專(zhuān)利名稱(chēng)：測(cè)定凝固抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于凝固診斷學(xué)領(lǐng)域，并涉及在樣品中測(cè)定蛋白水解活性凝固因子的抑制劑(抗凝劑，anticoagulant)，特別是直接的凝血酶和因子敘抑制劑的均相法，還涉及在這樣的方法中使用的檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
一般的抗凝劑治療主要目的是抑制前凝固因子凝血酶(因子IIa、FIIa)和因子fe (F Xa)。例如使用維生素K拮抗劑(例如香豆素)作用于抑制凝固因子合成的口服抗凝和由于在血流中抑制活性凝固因子而引起的抗凝之間存在區(qū)別。在抑制或失活血流中的活性凝固因子的抗凝劑中，分為直接作用的抗凝劑和間接作用的抗凝劑。直接作用的抗凝劑例如利伐沙班、達(dá)比加群或美拉加群結(jié)合凝血酶或因子fe，并因此是高度特異的。間接作用的抗凝劑例如肝素結(jié)合內(nèi)源凝固因子抑制劑例如抗凝血酶，并多次放大其抗凝作用。通過(guò)特定的失活模式區(qū)分所有抑制血流中的活性凝固因子的抗凝劑。某些類(lèi)型的物質(zhì)，例如未分離的高分子量肝素，抑制凝血酶和因子)(a 二者。其他物質(zhì)高度特異地發(fā)揮作用，因此抑制凝血酶(例如水蛭素、達(dá)比加群、美拉加群)或抑制因子fe (例如五糖，如磺達(dá)肝癸鈉、利伐沙班)。血液凝固系統(tǒng)的主要前凝固因子(因子和凝血酶)的直接或間接抑制劑在治療和預(yù)防心血管和血栓栓塞疾病中發(fā)揮了日益重要的作用。通過(guò)目前建立的測(cè)定僅可以非常復(fù)雜的方式檢測(cè)這些抑制劑。用于所述物質(zhì)的簡(jiǎn)單和靈敏的測(cè)定對(duì)治療監(jiān)控和在未知患者樣品中檢測(cè)所述物質(zhì)的存在是很重要的。這些測(cè)定應(yīng)當(dāng)能夠以高度靈敏的方式檢測(cè)相對(duì)大量的結(jié)構(gòu)上不相關(guān)的凝血酶或F敘抑制劑。目前用于測(cè)定抗凝劑的顯色測(cè)定包括將通常由血漿組成的待分析的患者樣品與凝固因子的底物混合。由于大多數(shù)血液凝固因子是絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶，即可切割肽鍵的水解酶，主要利用被待測(cè)的血液凝固因子盡可能地特異性切割的肽底物，且其具有可檢測(cè)的信號(hào)基團(tuán)。已建立的且也可商業(yè)獲得的顯色測(cè)定特別利用發(fā)色團(tuán)對(duì)硝基苯胺(PNA)和5-氨基-2-硝基苯甲酸(ANBA)，其具有在405 nm處的吸收峰。通常通過(guò)光度測(cè)定儀來(lái)測(cè)定生成的黃色。在抗凝劑的測(cè)定中，測(cè)定混合物中的顏色濃度與樣品中的抗凝劑濃度成反比。在第一類(lèi)目前應(yīng)用的用于測(cè)定抑制血液凝固因子活性的抗凝劑的顯色測(cè)定中，待測(cè)患者樣品通常與確定量的活化凝固因子混合以及與此凝固因子的底物混合。在樣品中存在的抗凝劑越多，發(fā)生的對(duì)活化的凝固因子的抑制作用越強(qiáng)，和被切割的底物越少?；诖藴y(cè)定原理的可商業(yè)獲得的測(cè)定的實(shí)例是Siemens Healthcare Diagnostics的Berichrom 肝素測(cè)定，其基于對(duì)添加的因子)(a的抑制作用而用于測(cè)定肝素；或Siemens Healthcare Diagnostics的水蛭素活性測(cè)定，其基于對(duì)添加的凝血酶的抑制作用而用于測(cè)定水蛭素 (hirudin)o在第二類(lèi)目前應(yīng)用的用于測(cè)定抗凝劑的顯色測(cè)定中，待測(cè)患者樣品與失活的凝固因子、凝固活化劑混合以及與凝固因子的顯色底物混合。凝固活化劑的加入在一開(kāi)始活化
5加入的失活的凝固因子。在樣品中存在的抗凝劑越多，發(fā)生的對(duì)活化的凝固因子的抑制作用越強(qiáng)，和被切割的底物越少?；诖藴y(cè)定原理的可商業(yè)獲得的測(cè)定的實(shí)例是用于測(cè)定合成的直接的凝血酶抑制劑的來(lái)自JenAffin的Haemosyf-ECA T測(cè)定，或用于測(cè)定水蛭素的來(lái)自JenAffin的Haemosys^ECA H，后者是基于由于加入凝血酶原和作為凝固活化劑的蛇靜脈酶(ecarin)而在樣品中形成的對(duì)凝血酶/meizothrombin的抑制作用。EP-A1-2 177 625描述了另一種測(cè)定抗凝劑的測(cè)定原理。此測(cè)定原理類(lèi)似地包含測(cè)定凝固因子特異性底物的切割，但借助于不同類(lèi)型的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)，而不是借助于顯色底物。所述系統(tǒng)包含2種成分，當(dāng)與完整的底物同時(shí)結(jié)合時(shí)，2種成分由于在空間上極為接近而相互作用并產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，例如熒光或化學(xué)發(fā)光。作為底物肽鍵切割的結(jié)果，2種成分彼此分離，并因此不產(chǎn)生信號(hào)。在樣品中存在的抗凝劑越多，發(fā)生對(duì)活化的凝固因子的抑制作用越強(qiáng)，被切割的底物越少和產(chǎn)生的信號(hào)越多?；跓晒饣蚧瘜W(xué)發(fā)光的測(cè)定相比顯色測(cè)定的優(yōu)勢(shì)基本上在于，它們更靈敏和還允許在全血中測(cè)量。在上述方法中可切割的底物在一定程度上“安裝”在信號(hào)系統(tǒng)的2種成分之間，此方法的缺點(diǎn)在于在切割位點(diǎn)兩側(cè)的底物配體必須具有與信號(hào)成分結(jié)合的區(qū)域。底物配體通常是合成的低分子量肽底物，其具有2個(gè)與信號(hào)成分結(jié)合的人工殘基，例如氨基端的Flag 標(biāo)簽和羧基端的生物素殘基。然而，這些殘基與低分子量肽底物的結(jié)合始終具有這樣的風(fēng)險(xiǎn)，即以使其不再結(jié)合或不再被待檢測(cè)的酶切割的方式改變肽的結(jié)構(gòu)，因此提供合適的底物配體在技術(shù)上是復(fù)雜的。因此，希望以這樣的方式修改已知的測(cè)定抗凝劑的方法(所述方法使用由于在空間上極為接近而相互作用并產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)的2種成分)，即可使用下述低分子量配體， 其需要具有不超過(guò)1個(gè)用于結(jié)合任何信號(hào)成分的人工殘基。通過(guò)下述方法實(shí)現(xiàn)了此目的將等分試樣的疑為包含抗凝劑的樣品與確定量的蛋白水解活性凝固因子混合以及與配體混合，所述配體與蛋白水解活性凝固因子的活性位點(diǎn)結(jié)合但不因此在肽鍵處被切割，并測(cè)量由配體與活化的凝固因子結(jié)合引起的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生的信號(hào)。在樣品中存在的活化的凝固因子的抑制劑，即抗凝劑以濃度依賴(lài)的方式與配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合蛋白水解活性凝固因子的活性位點(diǎn)并因此抑制信號(hào)產(chǎn)生。在樣品中存在的抗凝劑越多，產(chǎn)生的信號(hào)越少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明因此涉及在樣品中測(cè)定蛋白水解活性凝固因子的抑制劑，即抗凝劑的方法，其包括以下步驟
a)提供和孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含
i.等分試樣的樣品，
.確定量的蛋白水解活性凝固因子，
iii.至少一種配體，所述配體與蛋白水解活性凝固因子的活性位點(diǎn)結(jié)合但不被后者在肽鍵處切割，
iv.信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第一和第二成分，二者以這樣的方式共同作用，即當(dāng)所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第一和第二成分變得彼此極為接近時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，且其中蛋白水解活性凝固因子與信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第一成分結(jié)合，或在孵育期間與其結(jié)合，且其中配體與信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第二成分結(jié)合，或在孵育期間與其結(jié)合；
b)測(cè)量信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的信號(hào)，其中所述信號(hào)幅度(amplitude)與樣品中的抗凝劑濃度成反比。在本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語(yǔ)“抗凝劑”指蛋白水解活性凝固因子的抑制劑，其為天然或合成來(lái)源的，且其預(yù)期用途是在人或動(dòng)物中抑制體內(nèi)的凝血系統(tǒng)。其也包括在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)上結(jié)合酶的高分子量物質(zhì)例如水蛭素或肝素，以及僅結(jié)合酶的活性位點(diǎn)就足以抑制反應(yīng)性的低分子量化合物例如利伐沙班、達(dá)比加群或美拉加群。用于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ) “抗凝劑”和“蛋白水解活性凝固因子的抑制劑”是同義地使用的。在本發(fā)明上下文中術(shù)語(yǔ)“配體”指這樣的物質(zhì)，其與蛋白水解活性凝固因子的活性位點(diǎn)結(jié)合并因此與抑制劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)。然而，合適的配體不被蛋白水解活性凝固因子在肽鍵處切割，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈杀凰龅鞍姿饣钚阅桃蜃忧懈畹碾逆I，即它們不含有任意可被蛋白水解活性凝固因子水解的肽鍵(R-CONH-R，R =氨基酸殘基)?？赡婧筒豢赡娼Y(jié)合的配體都是合適的。配體可為合成、重組或通過(guò)生物技術(shù)產(chǎn)生的分子或天然存在的分子。配體可為肽衍生物，其序列來(lái)源于酶的天然底物的序列。用于本發(fā)明的目的的肽衍生配體與肽底物的區(qū)別在于，肽衍生配體不被蛋白水解活性凝固因子水解切割，而肽底物的切割產(chǎn)生從酶的活性位點(diǎn)釋放的片段，且從反應(yīng)中再次出現(xiàn)的酶沒(méi)有變化。合適的肽衍生物優(yōu)選地包含從3至約150個(gè)氨基酸殘基。為了能夠避免蛋白水解活性凝固因子在肽鍵處切割本發(fā)明的肽衍生物，后者的羧基端羧基優(yōu)選地被置換為來(lái)自醛(-CH0)，酮(-C0R; R =烷基或芳基)，三氟甲基酮(-COCF3), α -酮羧酸(-C0C00H)， α-酮酰胺(-C0C0NHR; R =烷基或芳基)，和α-酮酯(-C0C00R; R =烷基或芳基)，酯 (-C00R; R =烷基或芳基)，硼酸(-B(OR)2),氯甲基酮(-COCH2Cl)和磺酰氟(-SO2F)的官能團(tuán)。肽衍生物可還具有結(jié)構(gòu)修飾，例如部分使用D-氨基酸代替天然存在的L-氨基酸。表1包含了用于可逆和不可逆結(jié)合的肽衍生配體的一般官能團(tuán)的實(shí)例。表 權(quán)利要求
1.一種在樣品中測(cè)定蛋白水解活性凝固因子的抑制劑的方法，所述方法包括以下步驟a)提供和孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含1.等分試樣的樣品， .確定量的蛋白水解活性凝固因子，iii.至少一種配體，所述配體與蛋白水解活性凝固因子的活性位點(diǎn)結(jié)合但不被后者在肽鍵處切割，iv.信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第一和第二成分，二者以這樣的方式共同作用，即當(dāng)所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第一和第二成分變得彼此極為接近時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，且其中蛋白水解活性凝固因子與信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第一成分結(jié)合，或在孵育期間與其結(jié)合，且其中配體與信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第二成分結(jié)合，或在孵育期間與其結(jié)合；b)測(cè)量信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的信號(hào)，其中所述信號(hào)幅度與樣品中的抑制劑濃度成反比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中與蛋白水解活性凝固因子的活性位點(diǎn)結(jié)合的所述配體具有Ki=10_13- 10_4 M的與蛋白水解活性凝固因子的結(jié)合親和力。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)的方法，其中所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第一和第二成分各個(gè)包含微粒狀固相，且其中測(cè)量在所述反應(yīng)混合物中的所述微粒狀固相的聚集。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)的方法，其中所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第一成分是化學(xué)發(fā)光劑，且所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第二成分是光敏劑，反之亦然，且其中測(cè)量在所述反應(yīng)混合物中的化學(xué)發(fā)光。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述化學(xué)發(fā)光劑與第一微粒狀固相結(jié)合和/或所述光敏劑與第二微粒狀固相結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述配體具有第一結(jié)合對(duì)A/B的第一結(jié)合配偶體A，且其中所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第二成分具有所述第一結(jié)合對(duì)A/B的第二結(jié)合配偶體B，且其中所述配體由于所述結(jié)合配偶體A和B的結(jié)合與所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第二成分結(jié)合，或在孵育期間與其結(jié)合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述配體是肽衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述配體是肽衍生物，所述肽衍生物具有選自醛、酮、三氟甲基酮、α-酮羧酸、α-酮酰胺、α-酮酯、酯、硼酸、氯甲基酮和磺酰氟的羧基端基團(tuán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中選擇所述結(jié)合配偶體A和B使其形成選自FLAG標(biāo)簽/ 抗FLAG標(biāo)簽抗體，HIS標(biāo)簽/抗HIS標(biāo)簽抗體，熒光素/抗熒光素抗體，生物素/抗生物素和生物素/鏈霉抗生物素的結(jié)合對(duì)A/B。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白水解活性凝固因子具有第二結(jié)合對(duì)χ/γ的第一結(jié)合配偶體X，且其中所述第二結(jié)合對(duì)χ/γ的第二結(jié)合配偶體Y與所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第一成分結(jié)合，且其中所述蛋白水解活性凝固因子由于所述結(jié)合配偶體 X和Y的結(jié)合與所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第一成分結(jié)合，或在孵育期間與其結(jié)合。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的用于測(cè)定凝血酶抑制劑的方法，其中提供和孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含確定量的蛋白水解活性凝固因子凝血酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中提供和孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含與凝血酶的活性位點(diǎn)可逆結(jié)合但不因此被切割的肽生物素基-Ttds-D-Phe-Pro-Arg-H。
13.根據(jù)權(quán)利要求11和12中任一項(xiàng)的用于測(cè)量凝血酶抑制劑的方法，所述凝血酶抑制劑選自肝素、肝素衍生物、比伐盧定、水蛭素、達(dá)比加群、阿加曲班、美拉加群、希美加群、來(lái)匹盧定、MCC-977、SSR-182289、TGN-255、TGN-167、ARC-183 和 odiparcil。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的用于測(cè)定因子敘抑制劑的方法，其中提供和孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含確定量的蛋白水解活性凝固因子因子似。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的用于測(cè)定因子敘抑制劑的方法，所述因子敘抑制劑來(lái)自肝素、 肝素衍生物例如磺達(dá)肝癸鈉、利伐沙班、阿哌沙班、奧米沙班、LY 517717,YM 153、DU-176b、 DX-9065a和 KFA-1982。
16.根據(jù)權(quán)利要求14和15中任一項(xiàng)的方法，其中提供和孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含與因子fe的活性位點(diǎn)可逆結(jié)合但不因此被切割的肽生物素基-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H0
17.—種實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法的檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒包含以下單獨(dú)的成分i.第一試劑，其包含確定量的蛋白水解活性凝固因子， .第二試劑，其包含至少一種與所述蛋白水解活性凝固因子的活性位點(diǎn)結(jié)合但不被后者在肽鍵處切割的配體；iii.第三試劑，其包含信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第一成分，所述成分可與第一試劑中的蛋白水解活性凝固因子結(jié)合；和iv.第四試劑，其包含信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第二成分，所述成分可與第二試劑中的配體結(jié)合；其中所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第一和第二成分以這樣的方式共同作用，即當(dāng)所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第一和第二成分變得彼此極為接近時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
18.—種實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法的檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒包含以下單獨(dú)的成分i.第一試劑，其包含確定量的蛋白水解活性凝固因子，其中所述蛋白水解活性凝固因子與信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第一成分結(jié)合； .第二試劑，其包含至少一種與所述蛋白水解活性凝固因子的活性位點(diǎn)結(jié)合但不被后者在肽鍵處切割的配體；和iii.第三試劑，其包含所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第二成分，所述第二成分可與所述第二試劑中的所述配體結(jié)合；其中所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第一和第二成分以這樣的方式共同作用，即當(dāng)所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第一和第二成分變得彼此極為接近時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
19.一種實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法的檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒包含以下單獨(dú)的成分i.第一試劑，其包含確定量的蛋白水解活性凝固因子， .第二試劑，其包含信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第一成分，所述第一成分可與所述第一試劑中的所述蛋白水解活性凝固因子結(jié)合；和iii.第三試劑，其包含至少一種與所述蛋白水解活性凝固因子的活性位點(diǎn)結(jié)合但不被后者在肽鍵處切割的配體，且其中所述配體與所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第二成分結(jié)合；其中所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第一和第二成分以這樣的方式共同作用，即當(dāng)所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第一和第二成分變得彼此極為接近時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
20. 一種實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法的檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒包含以下單獨(dú)的成分i.第一試劑，其包含確定量的蛋白水解活性凝固因子，其中所述蛋白水解活性凝固因子與信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第一成分結(jié)合； .第二試劑，其包含至少一種與所述蛋白水解活性凝固因子的活性位點(diǎn)結(jié)合但不被后者在肽鍵處切割的配體，且其中所述配體與所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的第二成分結(jié)合；其中所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第一和第二成分以這樣的方式共同作用，即當(dāng)所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的所述第一和第二成分變得彼此極為接近時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
全文摘要
本發(fā)明屬于凝固診斷學(xué)領(lǐng)域，并涉及在樣品中測(cè)定蛋白水解活性凝固因子的抑制劑(抗凝劑)，特別是直接的凝血酶和因子X(jué)a抑制劑的均相法，并也涉及在這樣的方法中使用的檢測(cè)試劑盒。使用與蛋白水解活性凝固因子結(jié)合但不被后者切割且與待測(cè)抗凝劑競(jìng)爭(zhēng)的配體。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102590490SQ20111045428
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者A.卡佩爾, A.雷希納, S.斯蒂芬, T.維塞爾 申請(qǐng)人:西門(mén)子醫(yī)療診斷產(chǎn)品有限責(zé)任公司