專利名稱：同時(shí)測定魚肉中復(fù)方磺胺甲噁唑及代謝物的液相色譜法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磺胺類抗菌藥的測定方法；具體的說是采用高效液相色譜法同時(shí)測定魚肉中磺胺甲噁唑(SMZ)、乙?；x產(chǎn)物(乙酰化磺胺甲噁唑，NSMZ)和甲氧芐啶(TMP)的方法。
背景技術(shù)：
磺胺甲噁唑(又稱新諾明)是水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治上廣泛使用的藥物，通常與磺胺增效劑甲氧芐啶配伍使用；磺胺甲噁唑在魚體內(nèi)的代謝除了原形藥物磺胺甲噁唑以外，乙?；前芳讎f唑是其主要代謝產(chǎn)物，在體內(nèi)殘留時(shí)間較長。因此，研究磺胺類藥物在水產(chǎn)品中殘留時(shí)，檢測其乙酰化代謝產(chǎn)物和增效劑的含量是非常必要的。目前，有關(guān)磺胺甲噁唑等磺胺類藥物的檢測多使用高效液相色譜法，相關(guān)報(bào)道如下(1)、制藥行業(yè)的相關(guān)報(bào)道袁枚等(2005、廣州惠華動(dòng)物保健品有限公司)報(bào)道用反相高效液相色譜法同時(shí)測定復(fù)方新諾明水溶性粉中的磺胺甲噁唑和甲氧芐啶；池玉梅等(2001、南京中醫(yī)藥大學(xué))報(bào)道高效液相色譜法同時(shí)測定復(fù)方新諾明注射液中磺胺甲噁唑和甲氧芐啶的含量。以上方法樣品前處理較簡單，不涉及從組織中提取藥物的樣品前處理過程，方法不適合藥物在水產(chǎn)品中的含量檢測。
(2)、醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道崔艷莉等(2003、廣西獸藥監(jiān)察所)報(bào)道高效液相色譜法同時(shí)測定豬血漿中的磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑和甲氧芐啶；丁晨光等(1997、解放軍大連醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)報(bào)道高效液相色譜法測定人血漿中的磺胺甲噁唑和甲氧芐啶。水產(chǎn)動(dòng)物不同于哺乳動(dòng)物，在蛋白組分和脂肪含量上存在較大差異，樣品基質(zhì)不同會(huì)影響分析方法的回收率和干擾檢測。
(3)、水產(chǎn)領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道徐維海等(2004、中國科學(xué)院海洋研究所)報(bào)道了水產(chǎn)品中包括磺胺甲噁唑在內(nèi)的14種磺胺類藥物殘留的高效液相色譜法；郭根和等(2005、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)報(bào)道高效液相色譜法測定對蝦中五種磺胺類藥物殘留；林海丹等(2003、廣州出入境檢驗(yàn)檢疫局)報(bào)道動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留的固相萃取高效液相色譜測定法；鄭宗林等(2005、上海水產(chǎn)大學(xué))報(bào)道中華絨螯蟹血淋巴內(nèi)磺胺甲噁唑的測定；劉長征等(2004、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所)報(bào)道水產(chǎn)品中磺胺甲噁唑和甲氧芐啶含量的高效液相色譜法測定。這些相關(guān)的報(bào)道大多僅涉及磺胺類藥物本身的檢測，沒有涉及增效劑甲氧芐啶和乙?；x產(chǎn)物三者的同時(shí)檢測，所采用的樣品前處理方法也與本發(fā)明不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種同時(shí)測定魚肉中磺胺甲噁唑、乙?；前芳讎f唑和甲氧芐啶的高效液相色譜方法，具有靈敏、準(zhǔn)確、可靠的特點(diǎn)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下它的技術(shù)方法包括樣品制備、樣品前處理、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、流動(dòng)相配制及色譜條件A、樣品制備采集魚的肌肉組織樣品，用剪刀初步剪碎，用高速均質(zhì)器均質(zhì)，冷凍保存。
B、樣品前處理樣品解凍后，準(zhǔn)確稱取魚肉組織，加入0.3mol/L鹽酸，靜置1小時(shí)，加入無水硫酸鈉，后加入二氯甲烷/丙酮混合液(3∶1比例)，4℃冰箱靜置8-12小時(shí)后，用高速均質(zhì)器均質(zhì)，再用二氯甲烷-丙酮混合液清洗均質(zhì)器的刀頭(均質(zhì))，合并2次的提取液，充分振蕩，離心(4000-6000r/min離心5-10min)，取出全部上清液，剩余殘?jiān)偌尤攵燃淄?丙酮提取，充分振蕩，離心(4000-6000r/min離心5-10min)，取上清液與第一次提取液合并，提取液在33-35℃下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，加入正己烷充分震蕩，靜置一段時(shí)間，棄去正己烷，下層液用微孔濾膜(0.22μm或0.45μm)過濾后進(jìn)高效液相色譜儀測定。
C、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取200mg磺胺甲噁唑、200mg乙?；前芳讎f唑和200mg甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品一起溶于100mL流動(dòng)相中，配成同時(shí)含有三種藥物的母液(200μg/mL)，于冰箱中4℃保存，臨用前再依次稀釋成系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
D、流動(dòng)相配制及色譜條件取乙腈、重蒸水、冰醋酸按20∶80∶0.5(v/v/v)的比例配制流動(dòng)相，超聲波脫氣30min后備用。
所用色譜條件a、色譜柱選用規(guī)格為4.6mm×250mm C18ODS柱；b、柱溫25-30℃；c、流速0.8-1.0mL/min；進(jìn)樣量10-20μL；d、紫外檢測波長272nm；e、流動(dòng)相為水∶乙腈∶冰醋酸＝80∶20∶0.5。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明方法能夠同時(shí)檢測魚肉中的磺胺甲噁唑、乙酰化磺胺甲噁唑和甲氧芐啶，可節(jié)省大量的人力、物力和時(shí)間，降低了檢測成本。
2、加入鹽酸有助于藥物從魚肌肉組織蛋白上解離，提高回收率；二氯甲烷-丙酮作為提取液，對三種藥物均有較好的提取效果，同時(shí)浸出雜質(zhì)少且易排除基質(zhì)干擾；濃縮溫度低于35℃，滿足磺胺類藥物耐熱性差的特點(diǎn)；加入二氯甲烷/丙酮后冰箱放置8-12小時(shí)不僅能夠充分提取肌肉組織中的藥物，而且使蛋白質(zhì)變性充分，減少提取過程的損失，提取效果理想。
3、本方法中，磺胺甲噁唑、甲氧芐啶及乙?；前芳讎f唑藥物峰與雜峰能較好分離，最低檢測限可達(dá)0.005、0.01、0.005mg/kg，準(zhǔn)確度和精密度高。


圖1魚肉空白樣品的液相色譜2加入磺胺甲噁唑、乙?；前芳讎f唑和甲氧芐啶標(biāo)樣的魚肉空白樣品的液相色譜圖1-甲氧芐啶；2-磺胺甲噁唑；3-乙?；前芳讎f唑具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容它的技術(shù)方法包括樣品制備、樣品前處理、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、流動(dòng)相配制及色譜條件
A、樣品制備采集魚的肌肉組織樣品，用剪刀初步剪碎，用高速均質(zhì)器均質(zhì)，放入塑料離心管中，密封冷凍保存。
B、樣品前處理取15支15ml塑料離心管，分別加入解凍后的空白肌肉組織1g，放入塑料離心管中，加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液(0.5、2.0、10.0、50.0、200.0μg/mL)各0.1mL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，使三種藥物在1g肌肉組織中的濃度分別達(dá)到0.05、0.20、1.00、5.00、20.00μg/g，充分混合，靜置4小時(shí)，加入0.3mol/L鹽酸0.2mL，靜置1小時(shí)，加入0.5g無水硫酸鈉，加入3mL二氯甲烷/丙酮(3∶1比例)混合液，密封離心管，4℃冰箱靜置8小時(shí)后，用高速均質(zhì)器均質(zhì)10s(16000r/min)，再用3mL二氯甲烷/丙酮提取液清洗均質(zhì)器刀頭，合并2次的提取液，振蕩1min，靜置5min后，5000r/min離心10min，取出全部上清液，放入15mL玻璃離心管中，剩余殘?jiān)尤?mL二氯甲烷/丙酮再次提取，振蕩1min，靜置5min后，5000r/min離心10min，取上清液與第一次提取液合并，在35℃下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?mL流動(dòng)相溶解，加入1mL的正己烷，漩渦混合1min，靜置10min，棄去正己烷，下層液用0.22μm微孔濾膜過濾后進(jìn)高效液相色譜儀測定。
C、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取200mg磺胺甲噁唑、200mg乙?；前芳讎f唑和200mg甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品一起溶于100mL流動(dòng)相中，配成同時(shí)含有三種藥物的母液(200μg/mL)，于冰箱中4℃保存，臨用前依次稀釋成50.00、20.00、10.00、5.00、1.00、0.50、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
D、流動(dòng)相配制及色譜條件取乙腈、重蒸水、冰醋酸按20∶80∶0.5(v/v/v)的比例配制流動(dòng)相，超聲波脫氣30min。
色譜條件4.6mm×250mm C18ODS柱；柱溫25℃；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL；紫外檢測波長272nm；流動(dòng)相為水∶乙腈∶冰醋酸＝80∶20∶0.5。
本發(fā)明方法對魚的肌肉組織在0.05、0.20、1.00、5.00、20.00μg/mL5個(gè)濃度梯度的回收率試驗(yàn)。結(jié)果表明，經(jīng)過本試驗(yàn)的前處理步驟，空白樣品和添加藥物樣品的色譜圖均未出現(xiàn)明顯的雜質(zhì)峰(圖1-2)，樣品分離良好，肌肉中SMZ、TMP、NSMZ 5個(gè)濃度水平的添加回收率范圍在82.12-90.87％、79.64-88.67％、78.21-86.08％(表1)。以上5個(gè)濃度的樣品于1d內(nèi)分別重復(fù)進(jìn)樣5次和分5d測定，以此衡量定量方法的精密度(表2)，試驗(yàn)中三種藥物在5個(gè)不同濃度水平下平行樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在1.44-3.13％、2.01-4.23％、1.09-4.56％，符合磺胺甲噁唑、甲氧芐啶及乙酰化磺胺甲噁唑殘留分析的要求。
表1SMZ、TMP及NSMZ在魚肌肉組織中的回收率

表2SMZ、TMP及NSMZ在魚肌肉組織中的日內(nèi)及日間精密度

本方法在0.01-20mg/kg濃度范圍內(nèi)，SMZ、TMP、NSMZ在魚肌肉組織中線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均可達(dá)0.9999；該方法以引起2-3倍信噪比(S/N)定義為最低檢測限，SMZ、TMP、NSMZ的最低檢測限分別為0.005、0.01、0.005mg/kg，完全符合磺胺甲噁唑、甲氧芐啶及乙酰化磺胺甲噁唑殘留分析的要求。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)測定魚肉中復(fù)方磺胺甲噁唑及代謝物的液相色譜法，其特征在于它的技術(shù)方法，包括樣品制備、樣品前處理、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、流動(dòng)相配制及測定所用色譜條件；A、樣品制備采集魚的肌肉組織樣品，用剪刀初步剪碎，用高速均質(zhì)器均質(zhì)，冷凍保存；B、樣品前處理稱取解凍魚肉組織，加入鹽酸，靜置，加入無水硫酸鈉后，加入二氯甲烷/丙酮混合液，4℃條件下靜置一段時(shí)間后，用高速均質(zhì)器均質(zhì)，用二氯甲烷/丙酮混合液清洗均質(zhì)器的刀頭，提取液經(jīng)充分振蕩后離心，殘?jiān)枚燃淄?丙酮提取液再次提取，合并2次提取液并用氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)昧鲃?dòng)相溶解，加入正己烷去脂肪，下層液用微孔濾膜過濾后進(jìn)高效液相色譜儀測定；所述的樣品前處理，加入鹽酸的濃度為0.3mol/L；加入鹽酸的比例為0.2mL/g肌肉；加入鹽酸后的靜置時(shí)間為1小時(shí)；加入的提取液為3∶1比例混合的二氯甲烷/丙酮混合液；4℃冰箱靜置的時(shí)間為8-12小時(shí)后；C、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取200mg磺胺甲噁唑、200mg乙?；前芳讎f唑和200mg甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品一起溶于100mL流動(dòng)相中，配成同時(shí)含有濃度為200μg/mL三種藥物的母液，于冰箱中4℃保存，臨用前再依次稀釋成系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液；D、流動(dòng)相配制取乙腈、重蒸水、冰醋酸按20∶80∶0.5的比例配制流動(dòng)相，超聲波脫氣30min后備用；E、測定所用色譜條件色譜柱選用規(guī)格為4.6mm×250mm C18ODS柱；柱溫25-30℃；流速0.8-1.0mL/min；進(jìn)樣量10-20μL；紫外檢測波長272nm；流動(dòng)相為水∶乙腈∶冰醋酸＝80∶20∶0.5。
全文摘要
一種同時(shí)測定魚肉中復(fù)方磺胺甲噁唑及代謝物的液相色譜法。以鹽酸、3∶1比例的二氯甲烷/丙酮混合液作為提取劑，可將殘留在魚肉組織中的磺胺甲噁唑、乙?；前芳讎f唑和甲氧芐啶充分提取出，提取的雜質(zhì)少，可省略凈化的過程；加入提取液后，在4℃冰箱靜置一段時(shí)間，能夠使蛋白質(zhì)變性充分，從而減少提取時(shí)因蛋白黏附在高速均質(zhì)器上所造成的損失，提高了回收率；將提取的有機(jī)溶劑用氮?dú)獯蹈?、過濾后即可進(jìn)高效液相色譜儀測定。本發(fā)明方法操作簡便、快速、檢測成本低、靈敏度高，可用在科研單位和進(jìn)出口商品檢測部門進(jìn)行魚肉中復(fù)方磺胺甲噁唑及代謝物含量的測定。
文檔編號G01N30/06GK1908654SQ20061006852
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月18日
發(fā)明者王群, 李健, 劉淇, 何玉英 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所