專(zhuān)利名稱(chēng)：肽-脂構(gòu)造及其在診斷和治療用途中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)表面表達(dá)的肽水平中實(shí)現(xiàn)性質(zhì)和數(shù)量改變的方 法，和用于這種方法的構(gòu)造。特別地，本發(fā)明涉及用于診斷和治療用途的肽-脂構(gòu)造，所述用途包括血清診斷。
背景技術(shù)：
在細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)表面表達(dá)的肽水平中實(shí)現(xiàn)性質(zhì)和數(shù)量改變的性能可供許多 診斷和治療之用。表面表達(dá)的肽水平的性質(zhì)和數(shù)量改變可以改變跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞_溶質(zhì)和細(xì)胞_細(xì) 胞相互作用，并由此改變?cè)摳男约?xì)胞或者多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能。已知的引起這種改變的方法包括基因操縱、內(nèi)源性膜肽的化學(xué)修飾和使用脂錨著 點(diǎn)如GPI的“細(xì)胞表面涂料”。國(guó)際申請(qǐng)PCT/NZ2005/000052(公開(kāi)號(hào)WO 2005/090368)的說(shuō)明書(shū)描述了水溶性 碳水化合物-脂構(gòu)造的制備，其用于在細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)表面表達(dá)的碳水化合物水平中實(shí) 現(xiàn)性質(zhì)和數(shù)量改變。國(guó)際申請(qǐng)PCT/NZ2005/000245(公開(kāi)號(hào)WO 2007/035116)的說(shuō)明書(shū)描述了另一種 制備水溶性碳水化合物-脂構(gòu)造的方法，其中該碳水化合物是透明質(zhì)酸聚合物。描述了該 構(gòu)造用于改變胚胎和促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞結(jié)合。相對(duì)少的工作已經(jīng)進(jìn)行于肽作為單一組分的位點(diǎn)導(dǎo)向耦合至磷脂，之后它們合并 入自組裝結(jié)構(gòu)如脂質(zhì)體，或者需要提供肽-脂結(jié)構(gòu)用于在細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)表面表達(dá)的肽 水平中實(shí)現(xiàn)性質(zhì)和數(shù)量改變的方法中。對(duì)于肽共價(jià)耦合至脂質(zhì)體表面，許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)已有描述。Martin等(1990)回顧了將包括肽的部分附著至脂質(zhì)體表面的方法。Blume等(1993)描述了用Kung和Redemann (1986)描述的方法將水溶性的Glu-血 纖蛋白溶酶原耦合至脂質(zhì)體?；瘜W(xué)物質(zhì)ECDia-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺 鹽酸酯)被用于在用Glu-血纖蛋白溶酶原培育活化脂質(zhì)體懸浮液之前激活脂質(zhì)體。提 供了 Glu-血纖蛋白溶酶原共價(jià)附著于二硬脂醇磷脂酰乙醇胺(DSPE)-PEG-COOH末端的 Proteo-PEG-包衣的脂質(zhì)體。Haselgrubler等(1995)描述了一種異型雙功能交聯(lián)劑，用于促進(jìn)免疫脂質(zhì)體的 制備。該交聯(lián)劑由聚(乙二醇)(PEG，平均分子量800道爾頓(ISmer))的二胺衍生物合成。 該交聯(lián)劑具有官能團(tuán)2-(吡啶基硫)丙?；?PDP)和N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)。Ishida等(2001)描述了帶有聚乙二醇耦合鐵傳遞蛋白的脂質(zhì)體的制備。鐵傳遞 蛋白通過(guò)DSPE-PEG-C00H的末端羧基殘基結(jié)合。該脂質(zhì)體被認(rèn)為在體內(nèi)化療劑或者質(zhì)粒 DNA胞漿靶向至靶細(xì)胞中具有效用。Massaguer等(2001)描述了肽序列(GGRGRS)和疏水性衍生物結(jié)合至化學(xué)活化脂 質(zhì)體的表面。該結(jié)合通過(guò)N-戊二酰二棕櫚?；字Ｄ憠A(NGPE)的羧基進(jìn)行。
Massaguer等(2001)記錄了考慮到可能的體內(nèi)用途，當(dāng)無(wú)菌和簡(jiǎn)易為某些首要需 求時(shí)，基于脂質(zhì)體表面上化學(xué)反應(yīng)，包括額外步驟的工藝可能較難擴(kuò)大化至工業(yè)水平。鑒定 了肽序列的疏水性衍生物，以提供用于結(jié)合至脂質(zhì)體表面的優(yōu)化性質(zhì)。Chimg等(2004)描述了合并入細(xì)胞膜的DOPE-PEG的抗原決定簇屏蔽效應(yīng)，并推測(cè) 了脂質(zhì)-PEG (n) (s)調(diào)節(jié)生物細(xì)胞響應(yīng)的可能性，以及延伸此概念以在PEG鏈尾端引入官能 分子。Kato等(2004)描述了一種用于錨定高分子蛋白進(jìn)入活哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的方法。 與親水性聚(乙二醇)(PEG 80)偶合的二油醇磷脂酰乙醇胺(DOPE)被用作合成膜錨。肽 通過(guò)合成膜錨的氨基反應(yīng)的N-羥基琥珀酰亞胺衍生物結(jié)合在PEG部分的末端。PEG80部分促進(jìn)該合成膜錨在水中的溶解。Kato等(2004)記錄了如果該錨不溶 于水，不合需要和復(fù)雜化的工藝如脂質(zhì)體制備和用該細(xì)胞膜融合脂質(zhì)體可能是需要的，以 錨定軛合物入細(xì)胞膜。Kato等記錄的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是具有高親水_親油平衡值(歸因于高氧乙烯單元數(shù) 的PEG間隔團(tuán))的合成膜錨推斷為不具有細(xì)胞溶解活性。然而，在使用包括高氧乙烯單元 數(shù)的PEG間隔團(tuán)的合成膜錨中出現(xiàn)困難。首先，共軛肽或者其它內(nèi)源性細(xì)胞表面肽的表達(dá)可能被PEG間隔團(tuán)屏蔽。其次，高 氧乙烯單元數(shù)的PEG間隔團(tuán)可能引起蛋白質(zhì)(包括某些個(gè)體的抗體)的非特異性粘附和/ 或補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的非特異性活化。Winger等(1996)描述了溴乙?；疍SPE與硫醇結(jié)尾的十肽的共軛結(jié)合，所述十肽 在其C-末端包括極小人凝血酶-受體肽激動(dòng)劑(HS-—SerPheLeuLeuArgAsn)。Hashimoto等(1986)描述了碘乙?；疍SPE與硫醇化化合物的共軛結(jié)合。需要有一種肽-脂構(gòu)造，可用于在細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)表面表達(dá)的肽水平中實(shí)現(xiàn)性 質(zhì)和數(shù)量改變。本發(fā)明一個(gè)目的在于，提供滿(mǎn)足此需要的肽_脂構(gòu)造，或者至少提供一種有用的 選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面提供了一種檢測(cè)受試者血清中的反應(yīng)抗體的方法，包括步驟 將血清樣品與細(xì)胞懸浮液接觸以提供一種混合物，所述細(xì)胞經(jīng)過(guò)改性而合并結(jié) 構(gòu)為(L-S-) ,F (-S-L) j的肽-脂構(gòu)造； 在足夠容許凝集的溫度培育該混合物一段時(shí)間；和 測(cè)定該混合物中細(xì)胞的凝集度；其中F是包括用于反應(yīng)性抗體的抗原決定簇的肽；S是共價(jià)連接F至L的間隔團(tuán)；和L是選自二?；鵢甘油酯或二烷基-甘油酯的脂質(zhì)，包括甘油磷脂；和I和j各自為0或者1，任選地，該方法包括預(yù)備步驟 添加一定量的該肽至該血清的樣品；
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其中該肽的量足夠中和非特異凝集或者證實(shí)該反應(yīng)性抗體的特異性。任選地，該方法包括中間步驟 在測(cè)定該混合物的細(xì)胞凝集度之前，添加抗_受試者球蛋白抗體至混合物。優(yōu)選地，受試者是人類(lèi)。優(yōu)選地，該細(xì)胞是紅血球。優(yōu)選地，該抗-受試者球蛋白抗體是抗_人類(lèi)球蛋白(AHG)抗體。優(yōu)選地，該反應(yīng)性抗體相對(duì)于抗原呈反應(yīng)性，所述抗原選自血型糖蛋白A，血型 糖蛋白B，或者其突變體(包括麗S血型系統(tǒng))。選擇間隔團(tuán)⑶，以提供水溶性的肽_脂構(gòu)造。優(yōu)選地，S是通過(guò)乙二醇的低聚物共價(jià)連接F至L的間隔團(tuán)。優(yōu)選地，該肽-脂構(gòu)造的結(jié)構(gòu)包括亞結(jié)構(gòu)
其中M是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，η是6至14，且*不為H。 更優(yōu)選地，該肽_脂構(gòu)造的結(jié)構(gòu)是
(Xaa)xCys(Xaa).或者 其中M是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，η是6至14，w是1或者2，χ和y的和大于5，ζ大于 5，且*不為H。優(yōu)選地，i和j之和為1。任選地，F(xiàn)是肽，包括經(jīng)過(guò)選擇以促進(jìn)該肽溶解度的近端序列(PTS)。在一個(gè)優(yōu)選的此方案中，該肽的PTS選自下組
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SerLysLysLysLysGlyAlaAlaAlaAlaGlySerGlySerGly優(yōu)選地，F(xiàn)是包括抗原的抗原決定簇的肽，所述抗原選自血型糖蛋白A，血型糖蛋 白B，或者其突變體(包括麗S血型系統(tǒng))。更優(yōu)選地，F(xiàn)是選自肽目錄的肽。
最優(yōu)選地，F(xiàn)是選自下組的肽GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCysGlnThrAsnAspLysHisLysArRAspThrTyrGlySerGlySerGlyCysGlnThrAsnAspMetHisLysArRAspThrTyrGlySerGlySerGlyCysSerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArRAspThrTyrCysThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCisProAlaHisThrAlaAsnGluValCysSerGlnThrAsnAspLysHisLysArrAspCysAlaAlaAlaAlaValMetTyrAlaSerSerGlyGlySerGlySerGlyValMetTyrAlaSerSerGly優(yōu)選地，L是甘油磷酯。更優(yōu)選地，L是選自下組的甘油磷酯1，2-0_ 二油酰 基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2_0_ 二硬脂?；?sn-丙三氧基_3_磷酯 酰乙醇胺(DSPE)。優(yōu)選地，該肽_脂構(gòu)造是本發(fā)明第二或者第三方面的示范性實(shí)施方式。本發(fā)明第二方面提供一種肽_脂構(gòu)造，其結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)-S-F其中F 是肽；S是通過(guò)乙二醇低聚物共價(jià)連接F至L的間隔團(tuán)；和L是脂，選自二酰基_甘油酯和二烷基_甘油酯組成的組，包括甘油磷脂。優(yōu)選地，該肽-脂構(gòu)造的結(jié)構(gòu)包括亞結(jié)構(gòu) 其中M是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，η是6至14，且*不為H。任選地，F(xiàn)是肽，包括經(jīng)過(guò)選擇以促進(jìn)該肽溶解度的近端序列(PTS)。在一個(gè)優(yōu)選的此方案中，該肽的PTS選自下組SerLysLysLysLysGlyAlaAlaAlaAlaGlySerGlySerGly
優(yōu)選地，該肽的末端序列選自下組GlyLysLysLysLysSerCysAlaAlaAlaAlaCysGlySerGlySerGlyCysCysSerLysLysLysLysGlyCysAlaAlaAlaAlaCysGlySerGlySerGly優(yōu)選地，S通過(guò)該肽的&殘基形成的硫醚鍵共價(jià)連接至F。更優(yōu)選地，S在該肽的未端或者接近末端處通過(guò)該肽的殘基形成的硫醚鍵共 價(jià)連接至F。最優(yōu)選地，S在該肽的羧基未端通過(guò)該肽的殘基形成的硫醚鍵連接至F。間隔團(tuán)⑶具有結(jié)構(gòu)S1-S2-S3,且經(jīng)過(guò)選擇以提供水溶性的肽_脂構(gòu)造。S1是乙二 醇的低聚物。
優(yōu)選地，S2-S3選自下組


其中R1是S1的未端碳，R2是M殘基的硫，且W是1或者2。 優(yōu)選地，該肽_脂構(gòu)造的結(jié)構(gòu)為
(Xaa)xCys(Xaa)y
其中M是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，η是6至14，w是1或者2，χ和y之和大于5，且*不 為H。更優(yōu)選地，η是6。最優(yōu)選地，y是0。優(yōu)選地，F(xiàn)是包括抗原的抗原決定簇的肽，所述抗原選自血型糖蛋白A，血型糖蛋 白B，或者其突變體(包括麗S血型系統(tǒng))。更優(yōu)選地，F(xiàn)是選自肽目錄的肽。最優(yōu)選地，F(xiàn)是選自下組的肽GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCysGlnThrAsnAspLysHisLysArRAspThrTyrGlySerGlySerGlyCysGlnThrAsnAspMetHisLysArRAspThrTyrGlySerGlySerGlyCysSerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArRAspThrTyrCys
ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCisProAlaHisThrAlaAsnGluValCysSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspC^s優(yōu)選地，L是甘油磷酯。更優(yōu)選地，L是選自下組的甘油磷酯1，2-0_ 二油酰 基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2_0_ 二硬脂酰基-sn-丙三氧基_3_磷酯 酰乙醇胺(DSPE)。


)。
本發(fā)明第二方面的第一示范性實(shí)施方式提供了一種肽-脂構(gòu)造，具有下列結(jié)構(gòu)
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCy^
O, OO
CH3 (CH2) 7CHCH (CH2)s
O JOM6^^
CH3 (CH2)7CHCH(CH2)O
O
其中 M是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，該構(gòu)造命名為 DOPE-PEG6-β Ala-Mal-PTS-IMUTK) (Ml) 本發(fā)明第二方面的第二示范性實(shí)施方式提供了一種肽-脂構(gòu)造，具有下列結(jié)構(gòu)
GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys
OO0
CH3 (CH2)7CHCH (CH2) 3丫0^^。_^0_^Nf^(o^^NH^^ir
、OyOM
CH3 {CH2) 7CHCH (CH2) 3-η/0O
O
其中 M是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，該構(gòu)造命名為 DOPE-PEG6-β Ala-Mal-PTS-2MUTK) (M2) 本發(fā)明第二方面的第三示范性實(shí)施方式提供了一種肽-脂構(gòu)造，具有下列結(jié)構(gòu)
GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCy^
O
O
八NH
、O >OM
CH3 {CH2) 7CHCH {CH2) 3 γ0
CH3 (CH2) 7CHCH (CH2)
3Y
O
其中M是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，該構(gòu)造命名為DOPE-PEG6-β Ala-Mal-PTS-3MUTK(M3) 本發(fā)明第二方面的第四示范性實(shí)施方式提供了一種肽-脂構(gòu)造，具有下列結(jié)構(gòu)
SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCy^
〇O
CH3 (CH2) ,CHCH(CH2) 3丫一^^…^^^^^^/^” O^OM
CH3 {CH2) 7CHCH (CH2) 3丫0υ
O
其中 M 是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，該構(gòu)造命名為 DOPE-PEG6-β Ala-Mal-PTS-13MUTK(M13 本發(fā)明第二方面的第五示范性實(shí)施方式提供了一種肽-脂構(gòu)造，具有下列結(jié)構(gòu)
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其中M 是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，該構(gòu)造命名為 DOPE-PEG6-P Ala-Mal_PTS-18Mur(M18) (η = 6)。本發(fā)明第二方面的第六示范性實(shí)施方式提供了一種肽-脂構(gòu)造，具有下列結(jié)構(gòu) 其中M 是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，該構(gòu)造命名為 DOPE-PEG6-P Ala-Mal-PTS-2IMUTK (Μ21 )(η = 6)。本發(fā)明第二方面的第七示范性實(shí)施方式提供了一種肽-脂構(gòu)造，具有下列結(jié)構(gòu) 其中M 是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，該構(gòu)造命名為 DOPE-PEG6-β Ala-Mal-Hi 13 (M23) (η = 6)。本發(fā)明第二方面的第八示范性實(shí)施方式提供了一種肽-脂構(gòu)造，具有下列結(jié)構(gòu) 其中M 是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，該構(gòu)造命名為 DOPE-PEG6- β Ala-Mal-PTS-Milt (K, Μ)本發(fā)明第二方面的第九示范性實(shí)施方式提供了一種肽-脂構(gòu)造，具有下列結(jié)構(gòu) 其中M 是一價(jià)陽(yáng)離子(Μ+)，該構(gòu)造命名為 DOPE-PEG6-0Ala-Mal-Milt(K) (MOO),本發(fā)明第二方面的第十示范性實(shí)施方式提供了一種肽-脂構(gòu)造，具有下列結(jié)構(gòu) 其中M 是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，該構(gòu)造命名為 DOPE-PEG6- β Ala-Mal-Milt (M)。本發(fā)明第二方面的第十一示范性實(shí)施方式提供了一種肽_脂構(gòu)造，具有下列結(jié)
構(gòu)
其中M是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，該構(gòu)造命名為DOPE-PEG6- β Ala-Mal-Milt (K，Μ)。
本發(fā)明第三方面提供一種肽-脂構(gòu)造，具有下列結(jié)構(gòu)
L-S-F
其中
F是肽；
S是通過(guò)乙二醇低聚物共價(jià)連接F至L的間隔團(tuán)；和 L是脂，選自二?；鵢甘油酯和二烷基_甘油酯組成的組，包括甘油磷脂。 優(yōu)選地，該肽_脂構(gòu)造的結(jié)構(gòu)為
其中M是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，n是6至14，ζ大于5，且*不為H。更優(yōu)選地，η是14t 任選地，F(xiàn)是肽，包括經(jīng)過(guò)選擇以促進(jìn)該肽的溶解度的末端序列。
在一個(gè)優(yōu)選的此方案中，該肽的末端序列選自下組SerLysLysLysLysGlyAlaAlaAlaAlaGlySerGlySerGly優(yōu)選地，F(xiàn)是選自下組的肽(Xaa) ,ValMetTyrAlaSerSerGly ；其中ζ是整數(shù)4，5或者6。優(yōu)選地，F(xiàn)是選自下組的肽SerLysLysLysLysGlyValMetTyrAlaSerSerGlyAlaAlaAlaAlaValMetTyrAlaSerSerGlyGlySerGlySerGlyValMetTyrAlaSerSerGly優(yōu)選地，L是甘油磷酯。更優(yōu)選地，L是選自下組的甘油磷酯1，2-0_ 二油酰 基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2_0_ 二硬脂?；?sn-丙三氧基_3_磷酯 酰乙醇胺(DSPE)。本發(fā)明第三方面的第一示范性實(shí)施方式提供了一種肽-脂構(gòu)造，具有下列結(jié)構(gòu) 其中M是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，該構(gòu)造命名為DOPE-PEG14-Sypht5本發(fā)明第四方面提供一種制備本發(fā)明第二方面的肽-脂構(gòu)造(F-S-L)的方法，包 括步驟 通過(guò)將馬來(lái)酰亞胺基供體試劑與結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)-S1-NH2的前體構(gòu)造反應(yīng)，制備前體構(gòu) 造的馬來(lái)酰亞胺基衍生物；和 將該前體構(gòu)造的馬來(lái)酰亞胺基衍生物與包括Cys殘基且溶解于溶劑中的肽(F) 反應(yīng)。其中L是脂，選自二酰基_甘油酯和二烷基_甘油酯組成的組，包括甘油磷脂；和S1選自乙二醇的低聚物組成的組。優(yōu)選地，該肽-脂構(gòu)造的結(jié)構(gòu)為 其中η是6至14，w是1或者2，χ和y之和大于5，且*不為H。優(yōu)選地，該馬來(lái)酰亞胺基供體試劑選自下組馬來(lái)酰亞胺丁酸的N-氧琥珀酰亞胺 酯；和馬來(lái)酰亞胺丙酸的N-氧琥珀酰亞胺酯。優(yōu)選地，S1是乙二醇的低聚物，選自6至14mer PEG (PEG6至PEG14)組成的組。最 優(yōu)選地，S1是PEG6。優(yōu)選地，該溶劑選自下組三氟乙醇；DMSO ；或者其混合物。優(yōu)選地，該Cys殘基是末端Cys殘基。任選地，F(xiàn)是肽，包括經(jīng)過(guò)選擇以促進(jìn)該肽在反應(yīng)溶劑中溶解度的近端序列 (PTS)。在一個(gè)優(yōu)選的此方案中，該肽的PTS選自下組SerLysLysLysLysGlyAlaAlaAlaAlaGlySerGlySerGly優(yōu)選地，該肽的末端序列選自下組GlyLysLysLysLysSerCysAlaAlaAlaAlaCysGlySerGlySerGlyCysCysSerLysLysLysLysGlyCysAlaAlaAlaAlaCisGlySerGlySerGly優(yōu)選地，F(xiàn)是選自肽目錄的肽。優(yōu)選地，F(xiàn)是選自下組的肽GlnThrAsnAspLysHisLysArRAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCysGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCysGlnThrAsnAspMetHisLysArRAspThrTyrGlySerGlySerGlyCysSerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrCysThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCysProAlaHisThrAlaAsnGluYalCysSerGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspCys優(yōu)選地，L是甘油磷酯。更優(yōu)選地，L是選自下組的甘油磷酯1，2-0_ 二油酰 基-sn-丙三氧基-3-磷酯酰乙醇胺(DOPE)和1，2_0_ 二硬脂?；?sn-丙三氧基_3_磷酯 酰乙醇胺(DSPE)。本發(fā)明的第五方面提供了一種在細(xì)胞和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)表面表達(dá)的肽水平中實(shí)現(xiàn)性 質(zhì)和數(shù)量改變的方法，包括步驟 將該細(xì)胞或者多細(xì)胞結(jié)構(gòu)與本發(fā)明第二或者第三方面的肽-脂構(gòu)造的某一濃 度的溶液接觸，接觸時(shí)間和溫度足以容許該構(gòu)造合并入該表面。優(yōu)選地，該肽-脂構(gòu)造是本發(fā)明第二方面的構(gòu)造。優(yōu)選地，該細(xì)胞或者多細(xì)胞結(jié)構(gòu)選自下組紅血細(xì)胞；和胚胎。更優(yōu)選地，該細(xì)胞 或者多細(xì)胞結(jié)構(gòu)是人類(lèi)細(xì)胞或者多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選地，該時(shí)間和溫度不大于37°C下2小時(shí)或者4°C下24小時(shí)。本發(fā)明的所有方面中，M典型地為H，但是可以被另一種一價(jià)陽(yáng)離子例如Na+，K+或 者NH4+取代。在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，以下縮寫(xiě)、短語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)具有下列含義“診斷標(biāo)記物”指一種分子，其在受試者體液中的存在對(duì)于受試者的顯型或者病理 性狀況有診斷意義?！癕NS血型系統(tǒng)”指血型抗原或者那些抗原和突變體的抗原決定簇，其存在于任何 一種血型糖蛋白A、血型糖蛋白B或者導(dǎo)致血型糖蛋白A/B雜化的突變體之上。“近端序列”指鄰近該肽(F)的氨基_或者羧基_未端的一部分肽序列?！?RBC ”指紅血細(xì)胞?！胺磻?yīng)性抗體”指一種免疫球蛋白，其在受試者體液中的存在對(duì)于受試者的顯型或 者病理性狀況有診斷意義?！巴ㄟ^(guò)乙二醇的低聚物”指由2至32mer組成的乙二醇的聚合物，特別排除通過(guò)由 大于32mer組成的乙二醇的聚合物?！八苄缘摹敝冈诓淮嬖谟袡C(jī)溶劑或者洗滌劑的情況下，該構(gòu)造與水或者鹽水(例 如PBS)在至少100yg/ml的濃度接觸時(shí)，形成穩(wěn)定的單相系統(tǒng)，短語(yǔ)“水可分散的”具有相 同含義。參考隨附的圖頁(yè)中的附圖，以下將詳細(xì)描述本發(fā)明的示范性實(shí)施方式。


圖 1、命名為 DOPE-PEG6-β Ala-Mal-Milt(K) (Μ13)的肽-脂構(gòu)造的1H-WR譜(5mg/ ml 于 CD30D/CDCl3/D20/0· 5M CF3COOD 60/20/10/1 中，600MHz，30°C，δ ppm)。圖 2、命名為 DOPE-PEG6-P Ala-Mal-Milt(K) (M13)的肽-脂構(gòu)造的 MALDI TOF 質(zhì)譜 (2856 肽-D0PE(M+H) ；2878 肽-DOPE(M+Na) ；2894 肽-DOPE(M+K) ；2900 肽 _D0PE(M+Na， Na 鹽)；2916 肽-DOPE (M+K，Na 鹽))。圖 3、命名為 DOPE-PEG6-P Ala-Mal-Milt(K) (M13)的肽-脂構(gòu)造的肽 SerSerGlnT hrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCis 的 ESI 質(zhì)譜和 HPLC 分析。圖 4、命名為 DOPE-PEG6-P Ala-Mal-Milt(K) (M13)的肽-脂構(gòu)造的肽 SerSerGlnT hrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCis 的 1H-NMR 譜(4. 5mg/ml 于 D2O 中， 600MHz, 30 °C, δ ppm)。圖5、通過(guò)將胚胎與M2肽-脂構(gòu)造分散體在lmg/ml濃度接觸2小時(shí)，以合并該構(gòu) 造而改性的無(wú)透明帶(zona free)胚胎的顯微照片。上面的顯微照片是DIC圖像。下面的 顯微照片是熒光圖像，顯示3. 0+熒光性。發(fā)明詳述總體而言，本發(fā)明提供具有結(jié)構(gòu)(L-S-hFGS-Dj的肽-脂構(gòu)造，其中F 是肽； S是共價(jià)連接F至L的間隔團(tuán)；L是脂，選自二?；鵢甘油酯和二烷基_甘油酯組成的組，包括甘油磷脂；i和j各自是0或者1;
以及這些肽_脂構(gòu)造在診斷和治療用途中的應(yīng)用。當(dāng)i是0，j是1時(shí)，該肽-脂構(gòu)造具有結(jié)構(gòu)F-S-L當(dāng)i是1，j是0時(shí)，該肽-脂構(gòu)造具有結(jié)構(gòu)L-S-F當(dāng)S通過(guò)該肽的氨基未端連接至F時(shí)，該構(gòu)造由結(jié)構(gòu)或者亞結(jié)構(gòu)L-S-F表示。當(dāng)S通過(guò)該肽的羧基未端連接至F時(shí)，該構(gòu)造由結(jié)構(gòu)或者亞結(jié)構(gòu)F-S-L表示。當(dāng)S通過(guò)由該肽的Cys殘基的巰基形成的硫醚鍵連接至F時(shí)，該殘基以加下劃線 識(shí)別(Qis)。當(dāng)S通過(guò)由該肽的一個(gè)或多個(gè)Cys殘基形成的硫醚鍵連接至F時(shí)，由結(jié)構(gòu) L-S-F-S-L，L-S-F或者F-S-L表示的該肽-脂構(gòu)造不意味著硫醚鍵唯一地由末端Cys殘基 形成。參照包括以下亞結(jié)構(gòu)的構(gòu)造的應(yīng)用，說(shuō)明了該肽_脂構(gòu)造在診斷用途中的應(yīng)用 其中M是一價(jià)陽(yáng)離子(M+)，n是6至14，*不為H。該肽選自由肽目錄所含的肽組 成的肽組，其提供于下文中，其中ζ是從0至6的整數(shù)。
根據(jù)2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月11日
發(fā)明者克里斯蒂娜-西蒙娜·溫伯格, 尼喬萊·博溫, 斯蒂芬·邁克爾·亨利 申請(qǐng)人:科德生物工程有限公司