專利名稱：一種基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)小分子物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)小分子物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
目前市場(chǎng)上對(duì)小分子物質(zhì)如某些激素、毒品、藥物等檢測(cè)通用的免疫學(xué)檢測(cè)方法主要包括膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)法(Immunochromatographic Assay)、酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)、放身寸免疫分析法(Radioimmunoass ay, RIA)等。放射免疫分析法是最早建立的經(jīng)典的免疫分析方法，檢測(cè)的準(zhǔn)確度較高，最低檢測(cè)限可達(dá)10_3 10_6ug/ml，樣品用量少，且不需要作預(yù)處理。但由于放射免疫分析法投資成本較 高，耗材成本低，操作較為簡(jiǎn)單，但對(duì)操作人員有較大危害，對(duì)環(huán)境有污染，因此難以推廣應(yīng)用。膠體金法是臨床檢測(cè)產(chǎn)品的主要檢測(cè)方法，可以實(shí)現(xiàn)床邊快速檢測(cè)，方法操作簡(jiǎn)便，不需要專業(yè)人員即可完成。但由于該法只能定性或半定量，不能全定量檢測(cè)，所以只能用于急診檢測(cè)和初步篩查。酶聯(lián)免疫法可用于定量檢測(cè)，但是靈敏度較低，而且受人為因素影響大，操作復(fù)雜，需要專業(yè)人員并配合儀器操作。磁性復(fù)合微粒，又稱磁性微球或磁珠，是20世紀(jì)70年代末發(fā)展起來(lái)并被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的超順磁性納微米復(fù)合粒子，是由高分子或無(wú)機(jī)材料與磁性超細(xì)粉末(包括磁性金屬如Fe，Co，Ni或其金屬氧化物等)構(gòu)成的膠態(tài)復(fù)合物。在外加磁場(chǎng)作用下，磁性粒子的超順磁性可保證既能被快速分離，本身又不會(huì)被永久磁化。納微米級(jí)磁性復(fù)合微粒具有較高的比表面積，表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附能力。通過(guò)物理吸附，或利用修飾在磁性復(fù)合微粒表面的活性基團(tuán)可將酶、抗體、寡核昔酸及核酸等生物活性物質(zhì)偶聯(lián)在其表面。金磁微粒是一種新型磁性無(wú)機(jī)物復(fù)合微粒，由膠體金顆粒與磁性粒子復(fù)合形成的，這種材料兼有磁性粒子在外磁場(chǎng)中的可分離性以及膠體金對(duì)生物分子的快速固定化等特點(diǎn)，在生物與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。結(jié)合磁性納米粒子的超順磁性和金表面生物分子可修飾性的雙重特質(zhì)，發(fā)明人研制了 Fe304/Au磁性復(fù)合微粒，并將其實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)誕生于1977年。Halmann等根據(jù)放射免疫分析的基本原理，將高靈敏的化學(xué)發(fā)光技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合起來(lái)，建立了化學(xué)發(fā)光免疫分析法。該技術(shù)包含兩個(gè)系統(tǒng)，即免疫分析系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。因此，它兼具免疫分析高特異性及化學(xué)發(fā)光高靈敏度于一體的特點(diǎn)。免疫分析系統(tǒng)是應(yīng)用抗原、抗體間反應(yīng)的原理，通過(guò)將化學(xué)發(fā)光物或酶標(biāo)記于抗原或抗體上，經(jīng)過(guò)免疫反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)則是在免疫反應(yīng)結(jié)束后，加入酶的化學(xué)發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)在氧化劑作用下形成激發(fā)態(tài)的中間體，不穩(wěn)定的中間體在回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)，將發(fā)射出光子，此時(shí)可通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。該方法能夠進(jìn)行定性分析和定量分析，是一種綜合性技術(shù)?；诖判晕⒘５幕瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法是將磁分離技術(shù)、免疫分析技術(shù)及化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)三者有效結(jié)合在一起的新型的分析檢測(cè)技術(shù)，因而具有化學(xué)發(fā)光的高靈敏度、免疫分析的強(qiáng)特異性、磁分離系統(tǒng)的快速分離，此外，還具有檢測(cè)時(shí)間短、線性范圍寬、以及易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，因此，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、生物醫(yī)學(xué)、食品安全及毒品檢測(cè)等眾多方面。然而，傳統(tǒng)的磁性微粒大多是通過(guò)表面功能化修飾后帶有的的羧基(-COOH)、羥基(-0H)、氨基(-NH2)、醛基(-CHO)等活性基團(tuán)與抗原或抗體的共價(jià)作用將這些抗原抗體偶聯(lián)在磁珠表面的，偶聯(lián)過(guò)程復(fù)雜，而且在偶聯(lián)時(shí)容易導(dǎo)致抗原或抗體失活，不僅偶聯(lián)效率低，而且浪費(fèi)成本，由于這些原因，使得基于磁性微粒的化學(xué)發(fā)光的普及應(yīng)用受到一定的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)小分子物質(zhì)的方法，以解決背景技術(shù)檢測(cè)小分子物質(zhì)存在的局限性、特異性、靈敏性、危險(xiǎn)性等問(wèn)題。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明給出以下基本解決方案
一種基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)小分子物質(zhì)的方法，包括以下步驟⑴包被以金磁微粒作為免疫反應(yīng)和固相分離的載體，取與待檢小分子物質(zhì)相應(yīng)的小分子物質(zhì)合成抗原，將其偶聯(lián)在金磁微粒的表面；(2)封閉用封閉液封閉金磁微粒表面未與抗原結(jié)合的空白位點(diǎn)；然后磁性分離，棄上清，用清洗緩沖液清洗后懸于保存緩沖液中保存?zhèn)溆茫?3)與待測(cè)物反應(yīng)將待檢標(biāo)本、抗待檢小分子物質(zhì)的單抗、能與單抗發(fā)生特異性結(jié)合的酶標(biāo)二抗加入經(jīng)過(guò)步驟(2)封閉后的結(jié)合有小分子物質(zhì)合成抗原的金磁微粒中反應(yīng)，包被在金磁微粒表面的抗原與待檢標(biāo)本共同競(jìng)爭(zhēng)有限的抗體位點(diǎn)，形成特異性抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物；⑷清洗用清洗緩沖液清洗抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，磁性分離，棄上清；(5)檢測(cè)向經(jīng)過(guò)步驟(4)處理后形成的抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物中加入化學(xué)發(fā)光底物液，在化學(xué)發(fā)光底物液加入后的3 50分鐘內(nèi)測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度；發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣本的濃度成反比關(guān)系。為實(shí)現(xiàn)更好的檢測(cè)效果，步驟⑴具體可以包括以下步驟(I. I)預(yù)處理取金磁微粒,用偶聯(lián)緩沖液清洗I 3遍；(I. 2)偶聯(lián)將小分子物質(zhì)合成抗原與偶聯(lián)緩沖液混合，將所得混合液加入經(jīng)過(guò)預(yù)處理的金磁微粒中，置于搖床，在4 37°C，100 300rpm條件下充分反應(yīng)，反應(yīng)完后，置于磁性分離器上，磁性分離，棄上清；(I. 3)清洗用清洗緩沖液清洗2 5次，磁性分離，棄上清；步驟⑵中用封閉液進(jìn)行封閉的過(guò)程具體是在步驟⑴的產(chǎn)物中加入封閉液，置于搖床中，在4 37°C條件下，以100 300rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)I 2小時(shí)，封閉金磁微粒表面未與抗原結(jié)合的空白位點(diǎn)；步驟(3)反應(yīng)的條件為將待檢標(biāo)本、抗小分子物質(zhì)的單抗、酶標(biāo)二抗加入金磁微粒中，置于搖床，在4 37°C條件下，以100 300rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)O. 5 I小時(shí)。步驟(I. 2)偶聯(lián)緩沖液的較佳選擇為以下緩沖液中的任一種pH = 3. 6 5. 6，濃度為O. 005M IM的醋酸鹽緩沖液、pH = 5. O 8. 0，濃度為O. 5X IOX的磷酸鹽(PBS)緩沖液、pH = 7. O 9. 0，濃度為O. 005M IM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液、pH = 9. O 11，濃度為O. 005M IM的碳酸鹽(CBS)緩沖液、pH = 3. O 7. 0，濃度為(λ 005M IM的檸檬酸鹽緩沖液；相應(yīng)地，步驟(1.3)中采用的清洗緩沖液可以采用濃度為O. 005M IM的Tris-HCl緩沖液或摩爾濃度為O. 5X IOX的PBS緩沖液。上述步驟(I)中采用的小分子物質(zhì)合成抗原的載體蛋白一般可采用BSA、0VA、或HSA中的一種；為了有更好的封閉、清洗效果，步驟(2)中采用的封閉液為牛血清白蛋白、脫脂奶粉、明膠、賴氨酸或動(dòng)物血清之中的任一種或其中2 3種的混合物，該封閉液的質(zhì)量體積濃度(g/mL)為I 10%;所述動(dòng)物血清為小牛血清或山羊血清；步驟⑵中采用的清洗緩沖液選自以下緩沖液中的任一種或者還含O. 02 O. 2%吐溫的該種緩沖液pH = 7. O 9. 0，濃度為 O. 005M IM 的 Tris-HCl 緩沖液、pH = 5. O 8. 0，濃度為O. 5 X IOX的PBS緩沖液、 pH = 3. O 7. 0，濃度為O. 005M IM的檸檬酸鹽緩沖液、pH = 9. O 11，濃度為O. 005M IM的CBS緩沖液、pH = 3. 6 5. 6，濃度為O. 005M IM的醋酸鹽緩沖液、pH = 7. O 9. 0，濃度為 O. 005M IM 的 Tris-HCl 緩沖鹽溶液(TBS)；相應(yīng)的，步驟(2)中采用的保存緩沖液可以選自以下緩沖液中的任一種pH = 7. O 9. 0，濃度為 O. 005M IM 的 Tris-HCl 緩沖液、pH = 5. O 8. 0，濃度為O. 5 X IOX的PBS緩沖液、pH = 3. O 7. 0，濃度為O. 005M IM的檸檬酸鹽緩沖液、pH = 7. O 9. 0，濃度為 O. 005M IM 的 TBS 緩沖液、pH = 9. O 11，濃度為O. 005M IM的CBS緩沖液、pH = 3. 6 5. 6，濃度為(λ 005M IM的醋酸鹽緩沖液；步驟(3)中采用的酶標(biāo)二抗是堿性磷酸酶標(biāo)記或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔；步驟(4)中采用的清洗緩沖液是濃度為O. 005M IM的Tris-HCl緩沖液或濃度為O. 5X IOX的PBS緩沖液；步驟(5)中采用的化學(xué)發(fā)光底物是魯米諾、異魯米諾或1，2_ 二氧乙烷類衍生物。其中，1，2- 二氧乙烷類衍生物具體可以是金剛烷-1，2- 二氧乙烷、CSro或⑶P-STAR。上述步驟(2)清洗緩沖液采用還含吐溫O. 05%的緩沖液，則效果最佳。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
(I)本發(fā)明采用的金磁微粒，兼有磁性納米粒子的超順磁性及膠體金表面高效偶聯(lián)生物/藥物分子的性能。由于金磁微?？梢越柚砻娴撵o電作用、疏水作用及Au-SH作用等非共價(jià)鍵作用，物理性的吸附抗原或抗體等蛋白物質(zhì)，偶聯(lián)率高，偶聯(lián)效果穩(wěn)定、而且在偶聯(lián)過(guò)程中能夠保證抗原或抗體的活性不受影響，大大節(jié)約了包被時(shí)間，并簡(jiǎn)化了包被步驟。(2)本發(fā)明以金磁微粒為載體,結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng),建立了基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)小分子物質(zhì)的方法，由于金磁微粒對(duì)蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)具有的高吸附能力，加之其兼?zhèn)涿嘎?lián)免疫分析的高特異性、無(wú)污染的特點(diǎn)，還保留了化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度，彌補(bǔ)了它在特異性上的不足。該方法檢測(cè)靈敏度高、特異性好、線性范圍寬、精密度高、穩(wěn)定性好、無(wú)放射性污染，操作安全，方法簡(jiǎn)便快速。尤其在檢測(cè)靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度及精密度方面均比顯色法酶免檢測(cè)有顯著提高。


圖I是本發(fā)明所用的固相載體-金磁微粒的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2是本發(fā)明的方法中用金磁微粒包被小分子物質(zhì)合成抗原的操作示意圖；圖3是本發(fā)明的基于金磁微?；瘜W(xué)發(fā)光競(jìng)爭(zhēng)法原理示意圖；圖4是基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)嗎啡的劑量-反應(yīng)曲線；圖5是基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)睪酮的劑量-反應(yīng)曲線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案以具體實(shí)驗(yàn)操作的形式示例，其中的實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)定參數(shù)不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明基本技術(shù)方案的局限；本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠基于本發(fā)明的原理在合理的范圍內(nèi)確定實(shí)驗(yàn)條件和設(shè)定參數(shù)，仍可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的。實(shí)施例I :基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)定量檢測(cè)人血液或尿液中嗎啡的方法(I)包被(I. I)預(yù)處理取 5mg/mL 的金磁微粒 200u L，用 pH = 7. 4，濃度為 O. 02MTris_HCl偶聯(lián)緩沖液200u L清洗2次，平衡磁粒的pH。(I. 2)偶聯(lián)將嗎啡合成抗原溶解于200u L pH = 7. 4，濃度為O. 02MTris_HCl偶聯(lián)緩沖液中，混勻后加入預(yù)處理過(guò)的金磁微粒中，于37°C，180rpm，搖床中反應(yīng)20min。反應(yīng)完畢后取出，磁性分離，棄上清。(I. 3)清洗加入400u L濃度為O. 02M Tris-HCl清洗緩沖液，磁性分離，棄上清。(2)封閉向金磁微粒中加入ImL含5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖液中，于37°C，180rpm，搖床中反應(yīng)I小時(shí)，磁性分離，棄上清。用ImL pH = 7. 4，濃度為O. 02M Tris-HCl緩沖液清洗4次，磁粒懸于ImL pH = 7. 4，濃度為IXPBS的保存緩沖液中，4°C備用。(3)與待測(cè)物結(jié)合取出包被后的金磁微粒，于室溫下平衡10分鐘，依次加入包被有嗎啡抗原的金磁微粒30uL、待測(cè)樣本或標(biāo)準(zhǔn)品(0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)各 50uL、抗嗎啡單抗 50uL 和 HRP 標(biāo)記羊抗鼠50uL,置搖床中反應(yīng)lh，形成特異性抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物；(4)清洗取出離心管置于磁性分離器上，棄上清，用添加O. 05%吐溫20，pH =7. 4，濃度為IXPBS的清洗緩沖液清洗5次，磁性分離，棄上清；(5)檢測(cè)將經(jīng)過(guò)步驟(4)處理后形成的抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物的金磁微粒轉(zhuǎn)入96孔板，并向其加入發(fā)光底物魯米諾溶液lOOuL，于加入后的3 50min內(nèi)檢測(cè)各孔的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)，其發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣本濃度關(guān)系如圖四所示，在5ng/ml 1000ng/ml范圍內(nèi)線性較好，最低檢出限可達(dá)
實(shí)施例2基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)定量檢測(cè)人血清中睪酮的方法除了以睪酮合成抗原包被金磁微粒、抗睪酮多克隆抗體檢測(cè)，堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔抗體，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)采用的是1，2_ 二氧乙烷類衍生物如3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4- (3-磷氧酰)-苯基-I，2- 二氧環(huán)乙烷(AMPPD)，以及建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)采用的睪酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度不同外，其他具體步驟同實(shí)施例I。結(jié)論圖4是基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)嗎啡的劑量-反應(yīng)曲線，在5ng/ml 1000ng/ml 線性良好，IC50 為 59. 8ng/ml，最低檢測(cè)線達(dá) O. 46ng/ml。圖5是基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)睪酮的劑量-反應(yīng)曲線，在O. lng/ml 20ng/ml的范圍內(nèi)線性良好,最低檢出限達(dá)O. 05ng/ml。
權(quán)利要求
1.一種基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)小分子物質(zhì)的方法，包括以下步驟 (1)包被 以金磁微粒作為免疫反應(yīng)和固相分離的載體，取與待檢小分子物質(zhì)相應(yīng)的小分子物質(zhì)合成抗原，將其偶聯(lián)在金磁微粒的表面； (2)封閉 用封閉液封閉金磁微粒表面未與抗原結(jié)合的空白位點(diǎn)；然后磁性分離，棄上清，用清洗緩沖液清洗后懸于保存緩沖液中保存?zhèn)溆茫? (3)與待測(cè)物反應(yīng) 將待檢標(biāo)本、抗待檢小分子物質(zhì)的單抗、能與單抗發(fā)生特異性結(jié)合的酶標(biāo)ニ抗加入經(jīng) 過(guò)步驟(2)封閉后的結(jié)合有小分子物質(zhì)合成抗原的金磁微粒中反應(yīng)，包被在金磁微粒表面的抗原與待檢標(biāo)本共同競(jìng)爭(zhēng)有限的抗體位點(diǎn)，形成特異性抗原-抗體-酶標(biāo)ニ抗復(fù)合物； (4)清洗 用清洗緩沖液清洗抗原-抗體-酶標(biāo)ニ抗復(fù)合物，磁性分離，棄上清； (5)檢測(cè) 向經(jīng)過(guò)步驟(4)處理后形成的抗原-抗體-酶標(biāo)ニ抗復(fù)合物中加入化學(xué)發(fā)光底物液，在化學(xué)發(fā)光底物液加入后的3 50分鐘內(nèi)測(cè)量各孔的發(fā)光強(qiáng)度；發(fā)光強(qiáng)度與待測(cè)樣本的濃度成反比關(guān)系。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)小分子物質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(I)具體包括以下步驟 (I. D預(yù)處理取金磁微粒，用偶聯(lián)緩沖液清洗I 3遍； (I. 2)偶聯(lián)將小分子物質(zhì)合成抗原與偶聯(lián)緩沖液混合，將所得混合液加入經(jīng)過(guò)預(yù)處理的金磁微粒中，置于搖床，在4 37°C，100 300rpm條件下充分反應(yīng)，反應(yīng)完后，置于磁性分離器上，磁性分離，棄上清； (I. 3)清洗用清洗緩沖液清洗2 5次，磁性分離，棄上清； 步驟(2)中用封閉液進(jìn)行封閉的過(guò)程具體是在步驟(I)的產(chǎn)物中加入封閉液，置于搖床中，在4 37°C條件下，以100 300rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)I 2小時(shí)，封閉金磁微粒表面未與抗原結(jié)合的空白位點(diǎn)； 步驟(3)反應(yīng)的條件為將待檢標(biāo)本、抗小分子物質(zhì)的單抗、酶標(biāo)ニ抗加入金磁微粒中，置于搖床，在4 37°C條件下，以100 300rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)0. 5 I小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)小分子物質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(1.2)偶聯(lián)緩沖液選自以下緩沖液中的任ー種 pH = 3. 6 5. 6，濃度為0. 005M IM的醋酸鹽緩沖液、 pH = 5. 0 8. 0，濃度為0. 5X IOX的磷酸鹽(PBS)緩沖液、 pH = 7. 0 9. 0，濃度為0. 005M IM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液、 pH = 9. 0 11，濃度為0. 005M IM的碳酸鹽(CBS)緩沖液、 pH = 3. 0 7. 0，濃度為0. 005M IM的檸檬酸鹽緩沖液； 步驟(I. 3)中采用的清洗緩沖液是濃度為0. 005M IM的Tris-HCl緩沖液或摩爾濃度為0. 5X IOX的PBS緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)小分子物質(zhì)的方法，其特征在于 步驟(I)中采用的小分子物質(zhì)合成抗原的載體蛋白為BSA、OVA、或HSA中的ー種；步驟(2)中采用的封閉液為牛血清白蛋白、脫脂奶粉、明膠、賴氨酸或動(dòng)物血清之中的任一種或其中2 3種的混合物，該封閉液的質(zhì)量體積濃度(g/mL)為I 10% ;所述動(dòng)物血清為小牛血清或山羊血清； 步驟(2)中采用的清洗緩沖液選自以下緩沖液中的任ー種或者還含0. 02 0. 2%吐溫的該種緩沖液 pH = 7. 0 9. 0，濃度為0. 005M IM的Tris-HCl緩沖液、 pH = 5. 0 8. 0，濃度為0. 5X IOX的PBS緩沖液、 pH = 3. 0 7. 0，濃度為0. 005M IM的檸檬酸鹽緩沖液、 pH = 9. 0 11，濃度為0. 005M IM的CBS緩沖液、 pH = 3. 6 5. 6，濃度為0. 005M IM的醋酸鹽緩沖液、 pH = 7. 0 9. 0，濃度為0. 005M IM的Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBS)； 步驟(2)中采用的保存緩沖液選自以下緩沖液中的任ー種 pH = 7. 0 9. 0，濃度為0. 005M IM的Tris-HCl緩沖液、 pH = 5. 0 8. 0，濃度為0. 5X IOX的PBS緩沖液、 pH = 3. 0 7. 0，濃度為0. 005M IM的檸檬酸鹽緩沖液、 pH = 7. 0 9. 0，濃度為0. 005M IM的TBS緩沖液、 pH = 9. 0 11，濃度為0. 005M IM的CBS緩沖液、 pH = 3. 6 5. 6，濃度為0. 005M IM的醋酸鹽緩沖液； 步驟(3)中采用的酶標(biāo)ニ抗是堿性磷酸酶標(biāo)記或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔； 步驟(4)中采用的清洗緩沖液是濃度為0. 005M IM的Tris-HCl緩沖液或濃度為0.5 X IOX的PBS緩沖液； 步驟(5)中采用的化學(xué)發(fā)光底物是魯米諾、異魯米諾或1，2_ ニ氧こ烷類衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)小分子物質(zhì)的方法，其特征在于所述步驟(2)清洗緩沖液中含吐溫0. 05%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)小分子物質(zhì)的方法，其特征在于所述1，2_ ニ氧こ烷類衍生物是金剛烷-1，2- ニ氧こ烷、CSPD或CDP-STAR。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于金磁微粒的化學(xué)發(fā)光免疫學(xué)檢測(cè)小分子物質(zhì)的方法，主要包括以下步驟(1)包被，即以金磁微粒作為免疫反應(yīng)和固相分離的載體，取與待檢小分子物質(zhì)相應(yīng)的小分子物質(zhì)合成抗原，將其偶聯(lián)在金磁微粒的表面；(2)封閉，即用封閉液封閉金磁微粒表面未與抗原結(jié)合的空白位點(diǎn)；然后磁性分離，棄上清；(3)與待測(cè)物反應(yīng)，即將待檢標(biāo)本、抗待檢小分子物質(zhì)的單抗、能與單抗發(fā)生特異性結(jié)合的酶標(biāo)二抗加入結(jié)合有小分子物質(zhì)合成抗原的金磁微粒中反應(yīng)，形成特異性抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物；(4)清洗；(5)檢測(cè)。本發(fā)明的方法檢測(cè)靈敏度高、特異性好、線性范圍寬、精密度高、穩(wěn)定性好、無(wú)放射性污染，操作安全，方法簡(jiǎn)便快速。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102735842SQ201210171168
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者崔亞麗, 張秦魯, 杜海平, 馬樂(lè) 申請(qǐng)人:西安金磁納米生物技術(shù)有限公司