專利名稱：一種磺胺藥抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種磺胺藥抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磺胺類藥(Sulfonamides)，是通過人工合成的氨苯磺胺衍生物，主要用于預(yù)防和 治療細菌感染性疾病。代表藥物有磺胺二甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺間甲 氧嘧啶、磺胺喹惡啉等。磺胺類藥物能抑制革蘭氏陽性菌及一些陰性菌，可以治療多種細菌 感染，在獸醫(yī)臨床上廣泛應(yīng)用于治療由敏感細菌感染的各種畜禽疾病。由于磺胺類藥物在體內(nèi)的作用和代謝時間較長，通過任何途徑攝入的磺胺都有可 能在人體內(nèi)蓄積。蓄積濃度超過一定值時，就會對人體造成損害。短時間大劑量或長時間小 劑量的刺激可分別引起急性或慢性中毒，影響機體的泌尿、免疫系統(tǒng)，破壞肌肉、腎臟和甲 狀腺等組織，如誘發(fā)人的甲狀腺癌等。另外，人體內(nèi)長期存在磺胺會導(dǎo)致許多細菌對磺胺類 藥物產(chǎn)生抗藥性。因此，國際食品法典委員會(CAC)和許多國家規(guī)定，食品中磺胺類總量的 最大殘留限量(MRL)為0. lmg/kg。酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme-linked Immunoadsorbent Assay，簡稱ELISA)是將抗體抗原反應(yīng)的高度特異性、敏感性與酶的高度催化性有機地結(jié) 合，在不同的載物上進行有毒物質(zhì)殘留分析的方法。目前，用于免疫檢測的抗體都是單克隆抗體或多克隆抗體。單克隆抗體或多克隆 抗體的制備必須通過細胞培養(yǎng)獲得，整個生產(chǎn)過程復(fù)雜，消耗時間長，費用高，且不易進行 操作。單鏈抗體是將抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因通過一個短肽鏈連接后融合表達出 來的抗體片斷，具有分子量小、特異性高、結(jié)合力強、易于利用基因工程技術(shù)操作等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測磺胺藥的單鏈抗體及其編碼基因。本發(fā)明所提供的單鏈抗體，由重鏈可變區(qū)、連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽、 輕鏈可變區(qū)依次連接組成，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列1自N末端起第1-118位 氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區(qū)的的氨基酸序列如序列1自N末端起第134-248位氨基 酸殘基所示。上述單鏈抗體中，所述連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽的氨基酸序列如序列 1自N末端起第119-133位氨基酸殘基所示。所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重鏈可變區(qū)的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第1-354位核苷 酸所示的DNA分子；2)所述輕鏈可變區(qū)的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第400-744位核 苷酸所示的DNA分子；3)所述連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽的編碼基因為自序列表中序列2的 5'末端起第355-399位核苷酸所示的DNA分子；
4)序列表中序列2所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)、2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA 分子。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系和表達盒也屬于 本發(fā)明的保護范圍。上述任一所述單鏈抗體在檢測磺胺藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；所述 磺胺藥物為如下中的至少一種磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶、磺胺間二甲氧 嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對甲氧嘧啶。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測磺胺藥的免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測磺胺藥的免疫試劑盒，為下述1)、2)、3)或4)中任一所述試 劑盒1)試劑盒中包括磺胺藥半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、上述任一所述單鏈抗體和酶 標(biāo)記抗抗體；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原；2)試劑盒中包括磺胺藥半抗原的酶標(biāo)記物、上述任一所述單鏈抗體和抗抗體；其 中，所述抗抗體作為包被原；3)試劑盒中包括磺胺藥半抗原的酶標(biāo)記物、上述任一所述單鏈抗體；其中，所述 單鏈抗體作為包被原；4)試劑盒中包括磺胺藥半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、上述任一 2所述單鏈抗體的 酶標(biāo)記物；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原。上述任一所述免疫試劑盒中，所述試劑盒中包括磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液、洗滌液和樣 品濃縮液；所述磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)品為磺胺二甲基嘧啶；所述磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液為如下各濃度的溶液0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、 4. 5 μ g/L、13. 5 μ g/L 和 40. 5 μ g/L ；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20，5g疊氮化鈉和 990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 005M-0. 015M, 具體為0. 01M, pH值為7. 2-7. 6，具體為7. 4 ；所述樣品濃縮液為濃度為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，具體為 0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；磺胺藥半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物是按照如下方法制備的(1)將每104mg磺胺 藥半抗原與8mL 0. 25mol/L的硫酸水溶液混合均勻，置于4°C，得到溶液I ； (2) 200mg的載 體蛋白與8mL的Na2CO3溶液混合均勻，置于4°C，得到溶液II ； (3) 38mgNaN02與2mL純水混 合均勻，得到溶液III ； (4)在15min內(nèi)將溶液III加入到溶液I中，在此過程中，溶液I置于碎 冰中，得到溶液IV ;(5)將溶液IV加入到溶液II中，攪拌，得到磺胺藥半抗原與載體蛋白的 偶聯(lián)物；所述磺胺藥半抗原為磺胺二甲基嘧啶；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白 蛋白、鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清白蛋白、血藍蛋白或卵清白蛋白；所述抗抗體為鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測磺胺藥的膠體金試紙。本發(fā)明所提供的檢測磺胺藥的膠體金試紙，包括樣品吸收墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸水墊，其依次連接；所述膠體金墊包被有膠體金標(biāo)記的上述任一所述單鏈抗體；所述反 應(yīng)膜上含有檢測帶和質(zhì)控帶，檢測帶位置包被有上述任一所述磺胺藥半抗原與載體蛋白的 偶聯(lián)物，質(zhì)控帶位置包被有鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體；所述磺胺藥半抗原為磺胺二甲基嘧 啶。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測樣品中磺胺藥的方法。本發(fā)明所提供的檢測樣品中磺胺藥的方法，為如下I )或II )所示I )檢測樣品中磺胺藥的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用上述任一所述免疫試劑盒對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)、c)、d)和e)中的任一a)所述待測樣品為牛奶；將樣品稀釋液和所述牛奶進行混合，得到的混合溶液為 待測樣本溶液；所述樣品稀釋液和所述牛奶的體積比為(3-5) 1或4 1 ；b)所述待測樣品為奶粉；將樣品稀釋液和所述奶粉進行混合，得到的混合溶液為 待測樣本溶液；所述樣品稀釋液和所述奶粉的配比為(4_6)ml Ig或5ml Ig;c)所述待測樣品為豬肉、蛋、魚或蝦；將每Ig待測樣品的勻漿組織與2mL甲醇混 勻，20°C-25°C、4000r/min離心lOmin，取上清液1. 5mL ；將1. 5mL上清液氮氣吹干，用0. 5mL 樣品稀釋液進行復(fù)溶，得到復(fù)溶液；向復(fù)溶液中加入ImL正己烷混勻，20°C -25°C、4000r/ min離心lOmin，取下層水相，即為待測樣本溶液；d)所述待測樣品為雞肉；將每2g待測樣品的勻漿組織與6mL乙腈和水的混合溶 液混合，15°C、3000r/min離心lOmin,取4mL上清液，記作上清液I ；將4mL上清液I與2mL 氯化鈉水溶液和7mL乙酸乙酯混勻，15°C、3000r/min離心lOmin，取出所有的上清液，記作 上清液II ；將上清液II氮氣吹干，用ImL樣品稀釋液溶解，再向其中加入ImL正己烷，15°C、 3000r/min離心lOmin，取下層水相，即為待測樣本溶液；所述乙腈和水的混合溶液中，乙腈 和水的體積比為84 16 ；所述氯化鈉水溶液的濃度為2M ；e)所述待測樣品為蜂蜜；將每1. Og待測樣品與ImL IM鹽酸水溶液混勻，37°C孵 育30min，向其中加入0. 5mL 2M氫氧化鈉水溶液和0. 5mL 0. 2M磷酸緩沖溶液，混勻，再加入 8mL乙腈，震蕩10min，25°C、3000r/min離心5min，取上層有機相2. 5mL，氮氣吹干，用0. 5mL 樣品稀釋液溶解，得到的溶液即為待測樣本溶液；II )檢測樣品中磺胺藥的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用上述任一所述膠體金試紙卡對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為將每Ig均質(zhì)豬肉與5mL乙酸乙酯混勻，4°C、2000r/min離 心5min，取ImL上清液，蒸發(fā)干燥，得到殘留物；用0. 2mL樣品稀釋液溶解所述殘留物，即得 到所述待測樣本溶液；所述磺胺藥為如下中的至少一種磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶、磺 胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對甲氧嘧 啶；所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的。上述試劑盒既可以為酶聯(lián)免疫試劑盒，又可為發(fā)光免疫試劑盒，當(dāng)為酶聯(lián)免疫試劑盒時，所述試劑盒中包括底物顯色液；所述底物顯色液由A液和B液組成，所述A液為濃 度為1. 5% -2. 5%的過氧化脲的水溶液，B液為濃度為0. 5% -1. 5%的四甲基聯(lián)苯胺的水 溶液；所述A液優(yōu)選為濃度為2 %的過氧化脲的水溶液，B液優(yōu)選為濃度為1 %的四甲基 聯(lián)苯胺的水溶液。本發(fā)明的單鏈抗體(scFv)是用基因工程方法將抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變 區(qū)(VL)通過一段連接肽(Linker)連接而成的重組抗體，是保持了親本抗體的抗原親和活 性和特異性的最小功能性抗體片段，可通過基因工程技術(shù)體外表達得到，可在細菌中很經(jīng) 濟地大規(guī)模生產(chǎn)，從而使得免疫檢測抗體的生產(chǎn)變得非常容易、簡便和經(jīng)濟，進而大大減少 檢測試劑的費用，比雜交瘤細胞培養(yǎng)得到單抗的方法要簡單得多。本發(fā)明抗體的親和常數(shù) 為2 . 64X 109L/mol、半數(shù)抑制量(IC5tl)為1. 6ng/mL。本發(fā)明為食品中磺胺藥殘留檢測方法 的建立提供高效價、高特異性的抗體來源。本發(fā)明試劑盒和膠體金試紙卡具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度高、成本低、操作 簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質(zhì)期長的優(yōu)點；能同時快速檢測大批量 樣品，可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。本發(fā)明試劑盒和膠體金試紙卡可以同時檢測磺胺二甲 基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺 嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶多種藥物，將在磺胺類藥物的檢測中發(fā)揮重要作用。 因此，本發(fā)明的抗體、試劑盒、膠體金試紙及檢測方法在磺胺藥的檢測中將發(fā)揮重大作用。


圖1為試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、抗體的制備及功能檢測一、磺胺藥單鏈抗體的制備(一 )抗體的篩選取6個月雄性Balb/c小鼠，Trizol —步法提取脾細胞總RNA，純化得到mRNA， 再逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用Oligo(dT)引物，以cDNA為模板分別擴增得到重鏈可變區(qū) (VH)、輕鏈可變區(qū)(VL)基因，采用重迭延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(SOE-PCR)通過一段柔性肽段 ((Gly4Ser)3-Linker)將VH、VL裝配為scFv ；將酶切scFv連接入核糖體展示載體(pRDV) 中，通過PCR技術(shù)在scFv的5'端引入T7啟動子和核糖體結(jié)合位點，3'端引入間隔區(qū)tolA 序列而構(gòu)建出核糖體展示模板，通過體外表達得到mRNA-核糖體-抗體三元復(fù)合物，構(gòu)建出 單鏈抗體核糖體展示文庫，借助ELISA和PCR技術(shù)經(jīng)四輪循環(huán)篩選出特異性磺胺類藥物單 鏈抗體基因，其中在第二輪循環(huán)時，借助錯配PCR和交替延伸PCR技術(shù)進行抗體改造，并引 入酶切位點。該單鏈抗體的編碼基因序列如序列表中序列2所示，自序列2的5'末端起第 1-354位核苷酸編碼重鏈可變區(qū)，自序列2的5'末端起第400-744位核苷酸編碼輕鏈可變區(qū)，自序列2的5'末端起第355-399位核苷酸編碼短肽。該單鏈抗體由重鏈可變區(qū)、連接所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽、輕鏈可變 區(qū)順次連接組成。該抗體的氨基酸序列如序列表中序列1所示，自序列1的N端起第1-118 位氨基酸殘基為重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，自序列1的N端起第134-248位氨基酸殘基為 輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，自序列1的N端起第119-133位氨基酸殘基為短肽序列。(二)抗體的制備表達載體pET20b購自德國N0VAGEN公司；大腸桿菌BL21購自德國N0VAGEN公司； 蛋白純化用HisLink Protein Purification Resin購自美國Promega公司，產(chǎn)品目錄號 為 V8823。合成序列表中序列2所示基因，并在兩端引入酶切位點Xba I和Not I，用限制性 內(nèi)切酶Xba I和Not I酶切，回收目的基因片段；用限制性內(nèi)切酶XbaI和Not I酶切表達 載體pET20b，回收載體大片段；連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選培養(yǎng)，挑取單克?。粚?克隆接入液體培養(yǎng)基進一步培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切和測序驗證，結(jié)果測得的序列如序列表中 序列2所示，表明重組載體中基因插入方向和序列均正確，將陽性重組載體記作重組表達 載體 pET20b/ScFv。采用氯化鈣化法將重組表達載體pET20b/ScFv轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，抗性篩選，經(jīng) 菌液PCR及質(zhì)粒酶切驗證，得到含有重組表達載體pET20b/ScFv的重組大腸桿菌，記作重組 大腸桿菌 BL21/pET20b/ScFv。2XTY培養(yǎng)液的組成由胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl和水組成，每1升2XTY培養(yǎng) 液中胰蛋白胨的濃度為1.6%、酵母提取物的濃度為l%、NaCl的濃度為0.5%;各百分含量 均為質(zhì)量百分含量。含氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖的2XTY培養(yǎng)液是按照如下方法得到的向2XTY 培養(yǎng)液中添加氨芐青霉素、氯霉素和葡萄糖，使氨芐青霉素在溶液中的終濃度為IOOyg/ ml，使氯霉素在溶液中的終濃度為34 μ g/ml，使葡萄糖在溶液中的終濃度為1 % (質(zhì)量百分 含量)。發(fā)酵重組菌將重組大腸桿菌BL21/pET20b/ScFv的單個陽性菌落接種至含氨芐 青霉素、氯霉素和葡萄糖的2 X TY培養(yǎng)液中，37°C振搖，至培養(yǎng)體系的A6tltl為0. 6時，收集細 菌；將細菌重懸于2ml LB液體培養(yǎng)基中，按1 20的體積比將菌懸液接種至50ml含相同 濃度抗生素的LB液體培養(yǎng)基中(含相同濃度抗生素的LB液體培養(yǎng)基的組成氨芐青霉素、 氯霉素、酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水組成；溶液中各成分的濃度為酵母提取物0. 5%, 蛋白胨1 %，NaCl 1 %，氨芐青霉素100 μ g/ml，氯霉素34 μ g/ml)，37°C振搖，至培養(yǎng)體系的 A600 為 0. 6 時，加 IPTG(0. 7mmol/L)誘導(dǎo)，30°C振搖 2. 5h，在 4°C下 5000r/min 離心 lOmin， 收獲細菌。用洗滌液(將20mmol Tris和0. 15mol NaCl用水溶解，用HCL調(diào)PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升洗滌液)洗滌1次，加溶菌液(將20mmol TrisUOml Triton Χ-100、250 μ mol PMSF、62. 5 X IO4U溶菌酶用水溶解，用HCL調(diào)PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升溶菌液)，30°C放置15min，然后在冰上超聲處理(輸出功率80% ) 10s，停10s， 反復(fù)3次，至細胞不再粘稠。在4°C 2000Xg離心20min，分別收集上清及沉淀。將沉淀用結(jié) 合緩沖液I (將20mmol Tris、0. 5mol Nacl和5mmol咪唑用水溶解，用HCL調(diào)PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升結(jié)合緩沖液I )洗滌一次，而后，懸于結(jié)合緩沖液II (將20mmol
9Tris,0. 5mol Nacl、5mmol咪唑和6mol尿素用水溶解，用HCL調(diào)PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升結(jié)合緩沖液II )中，4°C，12000 Xg離心20min，收集上清，經(jīng)0.45mm濾膜過濾， 收集濾液，得到抗體的粗制液。純化利用表達載體上帶有的組氨酸標(biāo)簽(His-tag)標(biāo)記通過親和層析純化單鏈 抗體蛋白。將 HisLink Protein Purification Resin 裝柱，以 10 倍柱體積的 binding buffer (將 lOOmmolHEPES、IOmmol 咪唑和 500mmol NaCl 用水溶解，再調(diào)節(jié) pH 值至 7. 5，然 后用水定容至1升，得到1升binding buffer)平衡純化柱，取抗體的粗制液上樣，然后用5 倍柱體積的wash buffer (將lOOmmolHEPES、IOOmmol咪唑和用水溶解，再調(diào)節(jié)pH值至7. 5， 然后用水定容至1升，得到1升wash buffer)洗脫雜蛋白，最后用10倍柱體積的elution buffer (將lOOmmolHEPES、250mmol咪唑用水溶解，再調(diào)節(jié)pH值至7. 5，然后用水定容至1 升，得到1升elution buffer)洗脫目標(biāo)蛋白，收集洗脫液，透析，得到純化的抗體。蛋白驗證Western blot 收集上述各階段產(chǎn)物，進行12% SDS-PAGE電泳；將電泳 條帶印跡到NC膜上，再與HRP標(biāo)記的磺胺二甲嘧啶雜交，檢測發(fā)光條帶?；前范奏奏べ?自美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號為S6256。同時以轉(zhuǎn)入空載體pET20b的大腸桿菌BL21作為對照，并按照上述方法進行表達 和純化，和Western blot檢測。Western blot檢測結(jié)果表明1)實驗組得到的蛋白具有與磺胺二甲嘧啶結(jié)合的 功能，蛋白的分子量為29kD，與預(yù)期的蛋白分子量一致，表明目的蛋白為與磺胺二甲嘧啶的 抗體。2)對照組沒有檢測到任何與磺胺二甲嘧啶(SM2)結(jié)合的蛋白條帶。(三)抗體的功能檢測1、用ELISA方法，檢測抗體的半抑制率(IC5tl)a、將實施例2中制備得到的偶聯(lián)物(SM2-KLH)用包被緩沖液溶解，得到SM2-KLH的 溶液(該溶液中SM2-KLH的濃度為1 μ g/ml)。包被緩沖液pH9. 6,0. lmol/L的碳酸鈉緩沖 液。向96孔板的孔中加入SM2-KLH的溶液，100 μ L每孔，37°C溫育2h ；傾去包被液，用 PBST溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液體；b、然后向每孔中加入200μ L2% BSA封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體；用PBST 溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液體。C、向孔中加入單鏈抗體溶液和不同濃度的磺胺二甲嘧啶(SM2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各 50yL每孔，37°C孵育1小時。以只加入單鏈抗體溶液不加入磺胺二甲嘧啶(SM2)標(biāo)準(zhǔn)品溶 液的孔作陽性對照。單鏈抗體溶液的制備用樣品稀釋液稀釋實驗(二)中的純化抗體得到溶液，抗體 在溶液中的濃度為5ng/mL ；樣品稀釋液為0. 002mol/L的磷酸鹽緩沖液。不同濃度的磺胺二甲嘧啶(SM2)溶液的制備用樣品稀釋液稀釋磺胺二甲嘧啶 (SM2)得到溶液。d、用PBST溶液(PBS,0. 05% Tween20)洗滌3次，250 μ L每孔，甩干孔中液體，加 入HRP標(biāo)記的鼠抗His標(biāo)簽單克隆抗體，37°C孵育1小時；e、用 PBST 溶液(PBS,0. 05%Tween20)洗滌 3 次，250 μ L 每孔；加入 TMB 顯色，37°C 反應(yīng)10分鐘，加入2M硫酸終止顯色反應(yīng)，每孔50 μ L，使用酶標(biāo)儀進行讀數(shù)。
實驗設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果如下1)吸光度值與每孔所加入的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中磺胺二甲嘧啶(SM2)的濃度成反比；證 明，所表達純化得到的單鏈抗體具有針對磺胺二甲嘧啶(SM2)的結(jié)合特異性，并呈現(xiàn)線性關(guān) 系，說明該抗體可用于對磺胺二甲嘧啶(SM2)的免疫檢測。2)半抑制率(IC5tl)陽性對照孔(即不添加磺胺二甲嘧啶(SM2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的孔) 的吸光度值為Btl，各實驗孔的吸光度值為B，當(dāng)BziBci為50%時所對應(yīng)的磺胺二甲嘧啶(SM2) 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度即為半抑制率(IC50)。該單抗的半抑制率(IC5tl)為1.6ng/mL。2、抗體的親和常數(shù)測定方法取定量的一定稀釋度的抗體，分別加入逐漸增加的抗原里，可使抗體的結(jié)合 達到飽和，以結(jié)合部分(B)為縱坐標(biāo)，抗原濃度(mol/L)為橫坐標(biāo)繪制飽和曲線，求出抗體 飽和程度為50%時的游離抗原濃度，其倒數(shù)即為該抗體在此稀釋度下的親和常數(shù)。結(jié)果抗體的親和常數(shù)為2. 64X 109L/mol。實施例2、檢測磺胺藥的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備一、酶聯(lián)免疫試劑盒由下述物質(zhì)組成1、包被磺胺二甲基嘧啶與載體蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板；2、磺胺藥抗體實施例1中所述單鏈抗體。抗體工作液的濃度為5. Ong/mL，抗體 工作液是用樣品稀釋液稀釋實施例1中的純化抗體得到的到的；3、磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)品磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)品為磺胺二甲基嘧啶(SM2)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為 0 μ g/L,0. 5 μ g/L, 1. 5 μ g/L,4. 5 μ g/L, 13. 5 μ g/L 和 40. 5 μ g/L ；磺胺二甲基嘧啶購自美 國Sigma-Aldrich公司；產(chǎn)品目錄號為S6256 ；用樣品稀釋液稀釋成上述各濃度；4、酶標(biāo)二抗辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體；購自美國 Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號為A7058。5、底物顯色液由A液和B液組成，A液為2%過氧化脲的水溶液，B液為1 %四甲 基聯(lián)苯胺的水溶液；6、終止液0. 2M硫酸水溶液；7、洗滌液每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20、5g疊 氮化鈉和990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01M, PH值為7.4;8、樣品濃縮液0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；將其進行20倍稀釋，成為樣品稀釋液
后使用。二、試劑盒組分的制備(一)包被原的制備用重氮化法將半抗原SM2偶聯(lián)于載體蛋白KLH上，由于SM2具有芳伯氨基的半抗 原，在強酸和冷卻條件下芳伯氨基生成親電動重氮鹽，與載體蛋白中的強給電子集團發(fā)生 反應(yīng)，生成重氮產(chǎn)物，形成包被抗原SM2-KIiL以磺胺二甲基嘧啶(SM2)作為磺胺二甲基嘧啶半抗原。(1)取104mg磺胺二甲基嘧啶(SM2)，加入8mL 0. 25mol L—1的硫酸水溶液中，置于 4°C冰箱，形成溶液I (含SM2)；
(2) 200mg的血藍蛋白(KLH)溶于8mL的Na2CO3溶液中(pH = 10)，置于4°C冰箱， 形成溶液II (含KLH)；(3) 38mg NaNO2,加入 2mL 純水，得到溶液III (含 NaNO2)；(4)將溶液III (含NaNO2)緩慢加入到溶液I (含SM2)中，在此過程中，溶液I (含 SM2)置于碎冰中，大概15min，得到溶液IV (含SM2-NaNO2混合物)；(5)將溶液IV (含SM2-NaNO2混合物)緩慢加入到溶液II (含KLH)中，并搖動燒 杯，此時有紅色生成；6min后，將燒杯置于磁力攪拌器上，室溫慢速攪拌，繼續(xù)加溶液IV (含 SM2-NaNO2混合物)；在攪拌過程中，檢測pH值，使之保持在9_10之間，最終溶液變成暗紅色 液體；室溫繼續(xù)攪拌4h ；裝入透析袋，生理鹽水透析。得到磺胺二甲基嘧啶與血藍蛋白的偶 聯(lián)物(SM2-KLH),即為包被原。半抗原SM2與載體蛋白KLH的偶聯(lián)比為1 10。( 二 )包被有包被原的酶標(biāo)板及其制備包被有合成抗原SM2-KLH的聚苯乙烯酶標(biāo)板用IOmM的碳酸鹽溶液將包被原作 1 50000倍稀釋(6. Oyg/mL)，包被96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，每孔100yL，37°C溫育2h，傾 去包被液，用洗滌液稀釋20倍后洗滌3次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200 μ L封閉 液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。包被緩沖液pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鈉緩沖液；封閉液每1升封閉液按照如下方法配制將5ml馬血清、Ig疊氮化鈉、30g酪蛋 白混合，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml，得到封閉液；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為 0. 02M, pH 值為 7. 2。三、試劑盒檢測方法本實驗中的樣品稀釋液將試劑盒中的濃縮液稀釋20倍得到。本實驗中的洗板液即為實驗一種所述試劑盒中的洗滌液。1、檢測樣本為牛奶、奶粉新鮮牛奶直接用樣品液稀釋后進行檢測，比例按照 1 4，取50yL用于檢測。稱取Ig奶粉，溶于5mL樣品液中稀釋，混合均勻，取50yL用于 檢測。2、檢測樣本為豬肉、蛋、魚或蝦稱取Ig勻漿組織到具塞離心管中，加入2mL甲醇 渦動30s，20-25°C、4000r/min離心lOmin，取上清液1. 5mL ；將1. 5mL上清液移到新的離心 管中，氮氣吹干，取0. 5mL樣品稀釋液進行復(fù)溶，得到復(fù)溶液；向復(fù)溶液中加入ImL正己烷 (或正庚烷)后，渦動10s，進行脫脂，4000r/min離心IOmin (20-25°C )，取50 μ L下層水相， 即檢測樣本溶液，用于分析。3、檢測樣本為雞肉稱取2g勻漿組織到具塞離心管中，加入6mL乙腈/水 (84 16，V V)后，振蕩 10min，3000r/min 離心 10min(15°C )，取 4mL 上清液，記作上清 液I ；將4mL上清液I移到新的離心管中，加入2mL氯化鈉水溶液(2M)和7mL乙酸乙酯， 振蕩10min，3000r/min離心IOmin (15°C )，取出所有的上清液，記作上清液II ；將所有的上 清液II移到新的離心管中，氮氣吹干，取ImL樣品稀釋液渦動lmin，進行復(fù)溶，得到復(fù)溶液； 向復(fù)溶液中加入ImL正己烷(或正庚烷)后，渦動2min，3000r/min離心10min(15°C )，取 50 μ L下層水相，即檢測樣本溶液，用于分析。4、檢測樣本為蜂蜜稱取1. Og蜂蜜樣本至50mL聚苯乙烯離心管中；加入ImL
IM鹽酸水溶液，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；放入37°C培養(yǎng)箱中孵育30min ；取 出，加入0. 5mL 2M氫氧化鈉水溶液和0. 5mL 0. 2M磷酸緩沖溶液，渦動混勻，再加入8mL乙 腈，震蕩10min，3000r/min、室溫下離心5min ；取上層有機相2. 5mL至IOmL干凈的玻璃試管 中，于50 60°C水浴氮氣流下吹干；加0. 5mL樣品稀釋液渦動5min溶解；取50mL用于分析。(二)用試劑盒檢測1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作向包被有包被原的酶標(biāo)板微孔中加入磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)品(即磺胺二甲基嘧啶SM2)溶 液50 μ L，再加入磺胺藥抗體工作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出 孔中液體，每孔加入250 μ L洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸 水紙拍干。加入酶標(biāo)二抗工作液100μ L，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗 滌步驟，每孔加入底物顯色液，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入終止液 50 μ L，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值。用每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn)) 的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。以磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)品濃度(yg/L)的半對 數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。百分吸光度值(%) = (Β/Β。)X 100%2、樣品中磺胺藥濃度的測定向包被有包被原的酶標(biāo)板微孔中加入檢測樣本溶液50 μ L，再加入磺胺藥單鏈抗 體工作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，每孔加入250 μ L 洗板液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。加入辣根過氧化物 酶標(biāo)記的二抗工作液100μ L，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，倒出孔中液體，重復(fù)洗滌步驟，每 孔加入混合底物顯色液100 μ L，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色15min，每孔加入終止 液50 μ L，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度值。結(jié)果判斷用每個檢測樣本溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo) 準(zhǔn))的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。相對應(yīng)每一個檢測樣本溶液的百 分吸光度值，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出檢測樣本溶液的吸光度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度 值換算得到樣本溶液中磺胺藥的殘留量。四、試劑盒檢測效果評價(一)準(zhǔn)確度試驗向不含磺胺藥的樣品(牛奶、雞肉和豬肉)中添加磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)品(即磺胺二甲基 嘧啶SM2)，使磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)品在樣品中的終濃度分別為 ομ g/L(y g/kg)、20μ g/L(y g/kg)； 將添加后的樣品分別按照實驗三中所述方法進行前處理，得到檢測樣本溶液。從三個不同批次的試劑盒中各抽取3個試劑盒進行檢測，每個實驗重復(fù)5次，分別 計算變異系數(shù)。結(jié)果分別見表1。表1磺胺二甲基嘧啶準(zhǔn)確度的測定結(jié)果
1權(quán)利要求
一種單鏈抗體，由重鏈可變區(qū)、連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽、輕鏈可變區(qū)依次連接組成，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列1自N末端起第1 118位氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區(qū)的的氨基酸序列如序列1自N末端起第134 248位氨基酸殘基所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于所述連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū) 的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第119-133位氨基酸殘基所示。
3.權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)、2)、3)、4) 或5)所示1)所述重鏈可變區(qū)的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第1-354位核苷酸所 示的DNA分子；2)所述輕鏈可變區(qū)的編碼基因為自序列表中序列2的5'末端起第400-744位核苷酸 所示的DNA分子；3)所述連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽的編碼基因為自序列表中序列2的5'末 端起第355-399位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列2所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)、2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子。
5.含有權(quán)利要求3或4所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系和表達盒。
6.權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體在檢測磺胺藥物中的應(yīng)用，所述磺胺藥物為如下中 的至少一種磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧 啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對甲氧嘧啶。
7.—種檢測磺胺藥的免疫試劑盒，為下述1)、2)、3)或4)中任一所述試劑盒1)試劑盒中包括磺胺藥半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體和 酶標(biāo)記抗抗體；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原；2)試劑盒中包括磺胺藥半抗原的酶標(biāo)記物、權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體和抗抗體； 其中，所述抗抗體作為包被原；3)試劑盒中包括磺胺藥半抗原的酶標(biāo)記物、權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體；其中，權(quán)利 要求1或2所述單鏈抗體作為包被原；4)試劑盒中包括磺胺藥半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物、權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體的 酶標(biāo)記物；其中，所述偶聯(lián)物作為包被原。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒中包括磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液、洗滌液和樣品濃縮液；所述磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)品為磺 胺二甲基嘧啶；所述磺胺藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液為如下各濃度的溶液ο μ g/L、0. 5 μ g/L、1. 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、 13. 5μ g/L 和 40. 5 μ g/L ；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將IOml吐溫20，5g疊氮化鈉和990ml 磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 005M-0. 015M，具體為 0. 01M, pH 值為 7. 2-7. 6，具體為 7. 4 ；所述樣品濃縮液為濃度為0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液，具體為0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；磺胺藥半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物是按照如下方法制備的(1)將每104mg磺胺藥半 抗原與8mL 0. 25mol/L的硫酸水溶液混合均勻，置于4°C，得到溶液I ； (2) 200mg的載體蛋 白與8mL的Na2CO3溶液混合均勻，置于4°C，得到溶液II ； (3) 38mgNaN02與2mL純水混合均 勻，得到溶液III ； (4)在15min內(nèi)將溶液III加入到溶液I中，在此過程中，溶液I置于碎冰 中，得到溶液IV ； (5)將溶液IV加入到溶液II中，攪拌，得到磺胺藥半抗原與載體蛋白的偶 聯(lián)物；所述磺胺藥半抗原為磺胺二甲基嘧啶；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、 鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清白蛋白、血藍蛋白或卵清白蛋白；所述抗抗體為鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體。
9.一種檢測磺胺藥的膠體金試紙，包括樣品吸收墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸水墊，其依 次連接；所述膠體金墊包被有膠體金標(biāo)記的權(quán)利要求1或2所述單鏈抗體；所述反應(yīng)膜上 含有檢測帶和質(zhì)控帶，檢測帶位置包被有權(quán)利要求8中所述磺胺藥半抗原與載體蛋白的偶 聯(lián)物，質(zhì)控帶位置包被有鼠抗HIS標(biāo)簽單克隆抗體。
10.一種檢測樣品中磺胺藥的方法，為如下I )或II )所示I)檢測樣品中磺胺藥的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用權(quán)利要求7或8所述免疫試劑盒對所述待測樣本溶液進行檢測；所述前處理的方法為下述a)、b)、c)、d)和e)中的任一a)所述待測樣品為牛奶；將樣品稀釋液和所述牛奶進行混合，得到的混合溶液為待測 樣本溶液；所述樣品稀釋液和所述牛奶的體積比為(3-5) 1或4 1 ；b)所述待測樣品為奶粉；將樣品稀釋液和所述奶粉進行混合，得到的混合溶液為待測 樣本溶液；所述樣品稀釋液和所述奶粉的配比為(4_6)ml Ig或5ml Ig;c)所述待測樣品為豬肉、蛋、魚或蝦；將每Ig待測樣品的勻漿組織與2mL甲醇混勻， 200C -25°C、4000r/min離心IOmin,取上清液1. 5mL ；將1. 5mL上清液氮氣吹干，用0. 5mL樣 品稀釋液進行復(fù)溶，得到復(fù)溶液；向復(fù)溶液中加入ImL正己烷混勻，20°C -25°C、4000r/min 離心lOmin，取下層水相，即為待測樣本溶液；d)所述待測樣品為雞肉；將每2g待測樣品的勻漿組織與6mL乙腈和水的混合溶液混 合，15°C、3000r/min離心lOmin，取4mL上清液，記作上清液I ；將4mL上清液I與2mL氯 化鈉水溶液和7mL乙酸乙酯混勻，15°C、3000r/min離心lOmin，取出所有的上清液，記作上 清液II ；將上清液II氮氣吹干，用ImL樣品稀釋液溶解，再向其中加入ImL正己烷，15°C、 3000r/min離心lOmin，取下層水相，即為待測樣本溶液；所述乙腈和水的混合溶液中，乙腈 和水的體積比為84 16 ；所述氯化鈉水溶液的濃度為2M ；e)所述待測樣品為蜂蜜；將每l.Og待測樣品與ImLIM鹽酸水溶液混勻，37°C孵育 30min,向其中加入0. 5mL 2M氫氧化鈉水溶液和0. 5mL 0. 2M磷酸緩沖溶液，混勻，再加入 8mL乙腈，震蕩10min，25°C、3000r/min離心5min，取上層有機相2. 5mL，氮氣吹干，用0. 5mL 樣品稀釋液溶解，得到的溶液即為待測樣本溶液；II )檢測樣品中磺胺藥的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用權(quán)利要求9所述膠體金試紙對所述待測樣本溶液進行檢測； 所述前處理的方法為將每Ig均質(zhì)豬肉與5mL乙酸乙酯混勻，4°C、2000r/min離心 5min,取ImL上清液，蒸發(fā)干燥，得到殘留物；用0. 2mL樣品稀釋液溶解所述殘留物，即得到 所述待測樣本溶液；所述磺胺藥為如下中的至少一種磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲嘧啶、磺胺間 二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對甲氧嘧啶； 所述樣品稀釋液為將所述樣品濃縮液稀釋20倍得到的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磺胺藥抗體及其應(yīng)用。該單鏈抗體由重鏈可變區(qū)、連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的短肽、輕鏈可變區(qū)依次連接組成，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列1自N端起第1-118位氨基酸殘基所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列1自N端起第134-248位氨基酸殘基所示。本發(fā)明試劑盒和膠體金試紙卡具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、精密度高、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質(zhì)期長的優(yōu)點；能同時快速檢測大批量樣品，可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。因此，本發(fā)明的抗體、試劑盒、膠體金試紙及檢測方法在磺胺藥的檢測中將發(fā)揮重大作用。
文檔編號G01N33/577GK101955536SQ20101016517
公開日2011年1月26日 申請日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者劉丹, 吳小平, 徐飛, 李娜, 李杰超, 李艷偉, 江海洋, 沈建忠, 溫凱, 王世恩, 王戰(zhàn)輝, 王照鵬, 王進 申請人:北京維德維康生物技術(shù)有限公司