專利名稱：無框多重微陣列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于分子的定量檢測的新穎測定方法和組合物。一方面，本發(fā)明涉及 用于產(chǎn)生對于分子的定量檢測有用的無框陣列的方法。另一方面，本發(fā)明涉及檢測分子相 互作用的方法。又另一方面，本發(fā)明涉及對于分子相互作用的檢測有用的器件。還另一方 面，本發(fā)明涉及用于檢測分子相互作用的試劑盒。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)使增殖、代謝、生長和程序性死亡許多細胞最基本功能變得容易。蛋白質(zhì)的 研究有助于我們理解幾乎所有的細胞活動，包括轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、翻譯、剪接、分泌、細胞周期控 制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞構(gòu)造。由于細胞生物學(xué)的到來，已有對蛋白質(zhì)的存在和結(jié)構(gòu)及功能的 系統(tǒng)分析，這增加了對蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物如何在細胞中發(fā)揮功能的理解。在過去的幾 年中，已通過人類基因組和蛋白質(zhì)組計劃識別了數(shù)以千計的新的蛋白質(zhì)序列和翻譯后的變 體。蛋白質(zhì)的這種巨大成功已經(jīng)急速推進理解基于蛋白質(zhì)的調(diào)控，但是也對研究者尋找更 好的生物物理學(xué)方法來定量檢測蛋白質(zhì)標(biāo)志物提出挑戰(zhàn)。更好的多重、定量、高通量的方法 將幫助我們理解蛋白質(zhì)標(biāo)志物與細胞功能之間的關(guān)聯(lián)。對于每個實驗?zāi)墚a(chǎn)生數(shù)以千計的蛋 白質(zhì)檢測數(shù)據(jù)點的廉價、小型化、多重、高通量的測定法存有需求。蛋白質(zhì)是氨基酸的線性聚合物；一級序列由20個氨基酸的實際順序限定。翻譯后 的修飾例如磷酸化、甲基化、乙?；?、酰胺化和糖基化產(chǎn)生了非常大數(shù)目的蛋白質(zhì)變體。其 他的蛋白質(zhì)修飾機制例如泛素化、蘇素化或ISG化(ISGylation)產(chǎn)生支鏈的各種蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)。蛋白質(zhì)可以在部分氨基酸聚合物中展現(xiàn)出局部化折疊(二級結(jié)構(gòu))，例如a螺旋或3 片層。蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是遍及整個分子的折疊模式，它限定了三維形狀。蛋白質(zhì)功能與 其三級結(jié)構(gòu)有關(guān)，并且這種關(guān)系是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的核心原則。當(dāng)一種分離的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi) 和細胞外保持相同的三級結(jié)構(gòu)時，就說該蛋白質(zhì)處于其天然構(gòu)象中。測定法已經(jīng)開發(fā)出幾種形式的多重蛋白質(zhì)測定法，其中每份樣品能夠檢測出多種分析 物，這些測定法包括(1)微珠；(2)在平面上的陣列；(3)在三維表面上的陣列例如硝化纖 維素和水凝膠；以及(4)在微板孔中的陣列。這些形式中的每一個都具有對于特定應(yīng)用的 缺點。一些共同的缺點包括高成本的測定設(shè)備和試劑、對可能是多重的分析物數(shù)目的限制、 在高通量模式中不能進行多重性以及用于研發(fā)每種測定法的定制時間和費用。一些測定方 法適合于處理小樣品數(shù)目研究數(shù)千種不同蛋白質(zhì)的大的蛋白質(zhì)組項目，而其他方法更適于 處理來自數(shù)千樣品的僅僅幾十種蛋白質(zhì)。已將許多檢測模式并入到蛋白質(zhì)陣列中，包括比色、熒光、放射性和無標(biāo)記的方法。檢測方法的選擇取決于所需的統(tǒng)計質(zhì)量(準(zhǔn)確度、精密度、定量的限度等)、測驗樣品中 的背景和建立測定法和進行分析測量能負擔(dān)得起的儀器裝備的可用性。最普遍的蛋白質(zhì)檢測測定法之一是能夠以許多方式設(shè)置的免疫測定法。最普遍的 三種形式是(1)單一抗體陣列；(2)雙(匹配的)抗體陣列；和(3)抗原陣列。單一抗體 陣列和抗原陣列可以同幾百種分析物復(fù)合使用，但是在特異性、靈敏度和定量上不同。通常 這些測定法被設(shè)計為半定量的(例如比率計量的)。雙抗體測定法能夠給出高質(zhì)量的定量 數(shù)據(jù)但是在多重性上受到能夠被識別的匹配抗體對的數(shù)目的限制。由于用當(dāng)前方法篩選匹 配的抗體對所包含的時間，開發(fā)雙抗體測定法可能是昂貴的。在免疫測定法的一種形式夾心ELISA中，捕獲分析物的捕獲抗體與固體表面結(jié)合 并且該表面用一種非特異性試劑封閉。加入含有分析物的樣品，用緩沖液洗滌捕獲的分析 物，并加入第二(檢測)抗體，該第二抗體識別不同于第一抗體結(jié)合位點的該分析物的一部 分。然后通過各種方法直接或間接檢測該第二抗體。在另一種形式的免疫測定法中，捕獲 抗體被結(jié)合在表面上。接下來，用一種非特異性試劑封閉該表面，并且加入含有標(biāo)記的分析 物的樣品。最后，用緩沖液洗滌捕獲的分析物并且直接或間接檢測標(biāo)記的分析物。在又另 一種形式的免疫測定法中，分析物被結(jié)合在表面并且用非特異性試劑封閉。然后加入含有 抗體的樣品，例如血清。接下來，用緩沖液洗滌捕獲的抗體并且直接或間接檢測該抗體。在一些測定法中，可檢測的部分可被安置在該測定法的許多組分上，包括分析物。 例如，可以將熒光測定法設(shè)計為使得一種或多種測定組分被熒光標(biāo)記并且各種熒光特性被 測量。這些包括涉及熒光強度、熒光壽命、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、熒光偏振(各向異性)和時間 分辨熒光的測定法。免疫測定法的動態(tài)范圍可以大于1000，并且檢出限不同，但是蛋白質(zhì)檢 測的普遍下限是大約l-10pg/ml的分析物。已經(jīng)對于不同的樣品提取方案修改免疫測定法 并且已利用許多不同的天然和合成的表面。其他的檢測方式在Reviews in Fluorescence 2004 (Chris D，Geddes 和 Jos印h R, Lakowicz)中評述。免疫測定法通常用于檢測來自各種來源的蛋白質(zhì)，所述來源包括病毒、朊病毒、細 菌、真菌以及植物或動物的液體、細胞或組織。蛋白質(zhì)的來源不為免疫測定法所限但是在許 多情況中，蛋白質(zhì)在其能使用之前被提取并且被部分地純化。已開發(fā)了許多不同的提取方 法，包括物理方法例如凍融循環(huán)、超聲處理、高溫或高壓(弗氏壓碎器)處理、或者玻璃珠渦 旋。其他方法采用化學(xué)或生物化學(xué)的方法，例如去污劑破壞、酶溶解或產(chǎn)生一種強還原的環(huán) 境。通常，提取方法結(jié)合物理處理和化學(xué)處理二者的組合。在最初的處理之后，通常采用分 離步驟例如離心、磁性粒子分離、相分離或沉淀反應(yīng)以進一步使樣品澄清用于檢測。針對所有的多重陣列都存在若干限制，不論它們是在珠上、在微板的孔中或是在 平面或三維的載玻片上。對于微板孔中的陣列而言，很難發(fā)現(xiàn)能夠?qū)⒏邤?shù)目的蛋白質(zhì)斑點 以及時的方式沉積到孔底的穩(wěn)健陣列方法。微板孔中的陣列檢測方法通常是通過化學(xué)發(fā) 光；因此斑點不能被分隔得像熒光檢測中一樣緊密在一起。在96孔微板中，大樣本體積也 可能是限制因素。384孔微板需要更少的樣品但是更少的分析物能夠被排列在孔底中。對 于所有的多重免疫測定法來說，尋找如下抗體是有重要意義的并且是昂貴的挑戰(zhàn)示出可 接受的靈敏度和特異性而不與其他抗體交叉反應(yīng)的抗體。可將大量的蛋白質(zhì)斑點排列在陣列載玻片上，但是有必要將一個孔成形器(框) 附加在每個載玻片上以保持樣品分離(見

圖1)。典型地，將16孔框附加在標(biāo)準(zhǔn)的(25mm X75mm)玻璃載玻片上。實質(zhì)上，這從排列的載玻片產(chǎn)生了臨時的16孔微板?？虮仨毦o密封 閉這樣在各孔之間沒有滲漏?？梢迫サ某煽卓虻氖褂孟拗屏四軌蚪Y(jié)合在基質(zhì)玻璃上的蛋白 質(zhì)結(jié)合材料的類型。如果蛋白質(zhì)結(jié)合材料太厚且多孔，密封將不會在兩孔之間形成。相反， 薄層的蛋白質(zhì)結(jié)合材料能夠提供密封但是通常受較低的蛋白質(zhì)結(jié)合能力限制。此外，框還 必須在掃描載玻片或使載玻片成像之前移去，這通常可能是挑戰(zhàn)性的，因為重要的是確保 容納固定化蛋白質(zhì)的材料沒有與框一起被移去。已經(jīng)開發(fā)了基于珠的檢測系統(tǒng)以允許同時分析幾種分析物。被LUMINEX(LumineX Corp.，Austin, TX)商品化的多重珠陣列形式稱為xMAP系統(tǒng)，它使用抗體涂覆的有色乳膠 顆粒來捕獲分析物，然后通過第二標(biāo)記抗體進行檢測。每個唯一的有色珠具有不同的捕獲 抗體，允許幾個珠的混合物。顆粒被引導(dǎo)通過流式細胞儀，所述流式細胞儀基于珠的顏色 (熒光)識別顆粒并且測量與那個珠相關(guān)聯(lián)的檢測抗體的熒光。本方法的一個缺點是當(dāng)捕 獲抗體被共價地固定在乳膠珠上時它們有時是失活的。此外，該測定法仍需要大的、有時過 量的樣品體積。這個系統(tǒng)的局限也在于能夠被復(fù)合的測定的數(shù)目僅僅是幾十個。檢測方法用于檢測表面上的蛋白質(zhì)的三種普遍的方法是ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、 FIA(熒光免疫測定)和SPR(表面等離子共振)。在ELISA中的比色檢測使用酶并且使用 比色的酶底物，所述酶為例如與檢測抗體結(jié)合的堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。這些結(jié)合 酶還可以使用化學(xué)發(fā)光底物。sra不需要蛋白質(zhì)加標(biāo)記但它確實需要蛋白質(zhì)固定；它是對 于直接的捕獲抗體或抗原的測定法適合的技術(shù)。然而，還沒有將該技術(shù)充分開發(fā)用于多重 微陣列。熒光檢測已是DNA陣列技術(shù)的主要依靠，并且存在能夠檢測來自玻璃載玻片或其 他表面上的非常小的排列斑點的熒光的幾種商品化儀器。所述儀器大多數(shù)具有2個熒光激 發(fā)激光，典型地是532nm和635nm，其旨在激發(fā)(和檢測)花菁3 (Cy3)和花菁5 (Cy5)熒光 標(biāo)記。這些儀器還能夠掃描載玻片用于熒光的、定量的蛋白質(zhì)的檢測。此外，正在引入如下 新儀器其不僅檢測更高波長的染料(在更高的波長有較少的來自生物樣品和表面的熒光 背景)而且檢測新的板形式例如75x125mm板。正引入新穎的熒光標(biāo)記和加標(biāo)記的技術(shù)用于蛋白質(zhì)陣列。MolecularProbes/ Invitrogen (Carlsbad, CA)具有眾多熒光染料，這些染料具有對于加標(biāo)記的蛋白質(zhì)、加標(biāo) 記的第二抗體和加標(biāo)記的親和結(jié)合蛋白(例如抗生蛋白鏈菌素)的各種反應(yīng)基團。此 外，它們具有可被連接至蛋白質(zhì)用于親和性結(jié)合的非常小(亞微米)的熒光乳膠顆粒。 Dyomics GmbH (Jena, Germany)與 Pierce Biotechnology (Rockford, IL)合作已經(jīng)開發(fā) 了自己的高反應(yīng)性熒光染料的路線，該染料范圍是紅外波長(700nm到800nm)。LI-C0R Biosciences (Omaha, NE)已經(jīng)開發(fā)了與其成像系統(tǒng)(ODYSSEY和AERIUS)相對應(yīng)的紅外染 料，所述成像系統(tǒng)聚焦于體內(nèi)方法學(xué)。基于蛋白質(zhì)的熒光分子例如R-藻紅蛋白和藻膽體 (來自 Martek Biosciences, Columbia, MD 的 SENSILIGHT Dye)也被用在蛋白質(zhì)微陣列領(lǐng) 域中。還已開發(fā)了幾種新穎的檢測方法，例如滾環(huán)擴增(RCA)。表面數(shù)十年來硝化纖維素(硝酸纖維素)已被用于蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)合實驗，顯示其 多功能性、穩(wěn)固性和可購性。直接放在疏水表面例如玻璃或塑料上的蛋白質(zhì)包括抗體將部分變性，降低了蛋白質(zhì)活性。然而，硝化纖維素的多孔、聚合的特征允許通過最小限度破壞 蛋白質(zhì)的疏水相互作用、氫鍵合和范德華相互作用來結(jié)合。如通常在Western印跡中所進 行的，可以將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)上斑印(圓點印跡)或者轉(zhuǎn)移。除了硝化纖維素在生命科學(xué)研究和診斷測定法中的用途之外，它還被用作爆炸 物、照相用紙、涂料和涂漆、以及噴墨打印機用的墨水中的組分。由于這種廣泛的用途， 其繼續(xù)被開發(fā)并更好地表征為一種原材料，尤其是出于分析的目的。可基于純度、氮含 量、粘度(分子量)、溶劑、濕潤劑、煙火添加劑和增塑劑購買許多不同等級的硝化纖維 素。兩個常見的供應(yīng)廠商是 Wolff Cellulosics(ffalsrode Industrial Park)和 Filo Chemicals (NewYork, NY)；許多其他的供應(yīng)廠商存在于世界各地。對于診斷和生命科學(xué)研究的應(yīng)用來說，硝化纖維素通常被稱為“硝化纖維素 膜”并且以兩種形式使用硝化纖維素的白色獨立層或者在表面通常玻璃上的涂層。白 色多孔的硝化纖維素表面的熒光背景典型地顯著高于薄的光學(xué)上透明硝化纖維素表 面。涂覆的表面范圍是從厚的(> lOym)白色多孔涂層例如來自Schleicher和 Schu 11 (Whatman, Middlesex, UK)與 GraceBioLabs (Bend, OR)的載玻片，到來自 GenTel Biosciences (Madison, WI)的光學(xué)上透明超薄涂層(< 500nm)載玻片。所應(yīng)用的硝化纖 維素的物理特性例如厚度、孔隙率、疏水性、強度、粘附性、均質(zhì)性和蛋白質(zhì)結(jié)合能力是由許 多因素決定的。這些因素包括溶劑、共溶劑和非溶劑的比率，包括溫度、濕度和溶劑分壓的 干燥條件，以及其他分子例如增塑劑、穩(wěn)定劑和其他纖維素酯的存在。硝化纖維素斑點的另一種用途是在基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜 (MALDI-T0F MS)中(Luque-Garcia 等人，Anal. Chem.，78(14)，5102-5108，2006 ;Zhao X 等人，Analyst 129(9) =817-822, 2004) 0在這個例子中，將50個清晰的硝化纖維素斑點 (500 UM)的陣列與a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)基質(zhì)溶液相混合，然后將肽樣品沉積在 不銹鋼MALDI板上的硝化纖維素頂部。然后通過質(zhì)譜分析的激光將樣品離子化。硝化纖維素還可以應(yīng)用于基質(zhì)表面例如硅和各種塑料上，例如聚對苯二甲酸乙二 酯、乙酸纖維素、聚碳酸酯或聚苯乙烯?？墒褂梅秶鷱V泛的有機溶劑來將硝化纖維素粘合 到聚合物表面，所述溶劑包括丙酮、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、二氯甲烷、正丁醇和甲基乙基 酮。在用硝化纖維素涂覆塑料中溶劑的選擇必須既考慮粘合特性(強度)又考慮所結(jié)合的 硝化纖維素的物理特性。例如，在美國專利申請公布2000/0160120 A1中，測驗了幾種溶劑 的混合物將硝化纖維素粘合到塑料上的能力。在這篇申請中，將鍵合的硝化纖維素用作粘 合劑來將添加的聚合物粘合到塑料表面。三種溶劑乙醇、二氯甲烷和甲基乙基酮顯示出使 硝化纖維素與塑料結(jié)合，但最終結(jié)果是涂漆樣粘合劑。生成的產(chǎn)物不提供用于吸附蛋白質(zhì) 的多孔層。對于使硝化纖維素結(jié)合塑料和產(chǎn)生足夠用于蛋白質(zhì)結(jié)合的涂層都最優(yōu)化的溶劑 的選擇沒有被提出。用于溶解硝化纖維素和涂覆表面的溶劑分為三組(Wolff-cellkulosics. com)。真 溶劑(或者活性溶劑)在室溫下完全溶解硝化纖維素。這些溶劑包括酮類(丙酮、甲基乙 基酮、甲基異丁基酮)、酯類(乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸甲氧基丙酯)和乙二醇醚類(乙二 醇甲醚、乙二醇乙醚、乙二醇異丙醚)。助溶劑不能在室溫下溶解硝化纖維素。當(dāng)它們與一 些真溶劑或某些非溶劑混合時變得能夠溶解硝化纖維素。例子包括醇(乙醇、異丙醇和丁 醇)和醚(乙醚)。非溶劑不能直接或間接溶解硝化纖維素。這些非溶劑包括脂肪族烴和芳香族烴(苯、甲苯和二甲苯)。慎重選擇用于產(chǎn)生硝化纖維素表面的溶劑還取決于硝化纖 維素/乙酸纖維素混合物的溶解性，所述混合物是膜和表面涂層中使用的常見制品。Grace BioLabs (Bend，OR)制造了以硝化纖維素涂覆的玻璃載玻片，其主要由 Schleicher & Schuell配銷，現(xiàn)在由Whatman (Middlesex，UK)擁有。這些載玻片的表面 與許多表面化學(xué)(< 0. 2微米)相比相對較厚，^ 14微米。這種表面具有對于組織和溶 胞產(chǎn)物陣列重要的高的蛋白質(zhì)結(jié)合能力，但是具有降低其對于高敏感性檢測的效用的非 常高的熒光背景。最近，GenTel Biosciences (Madison, WI)介紹了一種薄膜(< 0. 5微 米)硝化纖維素涂覆的玻璃載玻片(從現(xiàn)在稱作Decision Biomarkers, Natick, MA的 Clinical MicroArrays 獲得許可)。其他公司 Agnitio Science & Technology (Taiwan) 和PriTest (Redmond，WA)也已生產(chǎn)用于蛋白質(zhì)檢測的硝化纖維素涂覆的載玻片。將來自上述制造商的載玻片設(shè)計成與可移去的硅酮密封墊(框，孔成形器)一起 使用，該密封墊產(chǎn)生多個孔來分離樣本和試劑并防止交叉污染。在不存在框的情況下產(chǎn)生 孔，應(yīng)用于硝化纖維素區(qū)域的溶液容易地流過載玻片并且不能保持分離。然而，將框移去而 沒有移去容納樣本的材料通常是困難的和具有挑戰(zhàn)性的。好的載玻片和配件可通過許多其 他的公司獲得，例如 Interchim(Interchim. com (France)、Stratech (Suffolk, England)禾口 Invitrogen (Carlsbad, CA)。在表面上的硝化纖維素沉積方法例如噴霧(霧化)、浸涂或移液決定了最終產(chǎn)物 的厚度和物理特性。大多數(shù)涂層覆蓋整個表面，但是在一些情況中硝化纖維素的圓點或島 被沉積在玻璃表面的區(qū)域上。Grace BioLabs (Bend, OR)已經(jīng)生產(chǎn)用于基于細胞的微陣列 的0NCYTE膜-孔，其中多個硝化纖維素圓點被固定在玻璃顯微鏡的載玻片上。然而，在白 色圓點之間的載玻片上的區(qū)域沒有被描述為疏水性的，并且當(dāng)這個區(qū)域被測驗時沒有顯示 出疏水性。在圓點之間缺乏疏水性造成樣品的交叉污染并且降低了測定通量和準(zhǔn)確性。因此，對于產(chǎn)生用于定量檢測陣列中的分子的固體表面基質(zhì)的方法仍存在需求， 所述方法提供了最小限度的交叉污染和高通量分析。不取決于孔成形器(well former)或 框相器(framer)的無框陣列和用于生產(chǎn)和使用此類陣列的方法將是極其有用的。發(fā)明_既述本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生無框陣列的方法和裝置。本發(fā)明可被應(yīng)用于許多測定類型的 許多不同的膜沉積物。在一個實施方案中，用于分子的定量檢測的固體表面或基質(zhì)被產(chǎn)生 而無需框或孔來分開樣品。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生無框陣列的方法，包括將至少兩個分 開的膜與基質(zhì)相偶聯(lián)，其中所述膜包括含有硝化纖維素的組合物，并且此外其中所述組合 物被配制以保持應(yīng)用的樣品在膜上；并且將分析物與所述膜相偶聯(lián)來產(chǎn)生無框陣列。在另 一個實施方案中，對組合物進行配制以允許應(yīng)用的樣品覆蓋整個膜。又在另一個實施方案 中，組合物還包括乙酸纖維素和一種溶劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種無框陣列，所述無框陣列包括(a)與基質(zhì) 相偶聯(lián)的至少兩個分開的膜，其中所述膜包括含有硝化纖維素的組合物，并且此外其中所 述組合物被配制以保持應(yīng)用的液體在膜的周界之內(nèi)；以及(b)與所述膜相偶聯(lián)的分析物。 又在另一個實施方案中，分析物選自由以下組成的組探針、RNA、DNA、肽、提取物、蛋白質(zhì)的 片段、抗體和蛋白質(zhì)。
仍在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測分子相互作用的方法，它包括(a) 應(yīng)用樣品到包含與基質(zhì)相偶聯(lián)的至少兩個分開的膜的陣列，其中所述膜包括含有硝化纖維 素的組合物和與所述膜相偶聯(lián)的分析物，并且此外其中所述組合物被配制以保持應(yīng)用的液 體在膜的周界之內(nèi)；并且(b)檢測分子相互作用。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生陣列的方法，所述方法包括將至少兩 個分開的膜分配給基質(zhì)，其中所述膜包括含有硝化纖維素的組合物，其中所述組合物被配 制以保持應(yīng)用的液體在膜的周界之內(nèi)；并且將分析物與所述膜相偶聯(lián)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生陣列的方法，所述方法包括將至少兩 個分開的膜分配給基質(zhì)，其中所述膜包括含有硝化纖維素的組合物，其中所述組合物被配 制以保持應(yīng)用的液體在膜的周界之內(nèi)；并且將分析物與所述膜相偶聯(lián)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括無框陣列，其中 所述陣列包含至少兩個分開的膜；用于進行分子的分子檢測的試劑和使用所述陣列和所述 試劑的說明書。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括無框陣列，其中 所述陣列包含至少兩個分開的膜并且此外其中用分析物排列所述膜；用于進行所述分子的 分子檢測的試劑和使用所述陣列和所述試劑的說明書。又在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生無框陣列的方法，該無框陣列包括 (a)基質(zhì)；(b)涂覆在該基質(zhì)上的疏水層；和(c)應(yīng)用到以該疏水層涂覆的基質(zhì)區(qū)域的膜， 其中所述膜包括含有硝化纖維素的組合物，并且此外其中所述組合物被配制以保持樣品在 該膜的周界之內(nèi)。在另一個實施方案中，可以將膜直接與塑料表面相偶聯(lián)?？稍诿總€膜上進行單獨 的測定。在測定優(yōu)化或分析物檢測中可以用產(chǎn)生多功能性的不同的封閉劑、分析物溶液或 檢測試劑處理不同的膜。多重測定可以在單一塑料表面上的96或384個親水區(qū)域上同時 進行。又在另一個實施方案中，在膜上進行的測定是免疫測定。用于免疫測定的檢測方 法包括但不限于熒光測定法和比色測定法。附圖簡述圖1是載玻片陣列普遍使用的示例性可移去的16孔框(孔成形器)的照片。圖2是使用疏水表面上的硝化纖維素區(qū)域(圓點)的示例性陣列設(shè)計的簡圖。在 僅為示范目的而提供的該簡圖中，左邊的測定簡圖是使用比色檢測的抗原陣列，而右邊的 測定是使用熒光檢測的多重夾心ELISA。圖3包含三張照片，這些照片示出在每個陣列上具有變化數(shù)目的膜或圓點的不同 的陣列。圖3A是在疏水的玻璃表面上包含96個硝化纖維素膜(圓點)的陣列的照片。圖 3B是在塑料表面上包含96個硝化纖維素膜(圓點)的陣列的照片。圖3C是描繪在塑料表 面上384個硝化纖維素膜(斑點)的陣列的照片。每個硝化纖維素膜可以用分析物進行排 列。圖4包含兩張照片，每張照片示出具有不同的膜或圓點以及在每個膜上所排列不 同數(shù)目分析物的陣列。圖4A是在部分玻璃載玻片上的抗原陣列的照片，示出四個硝化纖維 素膜，在每個膜上具有6個排列的蛋白質(zhì)區(qū)域。圖4B是在每個硝化纖維素膜(圓點)上具有9個蛋白質(zhì)區(qū)域的96個膜陣列的照片。將兩個膜(圓點)放大到該96個膜陣列的右側(cè)。圖5是報告白細胞介素4(IL_4)和白細胞介素10(IL-10)的比色ELISA檢測的線 圖，該檢測使用硝化纖維素?zé)o框陣列。圖6是描繪小鼠IgG的近紅外熒光檢測的抗原陣列的簡圖。圖7是報告蛋白質(zhì)濃度測量測定法的結(jié)果的條形圖，該測定法使用結(jié)合于硝化纖 維素膜(圓點)的蛋白質(zhì)和近紅外熒光染料。圖8是報告具有小鼠IgG斑點的硝化纖維素膜(圓點)的載量的條形圖。圖9是報告對軛合載體蛋白質(zhì)的S腺苷高半胱氨酸與小鼠雜交瘤上清液中的抗體 之間的結(jié)合進行的直接比色檢測的條形圖。圖10是描繪在硝化纖維素表面上的蛋白質(zhì)檢測(100 u M)的照片。圖11是報告使用無框陣列的Sox2蛋白的比色夾心ELISA檢測和特異性測驗的線 圖。圖12是處于豎直(垂直)位置的無框陣列的照片，該照片示出甚至當(dāng)該陣列向一 邊轉(zhuǎn)動時，針對每個膜的應(yīng)用的液體樣品保持在適當(dāng)?shù)奈恢?。較小的照片是膜上單個樣品 的放大。圖13是含有透明硝化纖維素的無框陣列膜的照片。樣品被放在該透明硝化纖維 素膜上并且該陣列被轉(zhuǎn)向一邊。圖14是顯示使用透明硝化纖維素陣列的蛋白質(zhì)檢測的照片。從結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案所作出的下列詳細描述中本發(fā)明的目的和 優(yōu)點將看起來更完全。發(fā)明詳述定義為了促進對本發(fā)明的理解，以下定義了許多術(shù)語和短語“抗體模擬物”表示復(fù)制了免疫球蛋白、單克隆抗體或多克隆抗體的本質(zhì)特征的分子。“測定法”及類似術(shù)語表示用于檢測大分子、分子、離子或細胞的存在、估計其濃度 并確定其生物學(xué)活性的方法。測定法基于可測量的參數(shù)，所述參數(shù)使得評估樣品與對照之 間的差異成為可能?！岸嘀販y定法”表示用于樣品的平行分析的方法。“血清”表示血液的無細胞部分，從中纖維蛋白原已在血凝結(jié)的過程中被分離。血 液的無細胞部分(血漿)在健康個體中具有7. 35到7. 45的狹窄范圍內(nèi)的pH?！皹悠贰北硎緩娜魏蝸碓匆约吧飿悠泛铜h(huán)境樣品中獲得的樣本或培養(yǎng)物。生物樣 品可以從動物(包括人)中獲得并且涵蓋液體、固體、組織和氣體。生物樣品包括尿和血液 的產(chǎn)物，例如血漿、血清及類似物。然而此類樣品不得被解釋為限制可應(yīng)用到本發(fā)明的樣品 類型?！懊庖咔虻鞍住被颉翱贵w”表示結(jié)合特定抗原的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白包括但不限于 多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體、Fab片段、F(ab' )2片段，包括下列類別 的免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、IgD、IgE和分泌型免疫球蛋白(slg)。免疫球蛋白總體上包 括兩個相同的重鏈和兩個輕鏈。然而，術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”還涵蓋單鏈抗體和雙鏈抗體?！胺治鑫铩北硎驹谝环N分析方法中被測量的物質(zhì)或被用來測量另一種物質(zhì)的物質(zhì)。“抗原”表示能夠在適當(dāng)條件下誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答并且能夠與那種應(yīng)答的產(chǎn)物 反應(yīng)的物質(zhì)，所述應(yīng)答的產(chǎn)物在優(yōu)選的實施方案中是特異性抗體?？乖梢允强扇苄晕镔|(zhì)， 例如毒素和外源蛋白質(zhì)，或者是微粒，例如細菌和組織的細胞，然而，只有稱為抗原決定簇 或表位的抗原分子的部分與抗體結(jié)合?！疤禺愋越Y(jié)合”或“特異地結(jié)合”當(dāng)用來指抗體與蛋白質(zhì)或肽之間的相互作用時表 示該相互作用取決于該蛋白質(zhì)上特殊結(jié)構(gòu)(即抗原決定簇或表位)的存在；換言之，該抗體 被識別并且與特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)合而不是與蛋白質(zhì)以全部結(jié)合。例如，如果抗體對于表 位“A”是特異的，那么在包含標(biāo)記的“A”與該抗體的反應(yīng)中包含表位A (或游離的、未標(biāo)記 的A)的蛋白質(zhì)的存在將減少與該抗體結(jié)合的標(biāo)記的A的量?！胺翘禺愋越Y(jié)合”和“背景結(jié)合”當(dāng)用來指抗體與蛋白質(zhì)或肽的相互作用時表示不 取決于特殊結(jié)構(gòu)(即該抗體與蛋白質(zhì)以全部結(jié)合而不是與特定結(jié)構(gòu)例如表位結(jié)合)的存在 的相互作用。“標(biāo)記”、“標(biāo)志物”和“報告蛋白”表示可用來提供可檢測的(優(yōu)選可定量的)信號 的任何原子或分子。標(biāo)記可以提供通過熒光、放射活性、比色法、重量分析法、X射線衍射或 吸收、磁性、酶活性等可檢測的信號。標(biāo)記可以是帶電的部分(正電或負電)或者替代地可 以是電中性?！坝糜谑褂盟鲈噭┖械恼f明書”是指用于使用包含在該試劑盒中的試劑的說明 書，包括但不限于檢測來自受試者的樣品中的分析物的說明書。在一些實施方案中，說明書 還包括在體外標(biāo)記診斷產(chǎn)品中為美國食品與藥品管理局(FDA)所要求的對預(yù)定用途的陳 述?！笆茉囌摺北硎緦⑹蔷唧w的診斷測驗或治療的接受者的任何動物(例如哺乳動 物)，包括但不限于人、非人靈長類動物、嚙齒動物等。典型地，術(shù)語“受試者”和“患者”在 本文指人類受試者時可互換使用?！胺侨祟悇游铩北硎舅械姆侨祟悇游?，包括但不限于脊椎動物，例如嚙齒動物、非 人靈長類動物、綿羊、牛、反芻動物、兔形目動物、豬、山羊、馬、犬、貓、鳥綱等等?！鞍被嵝蛄小焙椭T如“多肽”或“蛋白質(zhì)”這類術(shù)語并非旨在將氨基酸序列限制為 與引用的蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整的、天然的氨基酸序列。除非另外指明，“濕度室”表示在室溫下具有大于60%相對濕度的密閉的室。“固體表面”表示適合于結(jié)合生物分子和進行分子相互作用測定的任何固體表面。 表面可以由任何適宜材料制成(例如包括但不限于金屬、玻璃和塑料)并且可以用涂層 (例如，金屬、聚合物或環(huán)氧樹脂)修飾?！盎|(zhì)”是指具有可以用薄膜涂覆的表面的任何材料。關(guān)于基質(zhì)的“用薄膜涂覆”表示如下一種情形其中基質(zhì)表面的至少一部分具有排 列于其上的薄膜(例如通過共價或非共價結(jié)合)。“微陣列”表示包含多個研究的生物大分子(例如核酸或抗體)的固體表面。每個 大分子在微陣列中的位置是已知的，以允許在分析之后識別樣品。“第一蛋白質(zhì)的陣列”表示在固相支持體上的多肽的微陣列。
“生物大分子”表示典型地在活生物體中發(fā)現(xiàn)的大分子(例如聚合物)。例子包括 但不限于蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和碳水化合物?！鞍蟹肿印北硎敬龣z測的樣品中的分子。靶分子的例子包括但不限于寡核苷酸 (例如，包含特殊的DNA結(jié)合域識別序列)、病毒、多肽、抗體、天然存在的藥物、合成藥物、污 染物、變應(yīng)原、影響物(affeetor)分子、生長因子、趨化因子、細胞因子和淋巴因子?！敖Y(jié)合配偶體”表示能夠或者懷疑能夠在物理上彼此相互作用的兩個分子(例如蛋 白質(zhì))。如本文所用，術(shù)語“第一結(jié)合配偶體”和“第二結(jié)合配偶體”是指能夠或者懷疑能夠 在物理上彼此相互作用的兩個結(jié)合配偶體。術(shù)語“其中所述第二結(jié)合配偶體能夠與所述第一結(jié)合配偶體相互作用”是指已知 能夠或者懷疑能夠相互作用的第一結(jié)合配偶體和第二結(jié)合配偶體。相互作用可以是任何共 價的或非共價(例如疏水鍵或氫鍵)的相互作用?！靶盘枴北硎局T如將由測定反應(yīng)引起或提供的任何可檢測的效果。例如，在本發(fā)明 的一些實施方案中，信號是或熒光的信號。在其他實施方案中，從感興趣的基因中合成 的RNA的存在是信號。“基因”表示如下核酸(例如DNA)序列含有對于多肽、RNA (例如包括但不限于 mRNA、tRNA和rRNA)或前體(例如母體)的產(chǎn)生必需的編碼序列的核酸序列。多肽、RNA或 前體可以由全長編碼序列或者由編碼序列的任何部分編碼，只要全長或片段的希望活性或 功能特性(例如酶活性、配體結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等等)被保留。該術(shù)語還涵蓋結(jié)構(gòu)基因的編碼 區(qū)和毗鄰5'端和3'端的編碼區(qū)在每端大約lkb的距離的包含序列以使得該基因?qū)?yīng)于 全長mRNA的長度。位于編碼區(qū)的5'且存在于mRNA上的序列被稱為5'非翻譯序列。位 于編碼區(qū)的3'或下游且存在于mRNA上的序列被稱為3'非翻譯序列。術(shù)語“基因”涵蓋 基因的cDNA和基因組兩種形式?；虻幕蚪M形式或克隆包含具有稱為“內(nèi)含子”或“間 插區(qū)”或“間插序列”的非編碼序列的間斷的編碼區(qū)。內(nèi)含子是被轉(zhuǎn)錄進入核RNA(hnRNA) 的基因的節(jié)段；內(nèi)含子可包含調(diào)控元件例如增強子。內(nèi)含子從核或原始轉(zhuǎn)錄本中被移除或 “剪接出來”；因此內(nèi)含子在信使RNA (mRNA)轉(zhuǎn)錄本中不存在。mRNA在翻譯期間發(fā)揮功能來 指定氨基酸在新生多肽中的順序或次序?！坝H水性膜”和“親水區(qū)域”表示用水可潤濕的任何材料，并且包括但不限于薄膜、 涂層、較大基質(zhì)的分開部分、用水可潤濕的組合物；當(dāng)干燥時用水可潤濕的組合物；用水可 潤濕的溶液；當(dāng)干燥時用水可潤濕的溶液；包含一個或多個含有親水材料的組分的膜，例 如用聚乙烯吡咯酮(PVP)親水化的硝化纖維素、再生纖維素或聚砜。另外適合的膜材料是 聚丙烯腈、纖維素的纖維(例如，在來自Akzo，Netherlands的商標(biāo)名Cuprophan之下可獲 得)、乙酸纖維素以及類似物。作為對已包含親水性材料的膜的替代，如果已經(jīng)用可以被洗 出的例如肉豆蔻醇的親水劑或者用水/乙醇混合物使疏水性膜親水的話，也可以使用疏水 性膜?！胺珠_的膜”表示與另一個膜分開或者分離的膜。用于產(chǎn)生無框陣列的方法在用微陣列檢測分子相互作用中的巨大挑戰(zhàn)是尋找一種既是高通量又利用多重 測定的方法。一方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生固體表面的方法，該固體表面能夠用來在一天 產(chǎn)生數(shù)以萬計的檢測數(shù)據(jù)點(圖2)。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生無框陣列的方法，該方法包括將親水性 膜附加在固體基質(zhì)上的疏水表面上并且用分析物排列該親水性膜供檢測。該疏水表面可以 預(yù)先存在或者它可以被產(chǎn)生。又在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生無框陣列的方 法，該方法包括將至少兩個分開的膜與基質(zhì)相偶聯(lián)，其中所述膜包括含有硝化纖維素的組 合物，并且此外其中所述組合物被配制以保持應(yīng)用的樣品在膜的周界之內(nèi)；并且將分析物 附加在所述膜上來產(chǎn)生無框陣列。還在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及無需孔-框相器產(chǎn) 生無框陣列的方法。仍在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及無需疏水性印劑(ink)用于產(chǎn)生 無框陣列的方法。1.固體表面或基質(zhì)在一個實施方案中，固體表面或基質(zhì)包括但不限于支持體的使用，所述支持體包 括玻璃、乙酸纖維素、金屬、聚丙烯、特氟隆、聚乙烯、聚酯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚對苯二甲 酸乙二酯、聚苯乙烯和陶瓷。在本發(fā)明意義上的玻璃包括無定形非晶固態(tài)材料，即本發(fā)明意 義上的玻璃態(tài)可以被認為是凍結(jié)的、過冷液體或熔融物。因此，玻璃材料是大部分氧化物 融化的無機或有機的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物通過一種無需熔融相組分結(jié)晶的引入工藝被轉(zhuǎn)化為固 態(tài)。晶體、熔融物和過冷熔融物也被認為是本發(fā)明意義上的玻璃材料。例如，玻璃材料可以 是平板玻璃、容器玻璃、商品化玻璃、實驗室玻璃、鉛玻璃、纖維玻璃、光纖玻璃和其他玻璃。 使用不含硅酸鹽的玻璃材料例如磷酸鹽玻璃材料也是可能的。金屬也包括金屬玻璃，即處于可測量的、大部分是無定形態(tài)的材料。在本發(fā)明的意 義上還包括具有金屬導(dǎo)電性的聚合物。在本發(fā)明的意義上的聚丙烯是丙烯的熱塑性聚合 物。聚丙烯因其高硬度、彈性、剛性和耐熱性而特別值得注意。特氟隆是一種聚四氟乙烯， 它有利地具有良好的熱塑特性。聚乙烯當(dāng)暴露于水、堿性溶液、鹽溶液和無機酸時是完全惰 性的。例如，包含聚乙烯的支持體具有非常低的水蒸汽通透性。聚酯是通過內(nèi)酯的開環(huán)聚合或者通過羥基羧酸的縮聚或者二醇與二羧酸或二羧 酸衍生物的縮聚產(chǎn)生的化合物。聚酯還包括聚酯樹脂、聚酯酰亞胺、聚酯橡膠、聚酯多元醇 和聚酯聚氨酯。聚酯是熱塑性塑料并且具有明顯的材料特性。它們具有高熱穩(wěn)定性并且能 夠被加工成具有例如銅、鋁和鎂的金屬的合金。陶瓷是特別的無機類材料的集合術(shù)語，所 述特別的無機類材料主要由非金屬化合物和元素組成并且具體地包含按體積計多于30% 的晶體材料。各種陶瓷或陶瓷材料包括但不限于陶器、陶瓦器、劈離墻磚(split wall tile)、實驗室瓷、陶器瓷、骨灰瓷、氧化鋁陶瓷、永久磁性材料、硅磚和氧化鎂磚可以被論 及。粘土陶瓷材料分為粗粒材料和細粒材料，其中細粒粘土陶瓷材料包括陶瓦器、石制器和
o在另一個實施方案中，基質(zhì)可以是任何尺寸和厚度，包括但不限于0. 1-lmm、 l-5mm、5-10mm和10_15mm。又在另一個實施方案中，基質(zhì)可以是沒有分隔器或單個孔的單平層。2.疏水表面固體表面或基質(zhì)可以包括疏水表面或者可以用溶液處理以產(chǎn)生疏水表面。當(dāng)應(yīng)用 于固體表面時產(chǎn)生疏水表面的任何溶液或化合物能夠被使用，包括但不限于甲基和辛基 的衍生物、反應(yīng)性環(huán)氧化物和環(huán)氧粘合劑。所述溶液或化合物能夠以任何方式應(yīng)用于產(chǎn)生 疏水表面的固體表面，包括但不限于將固體基質(zhì)浸入到所述溶液或化合物中、將溶液噴灑到固體基質(zhì)上、將化合物鋪展到固體基質(zhì)上以及移取溶液到固體基質(zhì)上。3.親水性膜/ “膜”在一個實施方案中，將可吸收的膜與固體表面相偶聯(lián)。又在另一個實施方案中，將 親水性膜與包含疏水表面的固體表面相偶聯(lián)?？梢詫⒎蛛x的親水性膜與固體表面相偶聯(lián)而 無需框(孔-框相器或孔-成形器)。在親水性膜之間的疏水區(qū)域顯示出很強的蛋白質(zhì)結(jié) 合能力，因此如果樣品從親水區(qū)域浙濾出來，蛋白質(zhì)將不會污染相鄰的部分?？晌盏挠H水 性膜被設(shè)計成使得包含分析物的樣品被緩慢分配，它們被親水區(qū)域?qū)崟r吸收。親水性膜包括但不限于硝化纖維素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、乙酸纖維素、有機纖 維素酯(也稱作火棉)、纖維素混合酯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚酰胺、再生的纖維素、聚碳酸 酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚對苯二甲酸酯、聚酯、聚砜、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、尼龍、聚戊二稀和 硝化纖維素與乙酸纖維素的混合物?？墒褂眯枰A(yù)潤濕的膜和不需要預(yù)潤濕的膜。本發(fā)明 的膜包括但不限于用水可潤濕的組合物、干燥時用水可潤濕的組合物、用水可潤濕的溶液 和干燥時用水可潤濕的溶液。硝化纖維素是無機纖維素酯?？墒褂萌魏晤愋偷南趸w維素，包括但不限于白色 的、透明的、不透明的、半透明的、處于粉末形式的硝化纖維素和處于液體形式的硝化纖維 素。可使用任何尺寸或形狀的硝化纖維素?？墒褂冒咨趸w維素或透明硝化纖維素或者 白色與透明的組合。Protran 是從Whatman商購可獲得的硝化纖維素膜。從Whatman也 可以獲得由PVDF制成的Westran S。硝化纖維素可能以粉末形式獲得，然后被溶解于適當(dāng) 溶液中，或者硝化纖維素可能已在溶液中獲得?？梢詫⑷軇┯糜谌芙庥H水性膜，所述親水性膜包括但不限于硝化纖維素和硝化纖 維素與乙酸纖維素的組合物?？墒褂谜嫒軇?或者活性溶劑)并且它們典型地在室溫下 溶解硝化纖維素。這些溶劑包括但不限于酮類(丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮)、酯類 (乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸甲氧基丙酯)和乙二醇醚類(乙二醇甲醚、乙二醇乙醚、乙二醇 異丙醚)。還可以使用助溶劑來溶解親水性膜。一般來說，助溶劑不能在室溫下溶解硝化纖 維素。當(dāng)它們與一些真溶劑或某些非溶劑混合時變得能夠溶解硝化纖維素。例子包括但不 限于醇(乙醇、異丙醇和丁醇)和醚(乙醚)。慎重選擇用于產(chǎn)生硝化纖維素表面的溶劑還 取決于硝化纖維素/乙酸纖維素混合物的溶解性，所述混合物是膜和表面涂層中使用的常 見制品。又在另一個實施方案中，可將分開的膜與基質(zhì)相偶聯(lián)。仍在另一個實施方案中，分 開的膜可包括含有硝化纖維素的組合物。又在另一個實施方案中，組合物可包括硝化纖維 素、乙酸纖維素和一種溶劑。仍在另一個實施方案中，組合物可包括單一溶劑或多于一種溶 劑。在另一個實施方案中，溶劑可以選自由以下組成的組丙酮、乙醇、乙酸戊酯、丁醇和多 于一種溶劑。又在另一個實施方案中，組合物包括溶劑丙酮、乙醇和丁醇。仍在另一個實施 方案中，溶劑丙酮、丁醇和乙醇包括大于80%的溶劑。又在另一個實施方案中，可以將任何數(shù)目的分開的膜與基質(zhì)相偶聯(lián)，該數(shù)目包括 但不限于2-7、8、9-11、12、13-15、16、17-23、24、25-35、36、37-47、48、49-95、96、97-383、 384、385-1535、1536、1537-6133、6144和大于6144。在一個實施方案中，可將96個膜以相 距約9毫米的8X12網(wǎng)格與基質(zhì)相偶聯(lián)。在另一個實施方案中，可將384個膜以相距約4. 5 毫米的16X 24網(wǎng)格與基質(zhì)相偶聯(lián)。仍在另一個實施方案中，可將1536個膜以相距約2. 25毫米的32X48網(wǎng)格與基質(zhì)相偶聯(lián)。又在另一個實施方案中，每個膜可包括對于任務(wù)足夠的任何面積，包括但不限于 0. 25-0. 5平方微米、0. 5-1. 0平方微米、1. 0-1. 5平方微米、1. 5-2. 0平方微米、2. 0-2. 5平 方微米、2. 5-5. 0平方微米、5-10平方微米、10-20平方微米、20-40平方微米、40-100平方 微米、0. 1-0. 5平方毫米、0. 5-1平方毫米、1-5平方毫米、5-10平方毫米、10-15平方毫米、 15-20平方毫米、20-25平方毫米、25-50平方毫米、50-100平方毫米、100-200平方毫米和大 于200平方毫米。仍在另一個實施方案中，面積可選自由1平方毫米、7平方毫米和28平方 毫米組成的組。在另一個實施方案中，每個膜可以具有對于任務(wù)適當(dāng)?shù)娜魏纬叽?，包括但不?于圓形、正方形、矩形、三角形、八邊形、橢圓形、五邊形、六邊形、平行四邊形、菱形、偏方形 (kite)和不規(guī)則四邊形。在另一個實施方案中，陣列可包括與完全相同的形狀和尺寸的基 質(zhì)相偶聯(lián)的膜，陣列可包括與多于一種形狀的基質(zhì)相偶聯(lián)的膜，并且陣列可包括與多于一 種尺寸的基質(zhì)相偶聯(lián)的膜。仍在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及與基質(zhì)相偶聯(lián)的分開的膜，所述膜包括組合 物，其中所述組合物被配制以保持應(yīng)用的液體在該膜的周界之內(nèi)。在另一個實施方案中，本 發(fā)明涉及如下組合物其被配制以保持液體在膜的周界之內(nèi)持續(xù)一段時間，所述時間選自 由以下組成的組0. 1-0. 5,0. 51-1. 0,1. 1-2. 0,2. 1-4. 0,4. 1-6. 0,6. 1-8,8. 1-10,10. 1-12, 12. 1-16,16. 1-20,20. 1-24,24. 1-30,30. 1-36,36.1-48,48. 1-54,54. 1-60,60.1-72, 72-1-96和96. 1-120小時。仍在另一個實施方案中，對組合物進行配制以允許應(yīng)用的溶液 覆蓋整個分開的膜并且保持應(yīng)用的液體在該膜的周界之內(nèi)。又在另一個實施方案中，組合物可包括范圍從0. 到10%百分比的硝化纖維 素。在另一個實施方案中，組合物可包括范圍從0.03%到3%百分比的乙酸纖維素。仍在 另一個實施方案中，組合物可包括溶劑混合物，所述溶劑混合物(按體積)包括48-54%丙 酮；32-38%乙醇；和10-20%正丁醇。仍在另一個實施方案中，使用尼龍是可能的，其中在本發(fā)明意義上的尼龍包括直 鏈脂肪族聚酰胺。還可以使用聚偏二氟乙烯，它們是容易加工的熱塑性塑料，并且當(dāng)暴露于 溫度和化學(xué)品時有利地具有高耐受性。在另一個實施方案中，可使用乙酸纖維素?？赏ㄟ^任何方式將親水性膜應(yīng)用于固體表面或固體基質(zhì)，所述方式使得親水性膜 保留其與分子相互作用的能力?？梢援a(chǎn)生包含親水性膜和其他試劑的制品來幫助該親水性 膜結(jié)合到固體表面或基質(zhì)上?？墒褂冒ㄓH水性膜的任何制品，條件是該制品提供對固體 表面的穩(wěn)定結(jié)合以及最佳的蛋白質(zhì)結(jié)合。通過將該親水性膜溶解到溶劑中可獲得該制品。 對于該制品的產(chǎn)生有用的試劑包括但不限于乙酸戊酯、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、異丙 醇、水、正丁醇、乙醚、甘油、乙二醇和乙酸纖維素?？梢葬槍σ韵聦χ破愤M行優(yōu)化親水性膜的溶解性、清澈度和孔隙率，移取樣品的 容易性，樣品的穩(wěn)定性和按比例放大生產(chǎn)的容易性。在測驗并產(chǎn)生制品時要考慮的一些參 數(shù)是(1)添加溶劑的次序；(2)混合物中的溶劑比率；(3)溶劑濃度；(4)最終涂層的孔隙 率；(5)親水性膜涂層的均勻性；(6) —種親水性膜與另一種親水性膜的比率；(7)涂層的 背景熒光；和(8)與固體表面結(jié)合的穩(wěn)定性-甚至在長期存在含水去污劑的情況下?？墒褂迷试S與親水性膜分子相互作用的任何方法將親水性膜或包含親水性膜的制品應(yīng)用于疏水表面或基質(zhì)，所述方法包括但不限于移液、分配、噴霧、霧化、分層和鋪展。在一個實施方案中，可將包含親水性膜的制品噴灑到固體基質(zhì)上。可使用超聲波 噴霧器件(超聲波噴口)對包含親水性膜的制品進行霧化。例如，可制備包含硝化纖維素 的制品。如本文所用，硝化纖維素溶液是包含在0. 重量/體積與99. 9%重量/體積之 間的硝化纖維素的溶液。假如該溶液中硝化纖維素的量是處于之前定義的范圍內(nèi)，那么 該溶液可包含其他化合物或生物大分子。超聲波噴霧器件包括親水性膜溶液的容器和從 該親水性膜溶液的容器連通式延伸的噴霧噴口。超聲噴霧噴口使親水性膜溶液霧化以便 將親水性膜的顆粒的均勻噴霧施加到固體基質(zhì)上。示例性的超聲波噴霧噴口從Sono-Tek Corporation (Milton, N. Y.)可商購獲得。示例性的 Sono-Tek 模型包括 8700-25、8700_35、 8700-48、8700-48H、8700-60、8700-120 和 8600-6015。在另一個實施方案中，可使用任何類型的噴霧器(霧化器)來使親水性膜霧化。在 一些實施方案中，霧化器件包括噴霧器，在噴霧器中親水性膜的溶液被高壓氣流引導(dǎo)流過 管。在一些實施方案中，噴霧器是空氣輔助式的，使用諸如氮氣的氣體以便控制親水性膜顆 粒在噴霧器的流速，為的是控制親水性膜的薄膜在固體基質(zhì)上的厚度。在另一個實施方案中，可以通過分配包含硝化纖維素的組合物將分開的膜與基質(zhì) 相偶聯(lián)?？梢允褂萌魏芜m合于該任務(wù)的裝置分配組合物，所述裝置包括但不限于Nan0dr0p I、Nanodrop ExtY、Nanodrop II、NanodropExpress、Screenmaker 96+8禾口Platemaker HTS， 全部從 InnovadyneTechnologies (Santa Rosa, California)可獲得。在另一個實施方案中，可將分開的膜與塑料基質(zhì)相偶聯(lián)。又在另一個實施方案中， 分開的膜可包括含有硝化纖維素的組合物。仍在另一個實施方案中，塑料基質(zhì)包括但不限 于PEI纖維素。又在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生無框陣列的方法，該方法包括將包 含硝化纖維素的組合物分配到聚酯薄膜上；并且在濕度室中干燥所述薄膜。仍在另一個實 施方案中，組合物還包括乙酸纖維素和一種溶劑。仍在另一個實施方案中，濕度室的相對濕 度大于60%。4.將分析物結(jié)合在膜上可將任何分析物結(jié)合在膜上，包括但不限于探針、抗體、分子、小分子抑制劑、抗 體、肽、肽模擬物、蛋白質(zhì)的片段、蛋白質(zhì)的活性區(qū)域、蛋白質(zhì)、氨基酸序列、單鏈核酸、RNA、 DNA和基因的片段。又在另一個實施方案中，可將任何數(shù)目的分析物結(jié)合在每個膜上，包括 但不限于:1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-40、41-50、51-100 和大于 100。仍還在 另一個實施方案中，可將相同的分析物或者不同的分析物結(jié)合于每個膜上。在另一個實施 方案中，陣列的每個膜可以用相同的分析物、相同組的分析物或者不同的分析物進行排列。又在另一個實施方案中，與膜相偶聯(lián)的每種分析物可具有選自由以下組成的組 的個體區(qū)域直徑為 1-10、11-20、21-30、31-40、41-50、51-60、61-70、71-74、75、76-100、 101-149、150、151-200、201-250、251-300、301-350、351-400、401-449、450、451-500、 501-749,750,751-1000 微米以及大于 1000 微米。無框陣列在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及的無框陣列包括與基質(zhì)相偶聯(lián)的至少兩個分 開的膜，其中所述膜包括含有硝化纖維素的組合物。又在另一個實施方案中，配制該組合物以保持應(yīng)用的液體在該膜的周界之內(nèi)。仍又在另一個實施方案中，組合物的頂部是無框陣 列上的最高點。在另一個實施方案中，分析物被結(jié)合于所述膜上。又在另一個實施方案中，可使用無框陣列來檢測分析物而無需孔_框相器、孔_成 形器或疏水性印劑。本發(fā)明的無框陣列可以在不存在孔_框相器、孔_成形器或疏水性印 劑的情況下使用。仍又在另一個實施方案中，可使用無框陣列來檢測任何感興趣的分析物，包括但 不限于探針、分子、小分子抑制劑、抗體、肽、肽模擬物、蛋白質(zhì)的片段、蛋白質(zhì)的活性區(qū)域、 蛋白質(zhì)、氨基酸序列、單鏈核酸、RNA、DNA和基因的片段。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及如下無框陣列允許個別液體樣品沉積且容納 在分開的膜上，其中所述膜包括含有硝化纖維素組合物；并且還允許在單一單容器中一次 進行膜的隨后反應(yīng)，由此消除了對在每個單獨的孔中進行反應(yīng)的需要?？墒褂帽景l(fā)明的無 框陣列通過在單一容器中進行反應(yīng)來檢測分析物。本發(fā)明的無框陣列消除了對在板的單個 孔中進行每個反應(yīng)的需要，由此消除了孔與孔之間的變化并改善了該測定法的靈敏度。以下是無框陣列的申請的例子并且不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制本發(fā)明的實施方案?？蓪?九十六個分開的膜與基質(zhì)相偶聯(lián)，該基質(zhì)是沒有分隔器或單個孔的單層基質(zhì)?？蓪⒕欧N感 興趣的抗體結(jié)合在每個膜上。可以對每個膜應(yīng)用一種不同的細胞提取物。根據(jù)前面的所述 觀點，96個膜的所有反應(yīng)可以單一步驟進行，包括但不限于漂洗、施加第二抗體、洗滌以 及檢測在這個例子中是指九種抗體的分析物的存在必需的試劑和過程。仍又在另一個實施方案中，可使用無框陣列在多個場合檢測分析物?？梢匀菀?地分隔無框陣列的部分或區(qū)域以使得包括96個膜的陣列可以被分隔成個體膜或者一組 膜，所述一組膜包括任何數(shù)目的膜，包括但不限于1-7、8、9-11、12、13-23、24、25-47、48、 49-59、60和61-95。本發(fā)明的無框陣列允許膜分隔成適當(dāng)?shù)臄?shù)目。例如，陣列可包括96個 膜，其中9種不同的抗體在每個膜上。如果只有24個樣品，該陣列可被切成四個區(qū)域，其中 每個區(qū)域包括24個膜。然后可將樣品應(yīng)用于二十四個膜并且可保留剩余的三個區(qū)域(每 個區(qū)域24個膜)以供在未來的日期使用。此外，本發(fā)明的無框陣列提供了容易儲存并且其 可以作為單一膜或者作為一組膜儲存。用于檢測分子相互作用的方法又在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測分子相互作用的方法，該方法包括 (a)將樣品應(yīng)用于包括與基質(zhì)相偶聯(lián)的至少兩個分開的膜的陣列，其中所述膜包括含有硝 化纖維素的組合物和結(jié)合于所述膜上的分析物；并且(b)檢測分子相互作用。在另一個實 施方案中，配制該組合物以保持應(yīng)用的液體在該膜的周界之內(nèi)。在另一個實施方案中，樣品可以從選自由以下組成的組的來源獲得細菌、朊病 毒、真菌、病毒、植物、原生動物、動物、人類、非人類、哺乳動物、爬行動物、家畜、貓、狗、山 羊、豬(swine)、豬(pig)、猴、猿、大猩猩、公牛、母牛、熊、馬、綿羊、家禽、小鼠、大鼠、魚、海 豚、鯨或鯊。仍在另一個實施方案中，樣品可以是細胞、細胞提取物、植物提取物、凝集素、組 織、器官、血液、血清、血漿、唾液、尿、眼淚、陰道分泌物、汗液、臍帶血、絨毛膜絨毛、羊膜液 體、胚胎組織、胚、二細胞胚、四細胞胚、八細胞胚、十六細胞胚、淋巴液、腦脊髓液、精液、粘 膜分泌物、腹膜液、痰、呼吸道滲出液、腹水液、粘膜分泌物、腹膜液、糞便物或身體滲出液。樣品可以被純化或者可以代表處于從組織或器官純化的任何狀態(tài)的溶解產(chǎn)物。樣品可以 是全細胞溶解產(chǎn)物，包括但不限于NIH293、A-20、HeLa、H印G2、Jurkat、PC-3、SW480、T24、 U937和WI-38的全細胞溶解產(chǎn)物。樣品可以是亞細胞成分的細胞溶解產(chǎn)物，包括但不限于 細胞質(zhì)蛋白溶解產(chǎn)物、膜蛋白溶解產(chǎn)物和核蛋白溶解產(chǎn)物。此外，樣品可以是處于任何純化 階段的細胞提取物，包括但不限于僅代表破壞細胞的提取物、涉及一個純化步驟的提取物 和涉及多于一個純化步驟的提取物。細胞提取物可以從特定的細胞類型獲得，包括但不限 于癌細胞、雜交瘤、肝、腎、膀胱、卵巢、脂肪組織、淋巴結(jié)、子宮頸、胰、腦、肺臟、心臟、脾臟、 甲狀腺、乳房、結(jié)腸和前列腺的細胞。在另一個實施方案中，樣品能夠以任何適當(dāng)?shù)捏w積應(yīng)用，包括但不限于1_5、 6-10、11-20、21-30、31-50、51-100、101-200、201-300、301-500、501-1000 微升。本領(lǐng)域的
普通技術(shù)人員將理解待應(yīng)用的適當(dāng)?shù)臉悠敷w積與膜的大小成比例。仍又在另一個實施方案 中，以覆蓋每個分開的膜的體積應(yīng)用樣品。在另一個實施方案中，可使用本發(fā)明的方法和裝置來檢測任何分析物，所述分析 物包括但不限于探針、分子、小分子抑制劑、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的片段、蛋白質(zhì)的活性區(qū)域、 肽、肽模擬物和氨基酸序列、RNA、DNA、包括但不限于寡核苷酸和引物的單鏈核酸、和雙鏈核 酸。待分析的核酸可以是任何核酸，例如基因組、質(zhì)粒、粘粒、酵母人工染色體、人工DNA或 人造DNA，包括唯一的DNA序列以及還包括已從RNA樣品中反轉(zhuǎn)錄的DNA，例如cDNA。核酸 可包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、突變或者多于一個突變?？墒褂萌魏伍L度的寡核苷酸探針和 引物來檢測核酸。在另一個實施方案中，檢測的方法可以是任何適合的方法，包括但不限于比色、 熒光、近紅外熒光、紫外光譜測定、銀沉積、化學(xué)發(fā)光、ELISA和電化學(xué)發(fā)光。試劑盒通過以試劑盒形式提供這些方法中使用的試劑，本發(fā)明的方法大多數(shù)被方便地實 施。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括無框陣列，其中所述陣列 包含至少兩個分開的膜；用于進行分子的分子檢測的試劑和使用所述陣列和所述試劑的說 明書。又在另一個實施方案中，分開的膜可包括含有硝化纖維素的組合物。仍又在另一個 實施方案中，配制該組合物以保持應(yīng)用的液體在該膜的周界之內(nèi)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括無框陣列，其中 所述陣列包含至少兩個分開的膜并且此外其中一種分子被結(jié)合到所述膜上；用于進行所述 分子的分子檢測的試劑和使用所述陣列和所述試劑的說明書。試劑盒優(yōu)選地包含以下組分的一種或多種使用試劑盒的書面說明書；適當(dāng)?shù)木?沖液；鹽；固體基質(zhì)；疏水的溶液或化合物，例如環(huán)氧樹脂；以及親水性膜，例如硝化纖維 素；去污劑；以及如果需要的話適當(dāng)純度的水；這些組分被限定在不同的容器或包裝中，此 類組分允許試劑盒的使用者產(chǎn)生對于分子相互作用的定量檢測有用的固體表面。試劑盒還 可以包含抗體、標(biāo)記的抗體、寡核苷酸、引物、對照和其他對于分子的檢測有用的試劑。試劑 盒配備的引物將取決于試劑盒的目的和希望使用試劑盒測驗的DNA而不同。還可以設(shè)計試劑盒來檢測希望的或各種分子相互作用，尤其是那些與不希望的病 癥或疾病有關(guān)的分子相互作用。例如，一種試劑盒可除了其他組分之外還包括檢測與乳癌 有關(guān)的蛋白質(zhì)的一組或多組抗體。另一種試劑盒可除了其他組分之外還包括檢測直腸癌的一組或多組抗體。還有，另一種試劑盒可除了其他組分之外還包括與發(fā)展心臟病的素因有 關(guān)的基因的一組或多組引物。以下實施例展示了本發(fā)明的各種實施方案，但是不應(yīng)當(dāng)被解釋為以任何方式限制 本發(fā)明的范圍。
具體實施方案實施例1 用環(huán)氧粘合劑涂覆并目.固定硝化纖維素的玻璃的制備標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡載玻片購自(Fisher Scientific, Chicago, IL)并通過在(240 °F ) 下在-5%的Cascade (寶潔公司)去污劑的溶液中高壓滅菌45分鐘進行清潔。將載玻 片在去離子水中漂洗多次以除去所有殘留的去污劑并且在清潔的無菌罩中干燥。在一些例 子中，將載玻片在300 T -350 °F的烘箱中快速干燥5-10分鐘?？商娲兀A(yù)先清洗的載玻 片可從 Erie Scientific, Portsmouth, NH —。通過在由Henkel Consumer Adhesives (Avon, OH)制造的稀釋的環(huán)氧粘合劑中浸 涂(浸入一次)來處理每個載玻片。該粘合劑包含硅石英(40-60%)、脂肪族胺(10-20%)、 苯甲酰基醇(5-10%)、氣相二氧化硅(5-10%)、與甲苯的甲醛聚合物(5-10%)、苯酚2，4， 6三[(二甲基氨基)甲基](5-10%)、N-異十三烷基氧丙基-亞丙基二胺(1-5%)、丙二 醇(1-5% )和異佛爾酮二胺(1-5% )。按照制造商的說明書制備了環(huán)氧粘合劑并且在丙酮 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)中稀釋 10 倍。將稀釋的混合物以 15000xg 離心 20 分鐘并且將硅沉淀物以上的材料移出用于浸涂載玻片。將每個載玻片浸入1-4秒并且立即 在大約400英尺每秒的氣流中干燥。將干燥的載玻片儲存在室溫下。Environmental Technologies (Fields Landing, CA)白勺ifflfe 合劑涂覆清潔的載玻片。樹脂的組分是壬基苯酚和聚氧亞烷基胺并且硬化劑的組分是雙酚 A/環(huán)氧氯丙烷樹脂和C12與C14烷基縮水甘油醚(alkyl glcidyl ether) 0所述組分的 確切濃度被認為對于制造商Environmental Technologies是保密的。在優(yōu)選的實施方案 中，將等體積的硬化劑和透明澆注環(huán)氧樹脂相混合并且在乙酸戊酯(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)中稀釋16倍。移取大約400 u 1的溶液到一個清潔的25x75_玻璃載玻 片的水平表面。將該載玻片放在室溫下的小密閉容器中并且使其經(jīng)大約1小時緩慢干燥。 如果涂覆的載玻片干燥太快，涂層是不均勻并且不可接受硝化纖維素的結(jié)合。這種環(huán)氧粘 合劑在玻璃上提供了光學(xué)上透明的表面。將干燥的載玻片儲存在室溫下的密閉容器中。可 以用其他溶劑例如丁醇和異丙醇替換乙酸戊酯，但是溶劑揮發(fā)性越強，干燥過程必須被控 制得越嚴(yán)格，以允許環(huán)氧粘合劑的聚合。從Ladd Research(ffilliston, VT)購買了作為在丙酮中的10%溶液的硝化纖維 素。乙酸纖維素購于Sigma Chemical (St. Louis, M0)并且溶解于丙酮中。制備了硝化纖 維素混合物3%硝化纖維素，0. 3%乙酸纖維素，最終溶劑濃度為(按體積計)51%的丙酮、 35%的乙醇和14%的正丁醇。為了覆蓋整個載玻片，移取500-600 ill到水平載玻片的表面 并且在清潔的環(huán)境中快速干燥。為了在表面上產(chǎn)生96(8x12)網(wǎng)格的硝化纖維素圓點(圖 3A)，使用Beckman Biomek移取平臺(pipetting station)直接將大約14 yl的溶液移取 到表面上?？商娲兀蓪⑾趸w維素溶液直接移取(分配)在聚酯薄膜上并且在具有快 速的空氣運動的大于65%的相對濕度中干燥(圖3B)。為了產(chǎn)生384個孔的網(wǎng)格(24x16)，移取大約1. 8 iU的溶液到表面上(圖3C)?？商娲?，可將乙酸戊酯中的硝化纖維素溶液直接分配到玻璃或塑料基質(zhì)上以產(chǎn) 生透明形式的無框陣列。乙酸乙酯可替換丙酮因為它的揮發(fā)性更小且更容易分配。t施例2 /hif, IRG^mmmm (圓點)卜.的比盧輪測丨使用具有實心針的Calligrapher Arrayer (Bio-Rad, Hercules CA)用相同濃度 的小鼠IgG(Equitech-Bio, Kerrville TX)點樣六個單獨的膜(圓點)。使這些斑點在高 濕度中緩慢干燥15分鐘，然后在濕度室中將每個膜用20 y L的非蛋白質(zhì)封閉溶液(Pierce Biosciences,Rockford IL)封閉一小時。將過量的封閉溶液吸出并且使膜(圓點)干燥。 將山羊抗小鼠IgG辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA)在PBST緩沖液中稀釋到lyg/mL并且用來覆蓋整個載玻片。然后用磷酸鹽緩沖 鹽水加上吐溫20溶液洗滌載玻片一小時并且用去離子的超純水漂洗幾次。用TMB(3，3'， 5,5' _四甲基聯(lián)苯胺)穩(wěn)定的底物(Promega Corporation, Madison WI)孵育載玻片直到 背景強度開始顯現(xiàn)。然后，用去離子的超純水將載玻片漂洗幾次并且將其放在無粒子的罩 中干燥。用2400dpi 的高分辨率掃描儀(Epson America, Long Beach, CA)在 16 位灰度 文件中掃描干燥的載玻片(圖 4A)。使用 Photoshop Elements (Adobe Systems Inc. , San Jose,CA)轉(zhuǎn)換圖像并且保存為用另外“轉(zhuǎn)換的”標(biāo)記的TIFF文件。用GenePix Pro 6. 1軟 件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)分析圖像并且用 Microsoft Excel 電子表格軟件 (Microsoft Corporation, Redmond, WA)角軍釋。在一個單獨的反應(yīng)中，將小鼠 IgG (Jackson ImmunoResearchlaboratories. West Grove, PA)在磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋到200 u g/ml并且使用Calligrapher Arrayer (Bio-Rad,Hercules, CA)通過實心針以3X3網(wǎng)格在預(yù)平衡的硝化纖維素陣列的所 有96個膜(圓點)上點樣。在點樣以后，在具有0. 05%吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBST) 中用 IX NAP Block(GBiosciences，Maryland Heights, M0)將該片在室溫下封閉 1 小時。 用PBST將其洗滌三次，然后用15ml的1 1000稀釋的抗小鼠IgG堿性磷酸酶(Jackson ImmunoResearch Laboratories)在室溫下孵育一小時。再次用PBST洗滌5次，用水漂洗 并且用BCIP/NBT底物(Moss Inc.，Pasadena, MD)孵育直到可看見信號，約5分鐘。用水 漂洗該片并使其干燥。用1200dpi的高分辨率Epson V700掃描儀(Epson America, Long Beach, CA)在16位灰度TIFF文件中掃描該陣列(圖4B)。使用Epson軟件來自動確定直 方圖調(diào)整參數(shù)(Histogram Adjustment Parameters)。使用 Photoshop Elements (Adobe Systems Inc.，San Jose，CA)轉(zhuǎn)換圖像并且保存為 TIFF 文件。用 GenePix Pro 6. 1 軟 件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)分析圖像并且用 Microsoft Excel 電子表格軟件 (Microsoft Corporation,Redmond,WA)解釋。表I提供了所有96個膜的平均比色強度值 和相關(guān)統(tǒng)計。表II提供了每列的平均比色強度和相關(guān)統(tǒng)計。表III提供了每行的平均比 色強度和相關(guān)統(tǒng)計。表 I.點樣到96個硝化纖維素膜的小鼠IgG的定量陣列分析所有864個斑點(96個圓點x9個斑點)的 平均比色強度55，513標(biāo)準(zhǔn)差2，167變異系數(shù)3. 90%表 II.點樣到96個硝化纖維素圓點_列的小鼠IgG的定量陣列分析
列比色強度標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)％157764.62253. 43. 90%254535. 72457. 64. 50%354606. 41874. 23. 40%455383.61928. 13. 50%555856.72143. 53. 80%655903. 92070. 13. 70%755431. 21655. 13. 00%855995.01516. 22. 70%955976.41712.73. 10%1056062. 41921. 73. 40%1154090. 41949. 13. 60%1254551.21839. 43. 40%表 III.點樣到96個硝化纖維素圓點_行的小鼠IgG的定量陣列分析
行比色強度標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)％153151. 52098.63. 9255924. 21843. 23. 3 t施徹丨3:白細胞』介素lO(IL-lO)禾口白細胞』介素4(IL_4)的蛋白在硝仆J千維素臘 (圓點)上的比餼ELISA檢測在硝化纖維素膜(圓點)上進行使用比色檢測的ELISA。按照實施例1制作載玻 片。1.捕獲抗體的初級點樣使用Calligrapher Arrayer (BioRad,Hercules, CA)將針對 IL-4 和 IL-10 的兩種 不同的捕獲抗體(EBi0Sciences，San Diego,CA)以一式四份進行點樣。將所有排列的抗體 以100 u g/mL點樣在如在實施例1中所制備的24個不同的硝化纖維素膜(圓點)的每一 個上。在IX磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中點樣抗體并且使載玻片在高濕度中干燥20分鐘。每 個硝化纖維素圓點用20iil的Pierce非蛋白質(zhì)封閉液(Pierce Biosciences, Rockford, IL)在濕度室中封閉1小時。然后將封閉緩沖液從表面吸出。2 抗原(細胞因子)的添加由5ng/mL(5，000pg/ml)原料的儲備溶液開始制備稀釋系列的IL-4和IL-10抗原 (EBiosciences，San Diego, CA)。將該原料以1 1的比率系列稀釋11次以給出在PBS中 稀釋的抗原的12個不同濃度。在載玻片上的蛋白質(zhì)濃度的代表物顯示于以下的表IV中。 表中的每個濃度表示在每個對應(yīng)的硝化纖維素膜(圓點)上的白細胞介素分析物的濃度。表 IV.在各個硝化纖維素膜(圓點)上的抗原的濃度。
將載玻片孵育在高濕度室中1小時并且通過浸沒到包含0. 05%吐溫20去污劑的 磷酸鹽緩沖鹽水(PBST緩沖液)中洗滌溶液和載玻片。用相同的洗滌溶液將載玻片洗滌4 次。3.檢測抗體、抗生物素蛋白_辣根過氧化物酶(HRP)和穩(wěn)定的TMB底物的添加將IL-4 和 IL-10 生物素?；目贵w(EBiosciencc, San Diego, CA)各自在 PBST 緩沖液中1 250稀釋。在室溫下于濕度室中將四毫升的稀釋液孵育在排列的載玻片上一 小時。用PBST洗滌載玻片4次，并且用去離子超純水洗滌3次。然后將載玻片在室溫下用 PBST 中 1 250 稀釋的 4mL 的抗生物素蛋白 _HRP(Pierce Bioscicnce, Rockford, IL)孵 育30分鐘。將載玻片再次用PBST(4次)和超純水(3次)洗滌，然后用覆蓋載玻片的足夠 的TMB穩(wěn)定的底物(Promega Corporation,Madison WI)進行孵育。TMB底物的HRP催化作 用在白色硝化纖維素膜(圓點)上產(chǎn)生了藍色/紫色沉淀。使催化作用持續(xù)5-120分鐘， 取決于測定中所需的靈敏度視覺上檢測顯色。當(dāng)背景開始顯色時，將載玻片用去離子水洗 滌幾次，并使其在無菌清潔罩中干燥。4.載玻片的文本和分析用2400dpi的高分辨率掃描儀(Epson America, Long Beach, CA)在16位灰度文件 中掃描干燥的載玻片。使用 Photoshop Elements (AdobeSystems Inc.，San Jose，CA)轉(zhuǎn)換 圖像并且保存為用另外“轉(zhuǎn)換的”標(biāo)記的TIFF文件。用GenePix Pro 6. 0軟件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)分析圖像并且用 Microsoft Excel 電子表格軟件(Microsoft Corporation, Redmond, WA)角軍釋。隨著抗原濃度的提高，信號強度也提高(圖5)。這表明抗原-抗體結(jié)合是特異性 的，并且與硝化纖維素結(jié)合的抗原處于適合于與適當(dāng)?shù)目贵w相互作用的活性構(gòu)象。還表明 夾心ELISA測定法能夠檢測皮克/毫升樣品的分析物。優(yōu)化可以產(chǎn)生每毫升檢測1-10皮 克分析物的測定法。實施例4 使用近紅外熒光染料來檢測硝化纖維素膜(圓點)上的蛋白質(zhì)。1.用于近紅外染料的方法對于每個硝化纖維素膜(圓點)，排列了 12種蛋白質(zhì)組合物(斑點)。組合物 (斑點)由代表兩種濃度每種以一式三份進行的小鼠IgG(EquiteCh-Bio，Kerrville TX) 的四種不同制備物組成(圖6)。用總蛋白質(zhì)濃度為lmg/mL的在大鼠IgG(Equitech-Bio, Kerrville TX)或牛酪蛋白(USB Corporation, Cleveland OH)中的 20%或 40%小鼠 IgG 點樣斑點。用非蛋白質(zhì)封閉液(Pierce Biochemicals,Rockford, IL)在室溫下封閉膜(圓點)一小時并且用來自 Rockland Immunochemical, Inc. (Gilbertsville, PA)的具有四 個稀釋度之一(1 500 ；1 1000 ； 1 2500;或 1 5000)的 700nm 和 800nm 近紅外染 料的兔抗小鼠IgG抗體進行孵育。用PBST緩沖液洗滌載玻片，進行干燥并使用Li-Cor IR Odyssey 掃描儀(Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE)在 700nm 和 800nm 同時掃描。在載玻 片上分布的詳細圖解和單個圓點示于圖6中。2.來自SOOnm高分辨率掃描的數(shù)據(jù)以高分辨率掃描一個載玻片的區(qū)域，該載玻片包括用1 500和1 1000稀釋的 SOOnm染料處理的硝化纖維素膜(圓點)。清楚地示出當(dāng)400 μ g/mL而不是200 μ g/mL的 小鼠IgG+過量大鼠IgG被點樣時信號增加，并且當(dāng)使用以1 500稀釋度而不是1 1000 稀釋度的SOOnm染料標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體時信號增加(圖7)。3.在低分辨率的700nm和800nm熒光掃描的比較通過分析整個硝化纖維素膜(圓點)而不是單個斑點或者分析每個膜上排列的蛋 白來比較700nm和SOOnm染料進行比較。進行這項操作是因為Li-Cor儀器太慢不能以最 高分辨率掃描大圖像。因此，選擇較低分辨率的器件并且比較硝化纖維素膜(圓點)的整 個熒光強度。通過測量與膜(圓點)相關(guān)的相對背景確定來自硝化纖維素膜(圓點)的背景。 留下八個膜(圓點)的行未處理并在以下列出熒光中值和這些值的平均值。在用SOOnm和 700nm熒光染料二者處理的相同的硝化纖維素膜(圓點)上完成測量。表V中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù) 示出膜(圓點)在800nm比在700nm具有低得多的背景。表 V在700nm和800nm的背景強度
硝化纖維素圓點tt在700nm的背景強度在800nm的背景強度14972352468329344018244261515422966436927457998493111平均值=455平均值=162
表VI中提供了在可比較的斑點上的小鼠IgG的檢測。如表VI中所述，背景對于 700nm掃描是455個強度單位而對于SOOnm掃描是162個強度單位。這些背景數(shù)字在以下 數(shù)字中被減去，但是它們的確指示膜(圓點)的強度完全超過具有1 500和1 1000稀 釋度的背景。表 VI700nM和800nM的紅外染料標(biāo)記的抗體的平均強度 實施例5硝化纖維素膜(圓點)的蛋白質(zhì)結(jié)合能力。1.將小鼠IgG排列(點樣)到白色硝化纖維素膜(圓點)上在磷酸鹽緩沖鹽水中將小鼠IgG(Equitech-Bio，Kerrville TX)稀釋成八個不同 的濃度。將每個濃度在三個不同的硝化纖維素膜(圓點)上點樣六次。將稀釋度以最低 濃度到最高濃度點樣(排列)并且在表VII中間隔地表示每個膜(圓點)。使載玻片在 高濕度中干燥10分鐘，然后將每個單獨的圓點用非蛋白質(zhì)封閉液(Pierce Biochemicals, Rockford, IL)在室溫下于濕度室中封閉一小時。在這一小時之后，將過量的封閉液吸出并 將圓點干燥。表 VII一式三份點樣的小鼠IgG的八個濃度 2.用抗小鼠IgG HRP抗體和TMB底物孵育將載玻片上的圓點用1 1000稀釋度的于PBST(0. 吐溫)中稀釋的抗小鼠IgG HRP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz CA)在高濕度中孵育一小時。然后將溶液吸 出并且用PBST將載玻片洗滌三次持續(xù)20分鐘，緊接著是用去離子水的4次洗滌(每次15 秒)。然后立即用TMB (PromegaCorporation，Madison WI)溶液孵育載玻片2分鐘，接著用 去離子漂洗幾次并且在無離子的罩中干燥。3.載玻片的掃描和圖像的操作用2400dpi的高分辨率掃描儀(Epson America, Long Beach, CA)在16位灰度文件 中掃描載玻片的正面和背面。使用 Photoshop Elements (Adobe Systems Inc. , San Jose, CA)轉(zhuǎn)換圖像并且保存為用另外“轉(zhuǎn)換的”標(biāo)記的TIFF文件。用GenePix Pro 6. 0軟件 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)分析載玻片圖像的正面并且用 Microsoft Excel 電 子表格軟件(Microsoft Corporation, Redmond, WA)解釋。硝化纖維素膜(圓點)的載量 描繪在圖8中。對于所有的三個重復(fù)來說，最大蛋白質(zhì)結(jié)合載量達到大約200yg/ml。被排 列的蛋白質(zhì)濃度的任何進一步提高都未產(chǎn)生任何提高的結(jié)合。這種結(jié)合載量(白色多孔硝 化纖維素斑點)示出比薄的光學(xué)上透明的硝化纖維素表面顯著更高的蛋白質(zhì)結(jié)合載量。實施例6 使用來自小鼠雜交瘤的上清液的比餼檢測在這個實施例中，用與蛋白質(zhì)軛合的小分子免疫小鼠以產(chǎn)生分泌單克隆抗體的雜 交瘤。在小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞之間的細胞融合之后，擴增細胞并進行亞克隆。使用比 色檢測篩選來自這些亞克隆細胞的上清液以識別與S-腺苷高半胱氨酸(SAH)結(jié)合但不與 SAM(S-腺苷甲硫氨酸)、載體蛋白或化學(xué)連接體結(jié)合的抗體。在這個抗原陣列中，使用Calligrapher Arrayer (BioRad，Hercules，CA)將七份蛋 白質(zhì)樣品排列在硝化纖維素膜(圓點)上的500μΜ的斑點中。使用辣根過氧化物酶標(biāo)記 的山羊抗小鼠抗體用比色測定法檢測排列的蛋白質(zhì)。1. SAM和SAH軛合物的點樣將七種不同抗原一式三份點樣在每個硝化纖維素膜(圓點)上，這七種抗原包括 SAM-Z-牛血清白蛋白(BSA)、SAH-Z-BSA, SAM-G-卵白蛋白、SAH-G-卵白蛋白、BSA、卵白蛋白和小鼠IgG(Equitech_Bio，KerrvilleTX)。Z和G表示在軛合反應(yīng)中使用的不同的化學(xué) 連接體。小鼠IgG被用作每個圓點的陽性對照并且應(yīng)當(dāng)直接結(jié)合山羊抗小鼠IgG堿性磷 酸酶。BSA軛合物以18ug/mL在pH 9. 0的IOOmM碳酸鹽緩沖液中點樣，卵白蛋白軛合物以 20ug/mL在水中點樣，并且小鼠IgG以10ug/mL在IOmMMOPS中點樣是5%海藻糖。使該陣 列在高濕度中干燥20分鐘并且用非蛋白質(zhì)封閉液(Pierce Biochemicals, Rockford，IL) 封閉1小時。將過量的封閉溶液吸出并且將該陣列過夜儲存在氣密容器中。2.小鼠雜交瘤上清液、山羊抗小鼠堿性磷酸酶軛合的抗體和BCIP/NBT的加入使用Biomek 2000移取平臺(Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)將十五微升的小鼠雜交瘤 細胞上清液移取到每個排列的硝化纖維素膜(圓點)上。將該載玻片在高濕度室中孵育1 小時。然后將該陣列用0. 05%吐溫20的PBST洗滌三次。然后將整個載玻片用在0. 05% 吐溫 20 的 PBST 的 lmg/mL 酪蛋白(USB Corporation, Cleveland OH)中稀釋的 1 4000 稀釋度的山羊抗小鼠堿性磷酸酶軛合的抗體(Sigma Chemical, St. Louis MO)孵育并將其 放置在振動器上一小時。再次用0. 05%吐溫20的PBST將其洗滌三次并且用水洗滌幾次。 然后將整個載玻片用BCIP/NBT底物(Sigma Chemical, St. Louis MO)孵育，通過用去離子 超純水水洗滌載玻片終止，并且在清潔的無菌罩中干燥。3.掃描并分析陣列用2400dpi的高分辨率掃描儀(Epson America, Long Beach, CA)在16位灰度文件 中掃描干燥的載玻片。使用 Photoshop Elements (AdobeSystems Inc.，San Jose, CA)轉(zhuǎn)換 圖像并且保存為用另外“轉(zhuǎn)換的”標(biāo)記的TIFF文件。用GenePix Pro 6. 1軟件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)分析圖像并且用 Microsoft Excel 電子表格軟件(Microsoft Corporation, Redmond, WA)解釋。數(shù)據(jù)被報告在圖9中，并且清晰地顯示硝化纖維素圓點 上的蛋白質(zhì)斑點可用來篩選在雜交瘤大批培養(yǎng)上清液中結(jié)合的抗體，所述培養(yǎng)上清液是具 有未知抗體身份和濃度的非常復(fù)雜的細胞碎片的混合物。正如所預(yù)期的那樣，所述抗體中 有一些識別希望的抗原(1G2G2和4H2H6)比卵白蛋白載體更強，而一些抗體(H2G3)似乎識 別卵白蛋白載體更強。^mm 7 -.mmumm^mmmM^f^.為了表明蛋白質(zhì)的小斑點能夠被排列在疏水表面上制備的硝化纖維素上，按照實 施例1在玻璃載玻片上制備了硝化纖維素的薄膜(圖10)。用點樣100 μ m斑點的Sonoplot Arrayer (Sonoplot, Middleton WI)PBS 巾白勺 100 μ g/mL /]、 IgG (Equitech-Bio, KLerrville TX)的重復(fù)斑點。將該載玻片用50ml的PBS中的10mg/mL BSA(Sigma Chemical, St. LouisMO)封閉一小時。用PBST將載玻片洗滌三次，然后用PBS中的以 DyLight647 (Pierce Biosciences, Rockford IL) t示i己白勺 1 μ g/mL lIj^^l/MI IgG 胃一 小時。使用 GenePix 4000B 掃描儀(Molecular Devices, Sunnyvale CA)以 635nm 的激發(fā) 掃描載玻片并且用配套GenePix Pro 6. 0軟件分析。分析四個不同行的八個斑點并且用 Excel Spreadsheet (Microsoft, Redwood WA)解釋數(shù)據(jù)并且報告在表 VIII 中。表 VIII在硝化纖維素表面的陣列的平均強度 8.在圓點(臘)卜.無框斑點的夾心ELISA進行比色夾心ELISA來確定無框硝化纖維素陣列的靈敏度(圖11)。將四種捕獲 抗體Nanog、0ct4、Sox2，和GAPDH各自以200 μ g/mL 一式三份點樣在膜上。將整個陣列用 Pierce非蛋白質(zhì)封閉液封閉lh，給出用0. 05%吐溫20的PBST的3x30_s漂洗和用超純水 的2x30-s漂洗，然后使其在無離子的罩中干燥。通過在高濕度室中將6 μ L的lOmg/mL的溶 于PBS的BSA在24個圓點上放置Ih給予兩行圓點額外的封閉。給予這些圓點用PBST的 3X30-S洗滌，用水漂洗并進行干燥。對來自大腸桿菌包涵體的再折疊的純化的Sox2蛋白 進行系列稀釋，起始于20ng/mL并且1 1稀釋10次用于11個稀釋度的蛋白質(zhì)和一個空 白。所有的溶液均在lmg/mL的溶于PBS的BSA中制備。將5 μ L的每個Sox2稀釋度在室 溫下于高濕度室中孵育lh?？焖傥鲞^量的Sox2并且整個層給出在PBST中的3X30-S的 浸沒。在lmg/mL的溶于PBS的BSA中1 1000稀釋之后，將5 μ L的生物素?；腟ox2檢 測抗體放置在每個圓點上，與Sox2蛋白一樣進行孵育并洗滌。然后，將在lmg/mL的BSA中 稀釋到1 μ g/mL的5 μ L的堿性磷酸酶抗生蛋白鏈菌素放置在每個圓點上并且在室溫下于 高濕度室中孵育30分鐘。給予該陣列在0. 05%吐溫20的PBST中的5xl-min洗滌并且用 超純水漂洗一次。然后用Moss BCIP/NBT Plus孵育該陣列直到可檢測出信號(約15min)， 因為在膜上確定夾心測定法靈敏度是這個實驗的主要目標(biāo)。這引起在Sox2的更高濃度形 成顯著背景。Sox2蛋白的檢出限是31. 6pg/mL，而定量的限度是40. 7pg/mL。實施例9 在無框陣列中的白餼和誘明的硝化纖維素膜上的液體樣品的穩(wěn)定件。為了表明在硝化纖維素膜的網(wǎng)格上的液體樣品的穩(wěn)定性和分離以及為了示出膜 間污染受阻，96個白色硝化纖維素膜用液體處理并進行分析。將六微升具有大約0. 01% FD&C 3號綠色染料(Fisher Scientific, Chicago, IL)的無蛋白質(zhì)封閉緩沖液(Tris)的 溶液移取到每個硝化纖維素膜上。將96個膜的陣列孵育在濕度室中2小時并且將其移出 用于分析。每個應(yīng)用的液體樣品均保留在適當(dāng)?shù)哪ど?。將整個陣列垂直旋轉(zhuǎn)并且拍照，示 出即使當(dāng)該陣列被轉(zhuǎn)向一邊時，液體樣品仍保留在適當(dāng)?shù)奈恢?圖12)。已進行具有各種不 同緩沖液、蛋白質(zhì)樣品、血清樣品和細胞提取物的額外實驗并且產(chǎn)生了相同的結(jié)果；硝化纖 維素膜保持液體樣品并且不允許膜間的樣品污染(數(shù)據(jù)未示出)。測驗了 3%透明硝化纖維素膜將液體樣品保持在無框陣列應(yīng)用的膜的周界之內(nèi)的能力。將包含大約0. 01% FD&C 3號綠色染料的小緩沖液樣品(約5-6 μ 1)放置在4毫米 直徑的透明膜上。垂直移去底物并進行拍照(圖13)。即使當(dāng)轉(zhuǎn)向側(cè)邊時，液體樣品仍保留 在原位。棚列10麵表面■丨丨。實施例9表明白色和透明的硝化纖維素組合物都能保持液體樣品在該硝化纖維 素膜的周界之內(nèi)。在這個實施例中，蛋白質(zhì)被排列在透明的硝化纖維素表面上并且對其進 行比色檢測。用Calligrapher針點樣器將十二種人類重組蛋白HNF4a、FoxAl、HNF6、Sox2、 Tubb4、KRT8、KRT18、0ct4、NeuroDl、HNFl、Nkx2. 2和小鼠IgG點樣在透明的硝化纖維素上。 每種蛋白的濃度在磷酸鹽緩沖鹽水中為大約1. Omg/ml。在點樣并干燥后，將該陣列用PBST 緩沖液中的1 1稀釋的NAP緩沖液封閉1小時。然后將該陣列在搖動的PBST緩沖液中 洗滌三次，每次10分鐘。將100 μ 1的PBST中的0. 5 μ g的抗FoxAl抗體加入到該陣列中 1小時。然后如之前所述對該陣列進行洗滌，并用軛合堿性磷酸酶的山羊抗小鼠IgG孵育1 小時，伴隨搖動。如以前那樣用PBST洗滌該陣列，用20mM的磷酸鹽緩沖液pH 7. 4簡短漂 洗兩次。然后用MOSS堿性磷酸酶底物孵育陣列直到黑色斑點可見(大約15分鐘)。使用 Epson V700掃描儀掃描圖像。圖14是掃描的表示，它描繪了結(jié)果?？笷oxA2抗體產(chǎn)生了非 常強的比色信號，而另一種人類蛋白靶未被檢出。陽性對照小鼠IgG也給出了非常強的信 號。該陣列包含十二種重組蛋白，但是僅FoxA2被抗FoxA2抗體檢出。這項實驗清楚地表 明透明的硝化纖維素組合物保持樣品在周界之內(nèi)并且是陣列適合的膜。此外，這項實驗表 明陣列能夠包括許多的分析物并且仍產(chǎn)生高通量形式的特異的和靈敏的結(jié)果。盡管已通過前述說明書以大量細節(jié)描述本發(fā)明，這種細節(jié)是出于舉例說明的目的 并且不應(yīng)當(dāng)被解釋為對以下所附權(quán)利要求書的限制。所有引用的報告、參考文獻、美國專 利、已授權(quán)的美國專利申請和美國專利申請公布文本均通過引用并入本文。
權(quán)利要求
一種用于產(chǎn)生無框陣列的方法，該方法包括將至少兩個分開的膜與基質(zhì)相偶聯(lián)，其中所述膜包括含有硝化纖維素的組合物，并且此外其中所述組合物被配制以保持應(yīng)用的樣品在該膜上；并且將分析物與所述膜相偶聯(lián)以產(chǎn)生無框陣列。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基質(zhì)選自由以下組成的組玻璃、聚酯、聚乙烯 和聚丙烯。
3.如權(quán)利要求1所述方法，其中所述硝化纖維素選自由以下組成的組不透明的、半透 明的和透明的。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物包含乙酸纖維素和溶劑。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述制品包含選自由以下組成的組的溶劑丙酮、乙 醇、乙酸戊酯和丁醇。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述制品包含溶劑混合物，所述溶劑混合物包含丙 酮、乙醇和丁醇。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分開的膜被對準(zhǔn)在網(wǎng)格中，所述網(wǎng)格選自由以 下組成的組8X12網(wǎng)格、16X24網(wǎng)格和32X48網(wǎng)格。
8.如權(quán)利要求1所述方法，其中每個分開的膜具有約28平方毫米的面積。
9.如權(quán)利要求1所述方法，其中每個分開的膜具有約7平方毫米的面積。
10.如權(quán)利要求1所述方法，其中每個分開的膜具有約1平方毫米的面積。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述膜的頂部是所述無框陣列上的最高點。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分析物選自由以下組成的組探針、RNA、DNA、 肽、蛋白質(zhì)的片段、抗體和蛋白質(zhì)。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物被配制以保持應(yīng)用的液體在所述膜 的周界之內(nèi)持續(xù)一段時間，所述時間選自由以下組成的組0. 1-0.5,0.51-1.0,1. 1-2.0、 2.1-4.0,4. 1-6. 0,6. 1-8,8. 1-10,10. 1-12,12. 1-16,16. 1-20,20. 1-24,24. 1-30,30. 1-36, 36. 1-48,48. 1-54,54. 1-60,60. 1-72,72. 1-96 和 96. 1-120 小時。
14.一種無框陣列，所述無框陣列包括(a)與基質(zhì)相偶聯(lián)的至少兩個分開的膜，其中 所述膜包括含有硝化纖維素的組合物，并且此外其中所述組合物被配制以保持應(yīng)用的液體 在所述膜的周界之內(nèi)和(b)與所述膜相偶聯(lián)的分析物。
15.如權(quán)利要求14所述的陣列，其中所述基質(zhì)選自由以下組成的組玻璃、聚酯、聚乙 烯和聚丙烯。
16.如權(quán)利要求14所述的陣列，其中所述硝化纖維素選自由以下組成的組不透明的、 半透明的和透明的。
17.如權(quán)利要求14所述的陣列，其中所述組合物包含乙酸纖維素。
18.如權(quán)利要求17所述的陣列，其中所述組合物還包含選自由以下組成的組的溶劑 丙酮、乙醇、乙酸戊酯和丁醇。
19.如權(quán)利要求14所述的陣列，其中所述分開的膜被對準(zhǔn)在網(wǎng)格中，所述網(wǎng)格選自由 以下組成的組8X12網(wǎng)格、16X24網(wǎng)格和32X48網(wǎng)格。
20.如權(quán)利要求14所述陣列，其中每個分開的膜具有選自由以下組成的組的面積約1 平方毫米、7平方毫米和28平方毫米。
21.如權(quán)利要求14所述的陣列，其中所述膜的頂部是所述無框陣列上的最高點。
22.如權(quán)利要求14所述的陣列，其中所述組合物被配制以保持應(yīng)用的液體在所述膜 的周界之內(nèi)持續(xù)一段時間，所述時間選自由以下組成的組0. 1-0.5,0.51-1.0,1. 1-2.0、 2. 1-4. 0,4. 1-6. 0,6. 1-8,8. 1-10,10. 1-12,12. 1-16,16. 1-20,20. 1-24,24. 1-30,30. 1-36, 36. 1-48,48. 1-54,54. 1-60,60. 1-72,72. 1-96 和 96. 1-120 小時。
23.如權(quán)利要求14所述的陣列，其中所述分析物選自由以下組成的組探針、RNA、DNA、 肽、提取物、蛋白質(zhì)的片段、抗體和蛋白質(zhì)。
24.如權(quán)利要求14所述的陣列，其中在所述分開的膜上的每種相偶聯(lián)的分析物具有選 自由以下組成的組的個體區(qū)域直徑為400微米、150微米、75微米和40微米。
25.如權(quán)利要求14所述的陣列，其中所述陣列包括選自由以下組成的組的數(shù)目的分開 的膜:12、16、24、96、384 和 1536。
26.一種用于檢測分子相互作用的方法，所述方法包括(a)將樣品應(yīng)用于一種陣列，所述陣列包括與基質(zhì)相偶聯(lián)的至少兩個分開的膜，其中所 述膜包括含有硝化纖維素的組合物和與所述膜相偶聯(lián)的分析物，并且此外其中所述組合物 被配制以保持應(yīng)用的液體在所述膜的周界之內(nèi)；并且(b)檢測分子相互作用。
27.如權(quán)利要求26所述方法，其中所述樣品選自由以下組成的組細胞、組織、細胞提 取物、血液、血清、血漿、唾液、尿、糞便物、身體滲出液、精液、RNA、DNA、肽、蛋白質(zhì)的片段和 蛋白質(zhì)。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述樣品被保持在所述膜的周界之內(nèi)持續(xù)一段時 間，所述時間選自由以下組成的組1、2、3、4、5、6-11、12-23、24-35、36-47和48-60小時。
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其中檢測分子相互作用包括將所述陣列孵育在具有大 于65%相對濕度的室中。
30.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述檢測選自由以下組成的組比色、熒光、近紅 外熒光、銀沉積、化學(xué)發(fā)光、ELISA和電化學(xué)發(fā)光。
31.一種用于產(chǎn)生陣列的方法，所述方法包括將至少兩個分開的膜分配給基質(zhì)，其中 所述膜包括含有硝化纖維素的組合物，其中所述組合物被配制以保持應(yīng)用的液體在所述膜 的周界之內(nèi)；并且將分析物與所述膜相偶聯(lián)。
32.一種用于產(chǎn)生陣列的方法，所述方法包括將至少兩個分開的膜分配給基質(zhì)，其中 所述膜包括含有硝化纖維素的組合物。
33.一種無框陣列，所述無框陣列包括(a)基質(zhì)；(b)涂覆在所述基質(zhì)上的疏水層；以 及(c)應(yīng)用于以所述疏水層涂覆的基質(zhì)區(qū)域的膜，其中所述膜包括含有硝化纖維素的組合 物，并且此外其中所述組合物被配制以保持樣品在所述膜的周界之內(nèi)。
34.如權(quán)利要求33所述的陣列，其中所述疏水層包括選自由以下組成的組的物質(zhì)甲 基和辛基的衍生物、反應(yīng)性環(huán)氧化物和環(huán)氧粘合劑。
35.如權(quán)利要求33所述的陣列，其中所述組合物包括硝化纖維素與乙酸纖維素的制 品。
36.如權(quán)利要求33所述的陣列，此外其中分析物與所述親水性膜相偶聯(lián)。
37.如權(quán)利要求36所述的陣列，其中所述分析物選自由以下組成的組探針、RNA、DNA、肽、提取物、蛋白質(zhì)的片段、抗體和蛋白質(zhì)。
38.如權(quán)利要求33所述的陣列，其中所述疏水層和所述親水性膜是透明的。
39.如權(quán)利要求33所述的陣列，其中所述硝化纖維素是透明的。
40.一種產(chǎn)生無框陣列的方法，所述方法包括將至少兩個分開的膜與基質(zhì)相偶聯(lián)，其中所述膜包括含有硝化纖維素的組合物，并且 此外其中所述組合物被配制以使應(yīng)用的液體覆蓋整個分開的膜并保持所述應(yīng)用的液體在 所述膜的周界之內(nèi)；并且將分析物與所述膜相偶聯(lián)來產(chǎn)生無框陣列。
41.一種試劑盒，所述試劑盒包括無框陣列，其中所述陣列包含至少兩個分開的膜； 用于進行分子的分子檢測的試劑和使用所述陣列和所述試劑的說明書。
42.一種試劑盒，所述試劑盒包括無框陣列，其中所述陣列包含至少兩個分開的膜并且 此外其中所述膜用分析物進行排列；用于進行所述分子的分子檢測的試劑和使用所述陣列 和所述試劑的說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在陣列中定量檢測分子的新穎方法。具體而言，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生無框陣列的方法和裝置。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含硝化纖維素的組合物，所述組合物對產(chǎn)生無框陣列是有用的。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測分子相互作用的方法。又在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及對于實施本發(fā)明的方法和裝置有用的試劑盒。本發(fā)明提供了用于高通量分析分子相互作用和定量檢測的改進的方法和裝置。
文檔編號G01N33/53GK101883865SQ200880116388
公開日2010年11月10日 申請日期2008年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月18日
發(fā)明者威廉·L·帕特森, 托拜厄斯·C·祖茨, 托馬斯·J·伯克 申請人:普里莫里根生物科技有限責(zé)任公司