專利名稱：磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。 技術背景
磺胺二甲嘧啶(Sy lfamethazine SM2 )，作為磺胺類藥物的一種，其性質(zhì)穩(wěn)定、 抑菌譜廣、毒性小、口服易吸收且價格低廉，是畜牧業(yè)上應用最廣泛、應用量最大的藥物之一。但是由于它在體內(nèi)的作用時間和代謝時間較長，易殘留在動物體內(nèi)，通過任何途徑都可能在人體中蓄積。藥物蓄積濃度超過一定值對人體機能是有害的，長期蓄積則會導致磺胺藥抗藥性的產(chǎn)生，造成耐藥菌的流行性感染，且有潛在的致癌性。因此，歐盟對牛奶和肉類食品中的磺胺類藥物制定了最高允許值，即磺胺類藥物總量不得超過IOOyg/ kg，單個磺胺類藥物的濃度不得超過25 μ g/ kg。2002年12月我國農(nóng)業(yè)部公告第235號文件規(guī)定在所有食品動物的肌肉、脂肪、肝和腎中磺胺類最高殘留限量100 μ g/kg，并將磺胺二甲嘧啶列作為重點監(jiān)控的對象。
目前，檢測SM2的方法有微生物法，物理化學法，如高壓液相色譜(HPLC)、氣-液色譜(GLC)、質(zhì)譜(MQ、薄層色譜法(TLC)等，微生物法檢測速度較快，但對磺胺藥缺乏靈敏性和特異性，物理化學法則存在前處理繁瑣，需要昂貴儀器及其專業(yè)操作等特點，檢測大批樣本較為困難，不利于大范圍的推廣應用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種操作簡便、快速、適合大批量樣品初篩的磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
本發(fā)明解決上述技術問題采取的技術方案一種磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，有一盒體，所述盒體中包括 (1)包被有磺胺二甲嘧啶抗原的酶標板；(2)磺胺二甲嘧啶特異性抗體；(3)酶標記物；(4)磺胺二甲嘧啶標準品溶液；(5)A底物顯色液和B底物顯色液；(6)終止液;(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復溶液；(9)濃縮提取液。
所述磺胺二甲嘧啶抗原由磺胺二甲嘧啶半抗原和載體蛋白通過重氮化法偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清蛋白或鼠血清蛋白。
所述磺胺二甲嘧啶特異性抗體為由所述磺胺二甲嘧啶抗原按常規(guī)的免疫方法制備得到單克隆抗體或多克隆抗體，其工作液為PH7. 4的含有0. 1-5% (w/w)脫脂奶粉的磷酸3緩沖液，磺胺二甲嘧啶特異性抗體與上述工作液的比為1:2000 (w/w)0
所述酶標記物為酶標記的抗鼠或抗兔的抗抗體，其工作液為pH7. 4的含有0. 1-5% 脫脂奶粉的磷酸緩沖液，酶標記物與上述工作液的比為l:4000(w/w)，標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
所述磺胺二甲嘧啶標準品溶液濃度分別為0yg/L、0.5 yg/LU.5 μ g/L、4. 5 μ g/L>13. 5 μ g/L>40. 5 μ g/L。
所述A底物為0. 06% (w/w)的過氧化氫，B底物為0. 4% (w/w)四甲基聯(lián)苯胺。
所述濃縮提取液為NaOH濃度為0. 1M，pHIO的磷酸緩沖液，所述濃縮復溶液為含 0. 1%-0. 6% (w/w)DMSO的磷酸鹽緩沖液，所述濃縮洗滌液為0. 9% (w/w)的NaCl溶液，所述終止液為2N的硫酸溶液。
本發(fā)明磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的有益效果是本發(fā)明的檢測磺胺二甲嘧啶殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒采用的是直接競爭ELISA法，克服了其他試劑盒操作時間長、 前處理復雜的問題，整個操作過程只需30min，前處理無需配備特殊的儀器，操作簡單、快速，適合現(xiàn)場大批量篩查，且試劑盒各試劑均是工作液形式，操作簡單易行。


圖1為磺胺二甲嘧啶標準曲線圖。
具體實施方式
一種磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，有一盒體，所述盒體中包括(1)包被有磺胺二甲嘧啶抗原的酶標板；(2)磺胺二甲嘧啶特異性抗體；(3)酶標記物；(4)磺胺二甲嘧啶標準品溶液；(5)A底物顯色液和B底物顯色液；(6)終止液;(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復溶液；(9)濃縮提取液。
一、本發(fā)明試劑盒的制備過程如下1、制備包被有磺胺二甲嘧啶包被原的酶標板用PH9. 6的碳酸鹽緩沖液將磺胺二甲嘧啶包被原稀釋成0. 25mg/ml, 100 μ 1/孔加入到酶標板孔上，其中磺胺二甲嘧啶包被原優(yōu)選卵清蛋白作為載體蛋白；4°C過夜或37°C孵育池，洗滌4-5次，拍干；加入含有10%小牛血清的封閉液，200 μ 1/孔，37°C孵育池；室溫在真空干燥箱中抽干5h，用鋁箔袋真空塑封。
2、抗原的制備 (1)免疫抗原的制備稱取55. 6mg的SM2溶于1 ml lmol/L的HCl中，作為I液，并保持在4°C ； (2)稱取 15mg亞硝酸鈉溶于Iml蒸餾水中，緩慢滴加入A液，邊滴加邊攪拌，保持pH值低于3 ； (3)反應結(jié)束后用氨基磺酸消耗過量的亞硝酸，用淀粉碘化鉀試紙檢測，直至滲圈從深藍色變成淺黃色為止，作為B液；(4)稱取50mgBSA溶于^iil lmol/L pH9. 6碳酸鈉緩沖液中，即配成 C液；(5)在4°C放置Ih后，將經(jīng)過活化得到的B液逐滴加入C液中，反應過程中保持pH9， 在4°C攪拌反應Mi ； (6)用0. 01mol/L的PBS透析3天，每天換液2次，即制備得SM2-BSA。
(2)檢測抗原的制備同免疫抗原的制備。
3、磺胺二甲嘧啶單克隆抗體的制備動物免疫載體蛋白為牛血清白蛋白的免疫原，免疫6-8周齡的雌性Blab/c小鼠，間隔2周免疫1次，三免后斷尾取血測定效價和抑制率，選擇結(jié)果最佳的小鼠準備融合。
細胞融合取小鼠的脾細胞和本實驗室保存的SP2/0細胞，進行融合，間接ELISA 法測定上清選取陽性高的孔，通過有限稀釋法對陽性孔進行亞克隆，直至建立產(chǎn)生單一抗磺胺二甲嘧啶的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
單克隆抗體的大量制備選取個體較大的雌性Blab/c小鼠，采用體內(nèi)誘生腹水法，大量制備腹水，并通過辛酸-硫酸銨沉淀純化腹水，分成小管，-20°C保存。
4、樣品前處理(1)肉類、肝臟、腎臟等組織將樣品組織除去脂肪后勻漿，稱取2g勻質(zhì)物，加入細1的提取液，渦旋振蕩5min，室溫 (20-25°C)下 3000g 離心 5min，取上清 Iml 用 lmol/L HCL 調(diào) PH 在 7. 0-7. 5，70°C-80°C下水浴lOmin，室溫(20-25°C)下3000g離心5min，取上清液50 μ 1進行檢測。
(2)尿樣前處理將尿樣3000rpm離心5min至清亮，取上清用復溶液稀釋5倍后，取50 μ 1進行檢測。
(3)飼料前處理將樣品組織除去脂肪后勻漿，稱取2g勻質(zhì)物，加入細1的提取液，渦旋振蕩5min，室溫 (20-25°C)下 3000g 離心 5min，取上清 Iml 用 lmol/L HCL 調(diào) PH 在 7. 0-7. 5，70°C-80°C下水浴lOmin，室溫(20-25°C)下3000g離心5min，取上清液50 μ 1進行檢測。
(4)牛奶前處理將牛奶用復溶液稀釋5倍后，室溫(20-25°C)下3000g離心5min，取上清液50 μ 1進行檢測。
5、溶液的配制(1)濃縮提取液的配制配置含NaOH濃度為0. 1Μ，pHIO的磷酸鹽緩沖液。
(2)濃縮復溶液的配制配置含0. 1%-0. 6% (w/w) DMSO的磷酸鹽緩沖液，PH為7. 4，磷酸鹽濃度為0. 1M。
(3)磺胺二甲嘧啶標準液的配制準確稱取IOOmg磺胺二甲嘧啶標準樣，溶于100ml甲醇中，用緩沖液稀釋成40. 5 μ g/ L、13. 5 μ g/L>4. 5 μ g/LA. 5 μ g/L、0. 5 μ g/L,0 μ g/L。
6、酶聯(lián)免疫試劑盒的組裝(1)各試劑在裝瓶過程中都是無菌操作。
(2)單條8孔的板條真空塑封，6或12條裝；濃縮洗滌液2瓶20ml ；濃縮提取液1瓶20ml ；濃縮復溶液1瓶20ml ；A、B底物顯色液各一瓶7ml ；磺胺二甲嘧啶特異性抗體工作液1瓶3ml ；酶標抗抗體工作液1瓶7ml ；終止液一瓶7ml ；磺胺二甲嘧啶標準品6瓶，Iml/ 瓶；100 μ g/L高濃度標準品1瓶，Iml/瓶；說明書一份；微孔板封口膜一張，板框一塊。
(3)檢測合格后封裝，在4°C保存。
7、試劑盒檢測方法(1)取出試劑盒中試劑恢復至室溫，至少在室內(nèi)放置30min；(2)按需要取出板條，放置在酶標板上；(3)按需要的量將磺胺二甲嘧啶特異性抗體和酶標物按1:5比例混合；(4)向孔內(nèi)依次加入磺胺二甲嘧啶標準品(或待測樣品)50μ1，加入磺胺二甲嘧啶特異性抗體和酶標物的混合物(1 5) 60 μ 1，輕輕振蕩混勻，37°C避光孵育20min ；(5)洗滌4次，拍干；(6)將底物A顯色液和底物B顯色液按1 1比例混合，100 μ 1/孔加入顯色，37°C避光孵育IOmin ；(7)加終止液50μ 1終止反應，酶標儀450nm和595nm下進行雙波長測定，根據(jù)標準曲線進行定量或定性。
(8)檢測結(jié)果分析定量分析分別計算標準品和待測樣品的平均吸光度值，標準品或樣品的吸光度值 (B)除以0標準品的吸光度值再乘以100%，即為百分吸光度值，百分吸光度值=(Β/Β0) X100%。以百分吸光度值為縱坐標，標準濃度的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線，如圖1所示。 將待測樣本的百分吸光度值代入標準曲線，即可求出對應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣本的實際殘留。
定性分析用待測樣本的平均吸光度值和標準品的吸光度值相比較，即可得出待測樣本的濃度范圍。
檢測結(jié)果也可以用專業(yè)的計算機軟件進行計算，測試范圍為0. 5μ g/ml-40. 5μ g/ ml，整個檢測過程只需30min。
二、試劑盒的靈敏度試驗靈敏度以最低檢測限(mg/kg或yg/kg)表示。分別測定20份雞肉組織、豬肉組織、豬肝、豬尿、飼料、牛奶等空白樣品，及20份磺胺二甲嘧啶0標準品。求(Β/Β0)%值的平均值 (X)和標準差(SD)，從標準曲線上求出X-2SD值對應的標準品濃度，作為各樣本的最低檢測限。
本試劑盒的50%抑制濃度在1. 3-2. 0 μ g/L范圍內(nèi)，組織的檢測限約為1 μ g/L,尿液 1. 5 μ g/L,飼料 3. 0 μ g/L,牛奶 2. 0 μ g/L。
三、試劑盒的精確度試驗從檢測合格的試劑盒中，選取同一批次和不同批次的酶標板，測定0. 5μ g/L、4. 5μ g/ L、13. 5 μ g/L三個添加濃度下的變異系數(shù)，每個樣品做20個復孔。在所測的豬肉組織、豬肝、豬尿、飼料、牛奶等樣品中，批內(nèi)變異系數(shù)均<7. 8%，批間變異系數(shù)均<9. 1%。
四、試劑盒的回收率試驗測定0. 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、13. 5 μ g/L三個添加濃度下的樣品添加回收率試驗，每個濃度做5個復孔，重復3次試驗。結(jié)果肉、肝等組織的添加回收率為65%-110%，豬尿、牛奶的添6加回收率為80%-120%，飼料中的添加回收率為55%-95%。
五、試劑盒的保存期試驗(1)將試劑盒放置在2°C _8°C保存6個月，期間每隔1個月檢測一次，測定試劑盒的 IC50%、ODmax、回收率等各項參數(shù)。
(2)將試劑盒放置在37°C放置6天，每天檢測一次，測定試劑盒的IC50%、ODmax, 回收率等各項參數(shù)。
(3)將試劑盒放置在_20°C冷凍6天，每天檢測一次，測定試劑盒的IC50%、0Dmax、 回收率等各項參數(shù)。
結(jié)果看出，三種條件保存試驗，本試劑盒的各項指標均符合質(zhì)量要求，因此，此試劑盒可以在2°C _8°C保存至少6個月。
權(quán)利要求
1.一種磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，有一盒體，其特征在于所述盒體中包括(1)包被有磺胺二甲嘧啶抗原的酶標板；(2)磺胺二甲嘧啶特異性抗體；(3)酶標記物；(4)磺胺二甲嘧啶標準品溶液；(5)A底物顯色液和B底物顯色液；(6)終止液;(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復溶液；(9)濃縮提取液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述磺胺二甲嘧啶抗原由磺胺二甲嘧啶半抗原和載體蛋白通過重氮化法偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、兔血清蛋白或鼠血清蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述磺胺二甲嘧啶特異性抗體為由所述磺胺二甲嘧啶抗原按常規(guī)的免疫方法制備得到單克隆抗體或多克隆抗體，其工作液為PH7. 4的含有0. 1-5% (w/w)脫脂奶粉的磷酸緩沖液，磺胺二甲嘧啶特異性抗體與上述工作液的比為1:2000 (w/w)0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述酶標記物為酶標記的抗鼠或抗兔的抗抗體，其工作液為PH7. 4的含有0. 1-5%脫脂奶粉的磷酸緩沖液，酶標記物與上述工作液的比為1:4000 (w/w)，標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述磺胺二甲嘧啶標準品溶液濃度分別為 Oyg/L、。. 5 yg/LU.5 μ g/L、4. 5 μ g/LU3. 5 μ g/L、40. 5 μ g/L0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述A底物為0. 06% (w/w)的過氧化氫，B底物為0. 4% (w/w)四甲基聯(lián)苯胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述濃縮提取液為NaOH濃度為0. ΙΜ,ρΗΙΟ的磷酸緩沖液，所述濃縮復溶液為含0. 1%_0. 6% (w/w)DMS0 的磷酸鹽緩沖液，所述濃縮洗滌液為0. 9% (w/w)的NaCl溶液，所述終止液為2N的硫酸溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種磺胺二甲嘧啶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其盒體中包括(1)包被有磺胺二甲嘧啶抗原的酶標板；(2)磺胺二甲嘧啶特異性抗體；(3)酶標記物；(4)磺胺二甲嘧啶標準品溶液； (5)A底物顯色液和B底物顯色液； (6)終止液； (7)濃縮洗滌液； (8)濃縮復溶液； (9)濃縮提取液。本發(fā)明試劑盒克服了其他試劑盒操作時間長、前處理復雜的問題，整個操作過程只需30min，前處理無需配備特殊的儀器，操作簡單、快速，適合現(xiàn)場大批量篩查，且試劑盒各試劑均是工作液形式，操作簡單易行。
文檔編號G01N33/577GK102507945SQ20111035225
公開日2012年6月20日 申請日期2011年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月5日
發(fā)明者吳萌, 李君華, 李春生, 程華, 閆靜輝, 齊穎穎 申請人:河北省科學院生物研究所