鉸連的蛋白磁珠的EP管，放至EP管架上；
[0042]2)將含有200ul細(xì)胞上清的G蛋白磁珠，置于磁力架上；
[0043]3)待磁珠匯集于EP管的一側(cè)后，吸取棄去清液；
[0044]4)吸取干凈后，取出EP管后置于EP管板上；
[0045]5)向上述EP管中加入IOOul PBS緩沖液洗滌固定磁珠-1gG蛋白復(fù)合物2遍；
[0046]6)在第3次洗滌時(shí)，按照非變性方式洗脫；
[0047]7)非變性洗脫液:加入50ul Tris-甘氨酸(pH=2.5)到EP管磁珠樣品中，然后輕輕混勻2分鐘，
[0048]8)待磁珠匯集于一側(cè)后，吸取一側(cè)清液(已經(jīng)含有IgG)到一新的EP管(已經(jīng)加入5ul Tris-HCl pH=8.0)；
[0049]9)非變性洗脫液IgG含量采用BCA試劑盒測(cè)定。
[0050]2.2Xcelligence實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)ant1-ENRA IgG對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖效應(yīng)
[0051]I)每孔加入90U1F-12K培養(yǎng)基，放入儀器卡座，檢測(cè)孔板與儀器接觸是否良好，
[0052]2)根據(jù)確定的細(xì)胞密度，每孔加入IOOul細(xì)胞懸液，
[0053]3)放入培養(yǎng)箱內(nèi)靜置半小時(shí)后，再放回儀器卡座，[0054]4)待24小時(shí)細(xì)胞全部貼壁后，更換無(wú)血清培養(yǎng)基讓細(xì)胞饑餓過(guò)夜，使得細(xì)胞同步化，
[0055]5)次日清晨加入20%胎牛血清刺激細(xì)胞6小時(shí)，各組相應(yīng)加入培養(yǎng)液，或內(nèi)皮素
0.25ug/ml和(或)抗內(nèi)皮素抗體0.02ug/ml。
[0056]6)儀器每15分鐘自動(dòng)掃描一次,96小時(shí)后讀取結(jié)果。
[0057]通過(guò)對(duì)檢測(cè)篩選到的SLE-PAH陽(yáng)性血清，通過(guò)IgG親和層析獲得ant1-ENRA IgG。體外實(shí)驗(yàn)顯示，ant1-ENRA抗體可刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖，并可增強(qiáng)內(nèi)皮素_1 (ET-1)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的增殖效應(yīng)(如圖4所示)。
[0058]實(shí)施例3
[0059]抗DT-56多肽抗體檢測(cè)的試劑盒制備
[0060]如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法
[0061]試劑盒制備所需的試劑
[0062]1.DT-56多肽，偶聯(lián)KLH后，以5ug/ml包被高親合力酶標(biāo)板；
[0063]2.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG工作液濃度為1:10000,12mL/瓶，I瓶。含有1%的小牛血清，0.1%的硫柳汞。
[0064]3.顯色液為四甲基乙二胺(TMB)溶液，IOmL/瓶。
[0065]4.洗滌液為 10XPBS-T，含有 0.1% 疊氮鈉(NaN3)，100mL。
[0066]5.終止液為2M的硫酸，IOmL/瓶。
[0067]6.包被緩沖液(PH9.60.05M 碳酸鹽緩沖液)，由 NaHC03 1.59 克，NaHC03 2.93克加蒸懼水至IOOOml ；
[0068]7.封閉液為0.5%牛血清白蛋白PBS溶液。
[0069]酶標(biāo)板制備
[0070]1.DT-56多肽由公司合成，并用戊二醛法絞連KLH，純度〉99%，
[0071]2.包被抗原濃度為5ug/mL的碳酸緩沖液，
[0072]3.抗原液IOOul每孔包被4度過(guò)夜，棄去包被液后，PBS-T洗滌三次；
[0073]4.37度烘干后，置于真空袋內(nèi)，4度長(zhǎng)期保存。
[0074]抗內(nèi)皮素抗體生物標(biāo)記物檢測(cè)
[0075]1.收集年齡、性別匹配的體檢健康正常人例，紅斑狼瘡患者和結(jié)締組織病合并肺動(dòng)脈高壓的患者，設(shè)定臨界值(平均值+3標(biāo)準(zhǔn)差)，即A值。
[0076]2.按實(shí)施例1步驟檢測(cè)抗DT-56抗CTD-PAH體。
[0077]計(jì)算陽(yáng)性率，患者檢測(cè)值(P)，除以陰性檢測(cè)值(N)，P/N>2.1為陽(yáng)性。
[0078]檢測(cè)結(jié)果分析
[0079]使用DT-56-KLH包被的間接ELISA檢測(cè)和使用ENDRA全長(zhǎng)重組蛋白包被的抗ENDRA抗體檢測(cè)方法檢測(cè)了患者和正常對(duì)照患者血清中的抗體，圖3結(jié)果顯示，抗DT-56抗體對(duì)結(jié)締組織病合并肺動(dòng)脈高壓的患者診斷的陽(yáng)性率為45.8%,特異性為87.5%。與以全長(zhǎng)內(nèi)皮素受體A包被的抗內(nèi)皮素抗體檢出率和特異性相似陽(yáng)性率40.8%,特異性96.3%。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)分析，圖5顯示ROC曲線(xiàn)比較無(wú)差異，p>0.05。說(shuō)明兩種檢測(cè)方法結(jié)果一致性高，抗DT-56抗體檢測(cè)法可以替代全長(zhǎng)ENDRA包被的間接ELISA法。
[0080]ant1-ENRA抗體存在于包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、混合性結(jié)締組織病、干燥綜合征、炎性肌病和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種結(jié)締組織病，并與CTD-PAH存在關(guān)聯(lián)，可能成為CTD-PAH (特別是SLE-PAH)的生物標(biāo)記物。ant1-ENRA作為可能具有致病功能的自身抗體，參與PAH的內(nèi)皮素受體通路活化和血管平滑肌細(xì)胞增殖。因此，對(duì)內(nèi)皮素受體拮抗劑的個(gè)體化應(yīng)用提供可能的臨床依據(jù)。具有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用推廣價(jià)值。
[0081]本專(zhuān)利覆蓋了上述表位肽段所包括的所有氨基酸序列，用于檢測(cè)ant1-ENRA抗體。本專(zhuān)利涉及該抗體檢測(cè)在所有CTD-PAH的應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1.一種基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于，通過(guò)體外合成4個(gè)長(zhǎng)度不一的胞外肽段，篩選到與全長(zhǎng)ENRA —致性良好的表位肽段，由人工合成該表位肽段作為抗原肽包板,建立基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，所述表位抗原肽為包含如下氨基酸序列的肽段:
DNPERYSTNLSNHVDDFTTFRGTELSFLVTTHQPTNLVLPSNGSMHNYCPQQTKIT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于，具體步驟如下: 1)、將5ug/ml的抗原肽在碳酸緩沖液中包被96孔板過(guò)夜后，PBS-T洗滌三次； 2)、3%的牛血清白蛋白或0.3%明膠和10%胎牛血清封閉2小時(shí)，PBS-T洗滌三次； 3)、患者血清1:100-1:300稀釋后，加入酶標(biāo)板室溫下反應(yīng)I小時(shí)，PBS-T洗滌三次； 4)、加入適當(dāng)比例稀釋的辣根過(guò)氧化物酶-抗人IgG二抗，室溫反應(yīng)I小時(shí)； 5)、加入TMB底物反應(yīng)10分鐘后，用2M硫酸終止反應(yīng)； 6)、酶標(biāo)儀吸光度450nM讀板測(cè)吸光度值。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于，所述表位抗原肽包括所有氨基酸序列，及其排列順序。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于，所述內(nèi)皮素受體A表位抗原多肽片段用于制備診斷和評(píng)估結(jié)締組織病合并肺動(dòng)脈高壓以及定性和定量檢測(cè)人血清中抗內(nèi)皮素受體A抗體的試劑和試劑盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于，該方法在CTD-PAH作為生物標(biāo)記物檢測(cè)的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于表位抗原肽的抗內(nèi)皮素受體A抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，其特征在于，其中CTD包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病、混合性結(jié)締組織病、炎癥性肌病、干燥綜合征、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性血管炎和抗磷脂抗體綜合癥。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103728454SQ201210381023
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月10日
【發(fā)明者】陳曉翔, 葉霜, 吳莊民, 張瑱 申請(qǐng)人:上海博戍生物科技有限公司