專利名稱：超高壓液相色譜—飛行時間質譜同時測定白酒中六種微量甜味劑的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用超高壓液相色譜與飛行時間質譜聯用技術對白酒中六種微量甜味劑同時進行檢測的方法。屬于發(fā)酵食品工業(yè)中的化學分析和儀器分析技術領域。
背景技術：
甜味劑是一類重要的食品添加劑，它賦予食品以甜味，提高食品的品質，有著熱量低、適合糖尿病人食用等優(yōu)點。甜味劑按其來源可分為天然甜味劑和人工合成甜味劑。在現代食品工業(yè)中廣泛應用的人工合成甜味劑主要包括乙酰
磺胺酸鉀(安賽蜜，Acesulfame-K)、鄰苯甲?；酋０封c(糖精鈉，Saccharin sodium)、環(huán)己基氨基磺酸鈉(甜蜜素，Sodiumcyclamate)、三氯蔗糖(蔗糖素，Sucralose)、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(阿斯巴甜，Aspartame)和N-[N-(3， 3-二甲基丁基)丄-01-天門冬氨酰]-L-苯丙氨酸l-甲酯(紐甜，Neotame)，這些甜味劑的甜度分別是蔗糖的200、 300、 50、 600、 150和10000倍。隨著人工合成甜味劑在日常食品中應用范圍的拓寬和使用量的不斷加大，尤其是近年來有報道說某些甜味劑具有潛在致癌致畸、損害腎功能等副作用，各國政府和相關科研機構對人工合成甜味劑使用的安全性也越來越重視。我國2007年制定的《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》對人工甜味劑的加入量有嚴格規(guī)定。因此，人工合成甜味劑在生產中合理的使用，不僅關系到產品的品質，更關系到消費者的安全與健康。
白酒是我國特有的民族傳統產品，有著上千年的歷史，由于其風格獨特，深受廣大消費者喜愛，在國際上也享有盛譽，被稱為"國寶"?，F代研究表明，優(yōu)質發(fā)酵的白酒之所以具有醇甜感，是由于白酒本身含有一定的多元醇或酮等甜味物質，如2， 3-丁二醇、丙三醇、正丁醇等。為保護我國民族傳統產品，國家標準中明確規(guī)定其生產過程中不允許添加甜味劑。但個別生產企業(yè)為掩蓋劣質酒口味的苦澀，使其口感干冽、醇厚、綿軟，仍在酒的加工過程中違規(guī)的添加了甜味劑，達到降低成本、以次充好的目的。不但擾亂了正常的白酒市場次序而且嚴重的損害了廣大消費者的健康。可見研究開發(fā)出快速、準確的檢測白酒中甜味劑的方法十分必要。
目前關于食品中甜味劑的檢測方法較多，最普遍的是高效液相色譜一紫外檢測法，另外還有毛細管氣相色譜法、超高壓液相色譜一蒸發(fā)光散射檢測法、紫外分光光度法。但基本上都是針對單一甜味劑或者對兩種甜味劑進行測定，檢測靈敏度也有待提高，無法應對目前個別企業(yè)為逃避監(jiān)管，同時微量添加多種甜味劑的現象。而且由于甜蜜素與三氯蔗糖的紫外吸收較弱，不適宜使用紫外檢測器，所以使多種甜味劑同時檢測受到限制，而本發(fā)明方法則克服了上述方法的缺點，可同時檢測目前常見的安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜六種人工合成甜味劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及利用超高壓液相色譜與飛行時間質譜聯用技術對白酒中六種微量甜味劑進行同時檢測的方法。較為獨特的是該方法采用超高效液相色譜一飛
行時間質譜聯用(UPLC—TOF—MS)技術，針對白酒中常被違規(guī)添加的甜味劑，不但可同時檢測安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜六種甜味劑，而且快速、簡便，定性、定量準確、靈敏度高。
本發(fā)明方法在樣品經預處理后，通過BEH C18色譜柱分離以甲醇—20mmol/L乙酸銨水溶液為流動相進行梯度洗脫，在ESI負離子模式下檢測，選擇安賽蜜m/z=162 ([M-Kp ;糖精鈉m/z=182 ([M-Nap ;甜蜜素m/z=178
([M-Nap ;三氯蔗糖m/z=395 ([M-Hp ;阿斯巴甜m/z=293 ([M-H『)；紐甜m/z=377 ([M-H]O為監(jiān)測離子， 一次進樣分析僅需10min，且線性關系良好。本發(fā)明方法安賽蜜檢出限為0.05mg/L、糖精鈉、甜蜜素、紐甜檢出限為0.01mg/L、三氯蔗糖、阿斯巴甜檢出限為0.1mg/L，且一次進樣分析僅需10min，
線性關系、重復性良好。經與權威部門檢測數據對比本發(fā)明方法檢測的數據同樣準確可靠?？梢葬槍Π拙破髽I(yè)使用的復配甜味劑組成進行定性定量檢測，以
彌補目前檢測方法周期長、不能同時分析、定量檢測等不足之處。具體來說，本發(fā)明的主要分析步驟如下1樣品預處理
由于白酒中乙醇含量較高，在進行液相色譜分離時，容易對甜味劑在色譜柱保留性能產生影響。所以利用物理或化學方法脫去待測酒樣醇類等易揮發(fā)組分。
2色譜條件
(1) 色譜柱型號BEHC-18 2.1mmx50mm 1.7um;
(2) 檢測器紫外檢測器；
(3) 檢測波長200 800nm;
(4) 流動相流動相A:甲醇，流動相B: 20mmol/L乙酸銨溶液；
(5) 梯度洗脫時流動相配比:(初始)OminA:B比例為0:100; 4minA:B比例為30:70; 6-8minA:B比例為100:0; 8min后A: B比例恢復到O:IOO。 10min內分析混合標樣時，六種標準物質可完全分離，且峰形良好。
(6) 壓力范圍0 15000psi;
(7) 流速0.3ml/min;
(8) 色譜柱溫30。C;(9)進樣體積10(^L。
3質譜條件
(1) ESI負離子檢測模式；
(2) 毛細管電壓2.5kV;
(3) 錐孔電壓30V;
(4) 二級錐孔電壓4V;
(5) 離子能量h
(6) Detector電壓1600V;
(7) 離子源溫度100°C;
(8) 脫溶劑氣溫度25(TC;
(9) 脫溶劑氣(N2)流量600L/h，
(10) 錐孔氣(N2)流量50L/h;
(11) 質量范圍100 1000Da。
4流動相溶液配制
流動相A:甲醇，色譜純；
流動相B: 20mmol/L乙酸銨溶液，取1.54g乙酸銨用超純水溶解至1000ml，再經0.2pm濾膜過濾。
5六種甜味劑標準曲線繪制
分別取安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜單標工作溶液配制成一定濃度的混標溶液，待儀器穩(wěn)定后，分別對系列混標工作溶液取lO(il進樣，作UPLC~"MS檢測，以離子流的強度為縱坐標，樣品進樣量為橫坐標，繪制標準曲線(或回歸方程)。利用該方程和測得樣品中的甜味劑的離子流強度計算出各種甜味劑的含量。
6樣品檢測
(1) 按照1中方法對被測樣品進行預處理，取處理好的樣品進樣。六種甜味劑的標準品按照所配標準曲線濃度進樣10pL。
(2) 按照2、 3中的檢測條件，分別得到樣品的譜圖和六種甜味劑標準品的譜圖；將兩者進行比較，樣品譜圖中與標準品保留時間相同的色譜峰即為相應的某種甜味劑，為了確保檢測結果的準確性，采用各組分準分子離子作為監(jiān)測離子，若在相同保留時間處，樣品中某成份的檢測離子與一種標準品的檢測離子相同，可進一步肯定樣品中甜味劑的成分。
(3) 將樣品中所測得的甜味劑的色譜峰帶入5中的線性回歸方程中，計算
樣品中各種甜味劑的濃度。
本發(fā)明只需對被測酒樣做簡單的預處理工作，利用超高壓液相可以對被測定的六種甜味劑進行快速分離，整個過程只需10min，利用飛行時間質譜進行定性、定量分析。所以本發(fā)明的分析方法簡便快捷，靈敏度高，選擇性好，適用于對白酒中六種微量甜味劑的同時檢測。
本發(fā)明以大量實驗和理論分析，找到了一種超高壓液相色譜一飛行時間質譜同時測定白酒中六種微量甜味劑的方法，豐富了白酒中甜味劑測定手段。


圖l安賽蜜樣品標準曲線圖
圖2糖精鈉樣品標準曲線圖
圖3甜蜜素樣品標準曲線圖
圖4三氯蔗糖樣品標準曲線圖
圖5阿斯巴甜樣品標準曲線圖
圖6紐甜樣品標準曲線圖
圖7六種甜味劑的選擇離子色譜圖
圖8安賽蜜樣品質譜圖
圖9糖精鈉樣品質譜圖
圖IO甜蜜素樣品質譜圖
圖ll三氯蔗糖樣品質譜圖
圖12阿斯巴甜樣品質譜圖
圖13紐甜樣品質譜圖
圖14樣品1中甜蜜素選擇離子色譜圖
圖15樣品1中甜蜜素質譜圖
圖16樣品2中糖精鈉選擇離子色譜圖
圖17樣品2中糖精鈉質譜圖
圖18樣品3中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素三種甜味劑選擇離子色譜19樣品3中安賽蜜質譜圖
具體實施例方式
下面的實例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對本發(fā)明的限定。實例l市售某品牌白酒甜味劑檢測1材料
1.1儀器
超高壓液相色譜WATERS ACQUITYUPLC,檢測器WATERS ACQUITYPDA,色譜柱BEH C-18 2.1 mmx50mm 1.7um，飛行時間質譜儀WATERSSYNAPTMS， Masslynx4.1質譜色譜管理軟件。1.2試劑和樣品
甲醇色譜純(國藥集團)；20mmol/L乙酸銨溶液取1.54g乙酸銨(國藥集團)用超純水溶解至1000ml，再經0.2pm濾膜過濾；六種甜味劑標樣糖精鈉，甜蜜素，安賽蜜純度為99.9% (美國Sigma公司)；阿斯巴甜純度為99.0% (美國Sigma公司)；三氯蔗糖；紐甜純度為99.0% (深圳唐正生物科技有限公司)。被測樣品為市售白酒。
1.3標準品儲備液
精確稱取100mg單個甜味劑(安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜)標準品分別于100mL容量瓶中，用超純水溶解并定容，混勻。得到lmg/ml單標儲備溶液，于4'C冰箱中保存。
2方法
2.1色譜條件
(1) 超高壓液相色譜WATERS ACQUITYUPLC;
(2) 色譜柱BEHC-18 2.1 mmx50mm 1.7um;
(3) 檢測器WATERS ACQUITYPDA;
(4) 檢測波長選用200 800nm作為檢測波長；
(5) 流動相配比采用梯度洗脫，流動相A:甲醇，流動相B: 20mmol/L乙酸銨溶液。初始A:B比例為(O:IOO)， 4minA: B比例為(30:70)， 6-8minA:B比例為(100:0)， 8min后A:B比例恢復到(0:100)。 10min內分析混合標樣時，六種標準物
質可完全分離，且峰形良好。
(6) 壓力范圍0 15000psi;
(7) 流速0.3ml/min;
(8) 色譜柱溫30°C;
(9) 進樣體積10pL。
2.2質譜條件
(1) ESI負離子檢測模式；
(2) 毛細管電壓2.5kV;
(3) 錐孔電壓30V;
(4) 二級錐孔電壓4V;
(5) 離子能量l;
(6) Detector電壓1600V;
(7) 離子源溫度IO(TC;
(8) 脫溶劑氣溫度25(TC;(9) 脫溶劑氣(N2)流量600L/h，
(10) 錐孔氣(N2)流量50L/h;
(11) 質量范圍100 1000Da;
(12) 監(jiān)測離子安賽蜜m/z=162 ([M-Kp;糖精鈉m/z=182 ([M-Nap; 甜蜜素m/z=178 ([M-Na]-);三氯蔗糖m/z=395 ([M-H]曙);阿斯巴甜m/z=293
([M-Hp;紐甜m/z=377 ([M-Hp。
2.3標準曲線
分別取安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜單標工作溶 液，用超純水定容至lOmL，得到安賽蜜濃度為0.1pg/ml l.(Vg/ml;糖精鈉、 甜蜜素、紐甜濃度為0.05(ig/ml 1.0嗎/ml;三氯蔗糖、阿斯巴甜濃度為0.2嗎/ml l.Opg/ml的混合系列標準溶液。待儀器穩(wěn)定后，分別對系列混標工作溶液取10^1 進樣，作UPLC^MS檢測，以離子流的強度為縱坐標，樣品進樣量為橫坐標， 繪制標準曲線(或回歸方程)。
表l.六種甜味劑的線性方程與檢出限
待測組分線性范圍(mg/L)線性回歸方程線性相關系 數R2檢出限 Cmg/L)
安賽蜜O.卜l.Oy = 117.52x + 5,94530.99900.05
糖精鈉0.05 1.0y = 161.91x + 6.18250.99910.01
甜蜜素0.05 1.0y = 209.83x + 1.95210.99910.01
三氯蔗糖0.2 1.0y = 67細x -3.45600.99450.1
阿斯巴甜0.2 1.0y = 69.235x -1.02900.99970.1
紐甜0.05 1.0y = 603.84x -17.6230.99470.01
2.4樣品檢測
取100mL白酒樣品1利用旋轉蒸發(fā)器蒸脫酒中的揮發(fā)性物質，取10pL供 實驗進樣，利用2.1、 2.2中的條件進行檢測，獲得樣品色譜圖(圖14)、質譜圖 (圖15)。
3結果分析
由六種甜味劑標準品的色譜圖(圖7)可以看出，利用2.1、 2.2檢測條件得到 的六種甜味劑之一甜蜜素的保留時間為2.91min，樣品(圖14)中在2.89min處有一色譜峰與甜蜜素色譜峰保留時間相近，因此可以初步確定樣品色譜圖中
2.89min處的色譜峰為甜蜜素。再根據樣品在m/z-178處特征分子離子峰(圖15)， 與甜蜜素的特征分子離子峰相同(圖IO)，可進一步確定保留時間為2.89min的 組分為甜蜜素。
將樣品中甜蜜素的峰面積174.01mn^帶入甜蜜素線性回歸方程中，即可得 到此中白酒樣品中的甜蜜素濃度為0.82mg/L。通過六次平行實驗，此方法的檢 出限為0.01mg/L，回收率在96.73% 116.90 %之間，相對標準偏差為0.43%。 說明該品牌白酒違規(guī)添加了甜蜜素。
該結果與同時送至江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，利用毛細管 氣相色譜法分析獲得的數據"檢出甜蜜素"的實驗結果相比，該方法對樣品預 處理簡單不需要做衍生化處理，檢測靈敏度更高， 一次檢測所需時間更短，可 見方法更為先進。與現有文獻報道各種其他方法(高效液相一紫外檢測，超高 壓液相色譜一蒸發(fā)光散射檢測法、紫外分光光度法等)相比在檢測限、檢測速 度和同時檢測方面也都有很大的優(yōu)勢。
實例2市售某品牌白酒甜味劑檢測
用上述實例1大致相同的方法檢測了市售另一品牌白酒樣品，實例2中 預處理方法、色譜質譜條件、檢測儀器、標準曲線均參照實例l。
結果分析
由六種甜味劑標準品的色譜圖(圖7)可以看出，六種甜味劑之一糖精鈉的保 留時間為2.43min，樣品(圖16)中在2.41min處有一色譜峰與糖精鈉色譜峰保 留時間相近，因此可以初步確定樣品色譜圖(圖16)中2.41min處的色譜峰為 糖精鈉。再根據樣品在m/^182處特征分子離子峰(圖9)，與糖精鈉的特征分 子離子峰相同(圖17)，可進一步確定保留時間為2.41min的組分為甜蜜素。
將樣品中糖精鈉的峰面積177.97mi^帶入甜蜜素線性回歸方程中，即可得 到此中白酒樣品中的糖精鈉濃度為1.016 mg/L。通過六次平行實驗，此方法的檢 出限為0.01mg/L，回收率在93.55% 116.42 %之間，相對標準偏差為0.76%。 說明該品牌白酒違規(guī)添加了糖精鈉。
以上兩個實例說明本發(fā)明方法具有快速、簡便，定性、定量準確、靈敏度 高的優(yōu)點。
實例3市售某品牌白酒甜味劑檢測
用上述實例1大致相同的方法檢測了市售另一品牌白酒樣品，實例3中 預處理方法、色譜質譜條件、檢測儀器、標準曲線均參照實例l。結果分析
由六種甜味劑標準品的色譜圖(圖7)可以看出，六種甜味劑之中安賽蜜、糖 精鈉、甜蜜素的保留時間分別為1.75min、 2.43min、 2.91min，樣品(圖18)中 在1.73min、 2.43min、 2.91min的色譜峰可以初步判定為安賽蜜、糖精鈉、甜蜜 素三種甜味劑，再根據樣品在各自對應的保留時間處有m/z=162 (圖19)、 m/z=178、 m/z=182特征分子離子峰與三種甜味劑標準樣品中特征分子離子峰吻 合，可進一步說明保留時間在1.73min、 2.43min、 2.91min處的色譜峰分別為安 賽蜜、糖精鈉、甜蜜素這三種甜味劑。
分別將樣品中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素三者的峰面積82.45mm2、 154.65mm2、 129.18mm2帶入各自的線性回歸方程中，即可得到此中白酒樣品中安賽蜜、糖精 鈉、甜蜜素的濃度分別為0.651 mg/L、 0.917 mg/L、 0.645 mg/L。同樣通過六次 平行實驗，此方法安賽蜜檢出限為0.05mg/L，糖精鈉、甜蜜素檢出限都為0.01 mg/L，安賽蜜回收率在104.79% 113.40%之間，相對標準偏差為0.82%;糖精 鈉回收率在92.62% 99.79 %之間，相對標準偏差為0.90%;甜蜜素回收率在 93.73% 111.22%之間，相對標準偏差為2.45%。說明該品牌白酒違規(guī)添加了安 賽蜜、糖精鈉、甜蜜素三種甜味劑。
實例3說明本發(fā)明可以針對白酒中添加的多種甜味劑進行同時檢測，同樣 具有分辨率高、快速、準確等優(yōu)點，克服了其他檢測方法易對同時微量添加多 種甜味劑漏檢的缺點。
權利要求
1一種超高壓液相色譜-飛行時間質譜同時測定白酒中六種微量甜味劑的方法，其特征在于①利用物理或化學方法對白酒樣品進行預處理，脫除影響檢測的醇類物質；②采用超高壓液相為分離手段，以甲醇-乙酸銨水溶液為流動相，采用梯度洗脫的方式；③采用飛行時間質譜儀，以六種甜味劑的特征分子離子為監(jiān)測離子進行分析。
2 如權利要求1所述的一種超高壓液相色譜一飛行時間質譜同時測定白酒中六種微量甜味劑的方法，其特征在于可以同時對白酒中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜 素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜六種人工合成甜味劑進行檢測。
3 如權利要求1所述的一種超高壓液相色譜一飛行時間質譜同時測定白酒中六 種微量甜味劑的方法，其特征在于采用超高壓液相色譜與飛行時間質譜聯用 技術。
4 如權利要求1所述的一種超高壓液相色譜一飛行時間質譜同時測定白酒中六 種微量甜味劑的方法，其特征在于采用梯度洗脫，流動相A:甲醇，流動相B-20mmol/L乙酸銨溶液。初始A: B比例為(0:100)， 4minA: B比例為(30:70)， 6-8minA:B比例為(100:0)， 8min后A: B比例恢復到(0:100)。完成整個檢測過 程僅需10min。
5 如權利要求l所述的一種超高壓液相色譜一飛行時間質譜同時測定白酒中六 種微量甜味劑的方法，其特征在于使用超高壓液相色譜壓力可達到15000psi; 最佳流速0.3ml/min;色譜柱溫3CTC;進樣體積IO(IL。
6 如權利要求1所述的一種超高壓液相色譜一飛行時間質譜同時測定白酒中六 種微量甜味劑的方法，其特征在于使用飛行時間質譜儀最佳條件為毛細管電 壓2.5kV;錐孔電壓30V;二級錐孔電壓4V;離子能量1;Detector電壓1600V; 離子源溫度100。C;脫溶劑氣溫度25(TC;脫溶劑氣(N2)流量600L/h，錐孔 氣(N2)流量50L/h。
7 如權利要求l所述的一種超高壓液相色譜一飛行時間質譜同時測定白酒中六 種微量甜味劑的方法，其特征在于對樣品根據保留時間和六種甜味劑的特征 分子離子安賽蜜m/z=162 ([M-Kp;糖精鈉m/z=182 ([M-Nap;甜蜜素 m/z^78([M-Nap;三氯蔗糖m/z=395([M-Hp;阿斯巴甜m/z=293([M-H]'); 紐甜m/z=377 ([M-H]-)進行定性分子，根據外標法利用標準品繪制標準曲線 進行定量分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用超高壓液相色譜與飛行時間質譜聯用技術對白酒中六種微量甜味劑進行同時檢測的方法。尤為獨特的是該方法采用超高壓液相色譜—飛行時間質譜聯用(UPLC-TOF-MS)技術，特別針對目前白酒行業(yè)中多種甜味劑同時微量添加的現象。本發(fā)明不但可同時檢測安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜六種甜味劑，而且快速、簡便，定性、定量準確、靈敏度高，行之有效的解決了以上問題。本發(fā)明方法安賽蜜檢出限為0.05mg/L、糖精鈉、甜蜜素、紐甜檢出限為0.01mg/L、三氯蔗糖、阿斯巴甜檢出限為0.1mg/L，且一次進樣分析僅需10min，線性關系、重復性良好。經與權威部門檢測數據對比本發(fā)明方法檢測的數據同樣準確可靠。
文檔編號G01N30/00GK101634648SQ20091018478
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月21日 優(yōu)先權日2009年8月21日
發(fā)明者吳世嘉, 王洪新, 陶冠軍 申請人:江南大學